專利名稱：：奶牛飼料用復(fù)合微生物添加劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種微生物制劑，具體地說(shuō)是一種奶牛用微生物制劑及其制備方法，屬于微生物領(lǐng)域。技術(shù)背景乳酸菌是一類以分解糖類產(chǎn)生乳酸的菌的總稱、此類制劑應(yīng)用最早、最廣泛，種類繁多。通常為厭氧或者兼性氧生長(zhǎng)，缺點(diǎn)是不耐高溫，經(jīng)8(TC處理5min，損失70%80%。在顆粒飼料制備過(guò)程中損失率較大。但耐酸，在pH值為3.04.5時(shí)仍可生長(zhǎng)，對(duì)胃中的酸性環(huán)境有一定的耐受性。在動(dòng)物體內(nèi)通過(guò)生物拮抗、降低pH值阻止和抑制致病菌的侵入和定植，降解亞硝氨、氨、fJ引哚、糞臭素等有害物質(zhì)，維持腸道中正常的生態(tài)平衡。活菌體內(nèi)和代謝產(chǎn)物中含有較高的超氧化物歧化酶(SOD),能增強(qiáng)動(dòng)物的體液免疫和細(xì)胞免疫。也能夠產(chǎn)生氨基酸、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等消化酶。乳酸菌在動(dòng)物腸道的定植具有特異性。研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌在在哺乳和斷乳期動(dòng)物中使用能夠防治腹瀉，維持腸道正常生態(tài)平衡。目前，主要應(yīng)用的乳酸菌主要是來(lái)源于乳酸桿菌屬、乳酸鏈球菌屬和雙歧桿菌屬的近30種的微生物。飼用酵的種類豐富，主要有熱帶假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、啤酒酵母、紅色酵母等。飼用酵母對(duì)動(dòng)物體的作用分為以下幾點(diǎn)l)促生長(zhǎng)特性..酵母細(xì)胞富含蛋白質(zhì)、核酸、維生素和多種酶。具有提供養(yǎng)分、增加飼料適口性，加強(qiáng)消化吸收等功能，并可提高動(dòng)物飼料的利用率。由于酵母豐富的營(yíng)養(yǎng)組成，因此詞用酵母可以部分或者全部替代飼料中的魚(yú)粉；2)改善腸道微生態(tài)環(huán)境。酵母菌是腸道有益微生物，研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加酵母可促進(jìn)瘤胃微生物的生長(zhǎng)和活性，使厭氧菌總數(shù)上升、纖維素發(fā)酵菌數(shù)量明顯上升；3)促進(jìn)動(dòng)物體免疫功能.增強(qiáng)抗病力。酵母細(xì)胞壁的主要成分是甘露聚糖、葡聚糖，研究發(fā)現(xiàn)甘露聚糖可增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的活性。在火雞口糧中添加甘露聚糖可使血清中IgG和肝臟的lgA濃度提高25%;4)可直接和腸道病原體結(jié)合，中和腸道中毒素。酵母中的甘露聚糖可以和腸道病原菌的纖毛結(jié)合，阻止病原菌在腸道粘膜中的定植。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)甘露聚糖可以降低畜禽動(dòng)物糞便中沙門氏菌、大腸桿菌的含量。芽抱桿菌是一類好氧菌，在一定條件下產(chǎn)生芽孢，和常用的乳酸菌等益生菌相比，芽孢桿菌具有以下優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)l)具有耐高溫、耐酸堿、耐壓等特點(diǎn)，能夠耐受顆粘飼科加工的影響；2)在貯藏過(guò)程以孢子形式存在，不消耗飼料的營(yíng)養(yǎng)成分，可以保持飼料的質(zhì)量3)進(jìn)入腸道后，在腸道上部迅速?gòu)?fù)活.復(fù)活率接近100%;4)芽孢桿菌能夠產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多種氨基酸；5)芽孢桿菌可以消耗大量的氧，維持腸道厭氧環(huán)境，抑制致病菌的生長(zhǎng)，維持腸道正常生態(tài)平衡；6)具有平衡和穩(wěn)定乳酸桿菌的作用。目前使用的菌株有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、蠟樣芽包桿菌(Bacilluscereus)、東洋芽孢桿菌(Bacillustoyol)等。目前，微生態(tài)制劑在推廣應(yīng)用方面的主要問(wèn)題是產(chǎn)品加工處理后穩(wěn)定性差，細(xì)菌易失活，功效降低。其原因除了和產(chǎn)品的質(zhì)量有關(guān)外，還應(yīng)考慮該產(chǎn)品是否能平衡腸道的生態(tài)系統(tǒng)?，F(xiàn)有微生物制劑多針對(duì)禽畜類，如雞、豬等，其種群腸道菌群的生成是長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果?，F(xiàn)有微生物飼料添加劑并沒(méi)有專門針對(duì)奶牛的，由于一種適于某類動(dòng)物的活菌制劑不一定適于另一類動(dòng)物，因此，禽畜類微生物添加劑對(duì)奶牛詞養(yǎng)并不能起到理想的效用。目前針對(duì)奶牛的微生物添加劑大部分為單一微生物添加劑，雖然對(duì)于奶牛的消化系統(tǒng)和吸收有一定益處，但是功效單一，效果不理想。目前急需一種可以增強(qiáng)奶牛胃腸功能，同時(shí)可以保證詞料用微生物添加劑穩(wěn)定性，提高奶牛產(chǎn)奶量和奶質(zhì)的奶牛飼料用微生物添加劑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物生產(chǎn)詞喂飼料中采用復(fù)合微生物添加劑比單一微生物添加劑具有更好的作用效果，原因在于復(fù)合微生物制劑具有協(xié)同作用，不同微生物在動(dòng)物胃腸道的作用機(jī)理不同，能起到互補(bǔ)長(zhǎng)短，互相促進(jìn)的作用，其應(yīng)用效果比單一菌劑更顯著，更穩(wěn)定高產(chǎn)，絕對(duì)適用于奶牛應(yīng)用。本發(fā)明的目的在于提供一種能夠有效提高奶牛產(chǎn)奶量，對(duì)奶成分中的乳脂率和乳蛋白等成分有顯著提高的奶牛飼料用微生物添加劑。本發(fā)明的另一目的在于提供一種上述奶牛飼料用微生物添加劑的制備方法。本發(fā)明用于制備納豆枯草芽孢桿菌的菌種為枯草芽孢桿菌(^"7/w^6"&)，其保藏編號(hào)為CGMCCNo.2420，分離自納豆；屎腸球菌菌種為屎腸球菌(￡wteracoccus/flec/Mm)，其保藏編號(hào)為CGMCCNo.2419;所述釀酒酵母菌菌種為釀酒酵母菌(Sacc/^ramycMce^v/Wae)，其保藏編號(hào)為CGMCCNo.2418。上述三株菌種均已于2008年3月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下具體技術(shù)方案一種奶牛飼料用復(fù)合微生物添加劑，其中，該微生物添加劑含有納豆枯草芽孢桿菌、屎腸球菌和釀酒酵母菌的發(fā)酵產(chǎn)物的混合物。上述的一種奶牛詞料用復(fù)合微生物添加劑，其中，所述微生物添加劑還含有載體，所述載體為豆粕、玉米粉和紅薯淀粉中的一種或幾種，優(yōu)選豆粕，高壓熟化為佳。上述發(fā)酵產(chǎn)物混合物為含有納豆枯草芽孢桿菌活菌的發(fā)酵菌液、含有屎腸球菌活菌的發(fā)酵菌液和含有釀酒酵母菌活菌的發(fā)酵菌液的混合菌液，各發(fā)酵菌液之間的體積比為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>上述混合菌液與載體的體積重量(v/w)比為0.24，最佳比例為l:1。上述納豆枯草芽孢桿菌、屎腸球菌和釀酒酵母菌的發(fā)酵菌液菌液濃度分別為>109cell/mL、〉108cell/mL和〉l()9cell/mL。上述復(fù)合微生物添加劑中細(xì)菌總數(shù)為109cfu/g以上，所述復(fù)合微生物制劑為混合發(fā)酵菌液和載體按比例配制后的成品。一種上述奶牛詞料用復(fù)合微生物添加劑的制備方法，其具體制備步驟如下(1)發(fā)酵菌液的制備納豆菌液的制備從PDA斜面培養(yǎng)基上取兩環(huán)活化納豆枯草芽孢桿菌菌種，接入裝有30mL種子培養(yǎng)基的100mL錐形瓶，30°C、180r/min培養(yǎng)24h;所述種子培養(yǎng)基成分蔗糖1%，大豆蛋白胨1%,NaC10.5%，Na2HP040.6%，NaH2P040.1%,CaCl20.02%，MgSO40.05%，pH值調(diào)至7;取2%(v/v)種子液加入裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的100mL錐形瓶中，37°C、180r/min培養(yǎng)24h，所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分葡萄糖1%，蔗糖1%，大豆蛋白胨6%，胰蛋白胨4%，Na2HP040.6%,NaH2P040.1%，CaCl20.02%，MgSO40.05%，pH值調(diào)至7;培養(yǎng)后的發(fā)酵菌液稀釋后進(jìn)行顯微鏡血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；菌液濃度MO、ell/mL，置于4。C保存?zhèn)溆?；PM斜面培養(yǎng)基成分葡萄糖2%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，瓊脂1.52.0%。屎腸球菌菌液的制備從MRS瓊脂培養(yǎng)基中取兩環(huán)活化屎腸球菌菌種，接種入裝有30mLMRS液體培養(yǎng)基的100mL錐形瓶，37°C、厭氧培養(yǎng)24h制得種子液，取2%(V/V)種子液加入裝有30mLMRS液體培養(yǎng)基的100mL錐形瓶，37°C、厭氧培養(yǎng)24h制得屎腸球菌發(fā)酵菌液；該發(fā)酵液稀釋后進(jìn)行顯微鏡血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，菌液濃度M()Scell/mL，置于4"C保存?zhèn)溆茫籑RS瓊脂培養(yǎng)基成分蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，K2HP042g，乙酸鈉5g，MgS040.2g，MnS040.05g，吐溫-801g，檸檬酸二銨2g，瓊脂20g，pH6.26.4，121。C滅菌15min。釀酒酵母菌菌液的制備從YPD瓊脂培養(yǎng)基中取兩環(huán)活化釀酒酵母菌菌種，接種入裝有30mLYPD液體培養(yǎng)基的100mL錐形瓶，37"C培養(yǎng)24h制得種子液，取2。/。(V/V)種子液加入裝有30mLYPD液體培養(yǎng)基的100mL錐形瓶，37°C培養(yǎng)24h制得屎腸球菌發(fā)酵菌液，該發(fā)酵菌液稀釋后進(jìn)行顯微鏡血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，菌液濃度〉10、ell/mL，置于4'C保存?zhèn)溆?；YPD瓊脂培養(yǎng)基成分葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，瓊脂1520g，水1000mL，pH自然，121。C滅菌，15min。(2)將上述制備的納豆枯草芽孢桿菌、屎腸球菌和釀酒酵母菌的發(fā)酵菌液按體積比為0.51.5:12:12的比例，最佳為l:1:l的比例混合均勻制成混合菌液。上述的一種奶牛飼料用復(fù)合微生物添加劑的制備方法，其還包括下述步驟(3)高壓滅菌熟化載體，12rC，30min;(4)以比例為0,24(v/w)，最佳為l:l(v/w)的比例將步驟(2)制備的混合菌液添加到熟化后的載體中混合均勻。上述的一種奶牛飼料用復(fù)合微生物添加劑的制備方法，其中，步驟(1)中所述納豆枯草芽孢桿菌菌種可為商業(yè)購(gòu)買菌種，最佳為枯草芽孢桿菌(5ac///^^"/&)，其保藏編號(hào)為CGMCCNo.2420，分離自納豆；所述屎腸球菌菌種可為商業(yè)購(gòu)買菌種，最佳為屎腸球菌(￡"feracoccas/aec&m)，其保藏編號(hào)為CGMCCNo.2419;所述釀酒酵母菌菌種可為商業(yè)購(gòu)買菌種，最佳為釀酒酵母菌(&cc/2a/-ow_yce>scereWi7'ae)，其保藏編號(hào)為CGMCCNo.2418。上述的一種奶牛飼料用復(fù)合微生物添加劑的制備方法，其中，所述載體為豆粕、玉米粉和紅薯淀粉中的一種或幾種。經(jīng)上述方法制備得出的奶牛飼料用微生物添加劑中的細(xì)菌總數(shù)為109cfu/g以上。上述奶牛伺用微生物添加劑的使用方法為按照奶牛日糧的0.05%0.1%(wt%)添加飼喂，每天詞喂1次。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)"發(fā)酵菌液"、"活菌"、"發(fā)酵產(chǎn)物"具有本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知且承認(rèn)的含義。所述發(fā)酵菌液是通過(guò)適合的環(huán)境培養(yǎng)本發(fā)明所述的納豆枯草芽孢桿菌、屎腸球菌和釀酒酵母菌，使其生長(zhǎng)至一定細(xì)菌濃度獲得的。所述活菌是指通過(guò)生物法培養(yǎng)納豆枯草芽孢桿菌、屎腸球菌和釀酒酵母菌得到的具有生活9能力的菌體。所述發(fā)酵產(chǎn)物為微生物經(jīng)一定環(huán)境發(fā)酵后所得的菌體、酶及其代謝產(chǎn)物。只要按照本發(fā)明公開(kāi)的制備方法的具體步驟制備各發(fā)酵菌液，并保證最終菌液中活菌濃度即可以達(dá)到本發(fā)明所述有益效果，并無(wú)任何隨機(jī)性，所述各菌種均可通過(guò)購(gòu)買獲得，使用本發(fā)明保藏菌種效果更佳。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與效益本發(fā)明所述的復(fù)合微生物制劑，其活性成分是納豆枯草芽孢桿菌、屎腸球菌和釀酒酵母菌，三種微生物產(chǎn)生協(xié)同作用，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期反復(fù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，在奶牛飼料中添加本發(fā)明所述的復(fù)合微生物添加劑后可以顯著提高飼喂奶牛的產(chǎn)奶量。在對(duì)飼喂奶牛牛奶乳品質(zhì)指標(biāo)的觀察中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加本發(fā)明所述復(fù)合微生物添加劑后，飼喂奶牛產(chǎn)奶中乳脂率有顯著提高，乳蛋白產(chǎn)量也顯著增高。此外，飼喂奶牛飼料中添加本發(fā)明復(fù)合微生物添加劑后，奶牛泌乳期體細(xì)胞數(shù)明顯下降。體細(xì)胞數(shù)是乳房健康程度的指示，乳中體細(xì)胞增多是機(jī)體的一種抵御反應(yīng)，乳房的感染越嚴(yán)重，體細(xì)胞數(shù)也就越高。因此，本發(fā)明奶牛飼料用復(fù)合微生物添加劑可以使奶?；既榉垦缀碗[形乳房炎的發(fā)病幾率減少，奶牛機(jī)體的自身免疫能力明顯增強(qiáng)。同時(shí)，奶牛日糧中添加本發(fā)明所述復(fù)合微生物添加劑后，可以有效地提高機(jī)體谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(S0D)的含量，對(duì)清除機(jī)體脂類氫過(guò)氧化物、有機(jī)氫過(guò)氧化物、H202，協(xié)同維生素E保護(hù)細(xì)胞免受脂質(zhì)過(guò)氧化損害有一定的作用，脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)顯著降低。具體實(shí)施方式實(shí)施例l一、材料及來(lái)源1、納豆枯草芽孢桿菌菌種為保藏編號(hào)為CGMCCNo.2420的枯草芽孢桿菌(5fld〃z^S由他)；2、屎腸球菌菌種為保藏編號(hào)為CGMCCNo.2419的屎腸球菌(五"&racoco^/aec/wm);3、釀酒酵母菌菌種為保藏編號(hào)為CGMCCNo.2418的釀酒酵母菌(Sacc/^ramyc^4、豆粕來(lái)源中畜陽(yáng)光飼料公司。二、奶牛飼料用復(fù)合微生物添加劑的制備(1)發(fā)酵菌液的制備納豆枯草芽孢桿菌菌液的制備從PDA斜面培養(yǎng)基上取兩環(huán)活化納豆枯草芽孢桿菌菌種，其保藏編號(hào)為CGMCCNo.2420，接人裝有30mL種子培養(yǎng)基(蔗糖1%，大豆蛋白胨1%，NaC10.5%，Na2HP040.6%，NaH2P040.1%，CaCl20.02%，MgS040.05%，pH值調(diào)至7)的100mL錐形瓶，30°C、180r/min培養(yǎng)24h。取2%(v/v)種子液加入裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖1%，蔗糖1%，大豆蛋白胨6%，胰蛋白胨4%，Na2HP040.6%，NaH2P040.1%，CaCl20.02%，MgSO40.05%，pH值調(diào)至7)的100mL錐形瓶中，37°C、180r/min培養(yǎng)24h。稀釋一定倍數(shù)后進(jìn)行顯微鏡血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。菌液濃度>109'mL"，置于4。C保存?zhèn)溆?。PDA斜面培養(yǎng)基成分葡萄糖2%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，瓊脂1.52.0%。屎腸球菌菌液的制備從MRS瓊脂培養(yǎng)基中取兩環(huán)活化屎腸球菌菌種其保藏編號(hào)為CGMCCNo.2419，接種入裝有30mLMRS液體培養(yǎng)基的100mL錐形瓶，37°C、厭氧培養(yǎng)24h制得種子液，取2%(V/V)種子液加入裝有30mLMRS液體培養(yǎng)基的100mL錐形瓶，37°C、厭氧培養(yǎng)24h制得屎腸球菌發(fā)酵菌液，即為試驗(yàn)用菌液。該發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù)后進(jìn)行顯微鏡血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，菌液濃度>108.mL"，置于4。C保存?zhèn)溆?。MRS瓊脂培養(yǎng)基成分蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，K2HP042g，乙酸鈉5g，MgS040.2g，MnS040.05g，吐溫-801g，檸檬酸二銨2g，瓊脂20g。pH6.26.4，121。C滅菌15min。釀酒酵母菌菌液的制備從YPD瓊脂培養(yǎng)基中取兩環(huán)活化釀酒酵母菌菌種其保藏編號(hào)為CGMCCNo.2418，接種入裝有30mLYPD液體培養(yǎng)基的100mL錐形瓶，37'C培養(yǎng)24h制得種子液，取2y。(V/V)種子液加入裝有30mLYPD液體培養(yǎng)基的100mL錐形瓶，37'C培養(yǎng)24h制得屎腸球菌發(fā)酵菌液，即為試驗(yàn)用菌液。該發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù)后進(jìn)行顯微鏡血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，菌液濃度稀釋>109,mL"，置于4'C保存?zhèn)溆?。YPD瓊脂培養(yǎng)基成分葡萄糖20g，蛋白胨10g,酵母膏5g，瓊脂1520g,水1000mL，pH自然，121。C滅菌，15min。(2)納豆枯草芽孢桿菌、屎腸球菌和釀酒酵母菌的發(fā)酵菌液按體積比為1:1:1的比例混合均勻制成混合菌液。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在0.51.5:12:12的比例范圍內(nèi)配制混合菌液均可達(dá)到上述有益效果，實(shí)施例僅給出最佳配比，其他值不一一贅述。(3)高壓滅菌熟化載體，如豆粕、玉米粉或紅薯淀粉，12rC，30min。(4)以l:l(v/w)的比例將所述混合菌液添加到豆粕載體中混合均勻，65°〇烘烤16h,即制備出奶牛飼料用微生物添加劑。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)混合菌液和豆粕載體的體積重量比在0.24范圍內(nèi)均有很好的效果，最佳實(shí)施例僅給出最佳配比，其他配比不一一贅述。經(jīng)上述方法制備得出的奶牛飼料用微生物添加劑中的細(xì)菌總數(shù)為109cfu/g以上。三、奶牛飼料用復(fù)合微生物添加劑在奶牛飼喂中的應(yīng)用1、奶牛來(lái)源北京安定棚諷奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)選擇奶牛胎次14胎次、泌乳階段為泌乳前期和中期、產(chǎn)奶量2030kg、體重平均值為550kg泌乳奶牛70頭。2、分組將上述奶牛隨機(jī)分成5組，分別為試驗(yàn)I、試驗(yàn)II、試驗(yàn)III、試驗(yàn)IV和對(duì)照組。3、飼喂方式試驗(yàn)?zāi)膛Ｃ刻旆謩e詞喂精粗比l:l混合日糧20kg，日糧組成見(jiàn)表1，早晚兩次詞喂，自由飲水。試驗(yàn)I、試驗(yàn)II、試驗(yàn)III和試驗(yàn)IV組中分別添加有本發(fā)明實(shí)施例制備的奶牛飼料用復(fù)合微生物添加劑10g、20g、30g和40g，占飼喂日糧干物質(zhì)的O.05%、0.1%、0.15%和2%，一次飼喂。試驗(yàn)周期為67天。所應(yīng)用的基礎(chǔ)日糧成分及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。表1基礎(chǔ)日糧的組成及其營(yíng)養(yǎng)水平<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注1.每千克維生素預(yù)混料所提供成分維生素A200KIU，維生素D35000IU，維生素B310000mg。2.每千克微量元素預(yù)混料所提供成分銅(Cu)1600mg，鐵(Fe)2500mg，鋅(Zn)8000mg，錳(Mn)2500mg，碘(I)100mg，硒(Se)20mg。3、觀察內(nèi)容試驗(yàn)?zāi)膛５哪坍a(chǎn)量、乳品質(zhì)指標(biāo)、奶牛泌乳期體細(xì)胞數(shù)和血液指標(biāo)。5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析-(1)復(fù)合微生物制劑對(duì)奶牛產(chǎn)奶量的影響見(jiàn)表2在本試驗(yàn)中，由表2可以看出，與對(duì)照組相比，給早期泌乳奶牛飼喂不同水平的復(fù)合微生物制劑后，試驗(yàn)I、II產(chǎn)奶量明顯提高，差異顯著(P〈0.05)，試驗(yàn)III(25.49kg)、試驗(yàn)IV(25.84kg)與對(duì)照組(24.19kg)相比，分別提高了5.37%、6.28%,但差異不顯著(P〉0.05)，試驗(yàn)組之間差異不顯著(P>0.05)。飼喂復(fù)合微生物制劑的奶牛4%校正乳產(chǎn)量與對(duì)照組相比分別提高了16.56%(試驗(yàn)I)、11.39%(試驗(yàn)n)、11.30%(試驗(yàn)m)、18.31%(試驗(yàn)IV)，差異顯著(P<0.05)，試驗(yàn)IV與對(duì)照比差異極顯著(P〈0.01)，但試驗(yàn)組各處里之間無(wú)差異顯著性。表2復(fù)合微生物添加劑劑對(duì)奶牛產(chǎn)奶量、乳成分的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注同行肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P〉0.05)，相鄰字母表示差異顯著(P〈0.05)，相間字母表示差異極顯著(P<0.01)。(2)奶牛飼料用復(fù)合微生物添加劑對(duì)奶成分的影響見(jiàn)表2從上述表2可以看出，在早期泌乳奶牛日糧中添加復(fù)合微生物制劑對(duì)牛奶中乳脂率均有不同程度的提高，試驗(yàn)I、II、III與對(duì)照組相比雖有一定的提高，但差異不顯著(P〉0.05)，試驗(yàn)IV提高最為明顯(19.34%)，顯著高于對(duì)照組(p〈o.o5);對(duì)乳脂產(chǎn)量而言，與對(duì)照組相比試驗(yàn)i、n、m均有提高，差異顯著(P<0.05)，試驗(yàn)IV最為明顯(P<0.01)，但試驗(yàn)組之間無(wú)差異顯著性。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，牛乳中乳蛋白含量相對(duì)比較穩(wěn)定，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比有很小幅度的下降，差異不顯著(P〉0.05)，但試驗(yàn)組乳蛋白產(chǎn)量均高于對(duì)照組，試驗(yàn)I、II最為明顯，差異顯著(P<0.05)，試驗(yàn)組處理之間差異不顯著(P>0.05)。在整個(gè)試驗(yàn)期，牛乳中乳糖含量也相對(duì)比較穩(wěn)定，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組分別提高了0.09、0.01、0.08、0.09個(gè)百分點(diǎn)，差異不顯著(P〉0.05)。乳中總固形物除試驗(yàn)m組低于對(duì)照組外，其余各組均高于對(duì)照組，但各處理組之間差異都不顯著(P〉0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，在早期泌乳奶牛日糧中添加復(fù)合微生物制劑可提高乳脂率，對(duì)乳脂產(chǎn)量和乳蛋白產(chǎn)量的提高也有明顯的作用。(3)奶牛詞料用復(fù)合微生物添加劑對(duì)奶牛泌乳期體細(xì)胞數(shù)的影響見(jiàn)表2由上述表2可知，與對(duì)照組相比試驗(yàn)組牛乳中體細(xì)胞數(shù)(SCC)明顯下降，差異顯著(P<0.05)，但試驗(yàn)組處理之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。體細(xì)胞數(shù)是乳房健康程度的指示，乳中體細(xì)胞增多是機(jī)體的一種抵御反應(yīng)，乳房的感染越嚴(yán)重，體細(xì)胞數(shù)也就越高。詞喂復(fù)合微生物制劑對(duì)奶牛泌乳期體細(xì)胞的降低有明顯的作用。體細(xì)胞數(shù)降低，奶?；既榉垦缀碗[形乳房炎的發(fā)病幾率減少，且奶牛機(jī)體的自身免疫能力明顯增強(qiáng)。(4)添加復(fù)合微生物制劑對(duì)血液生化指標(biāo)的影響見(jiàn)表3表3復(fù)合微生物添加劑對(duì)奶牛血液生化指標(biāo)的影響試驗(yàn)處理P項(xiàng)目試驗(yàn)I試驗(yàn)II試驗(yàn)III試驗(yàn)IV對(duì)照組SEMtrtdaytrt氺day超氧化物歧化酶(U/mL)70.88ab71.54ab75.72ab76.Ola67.88c2,030.0420.27190.9851谷胱甘肽過(guò)氧化物酶129.64125.17123.91124.57118.153.150.20110.00040.9613(咖ol/U丙二醛(醒ol/ml)9,18a9.12a8.25a8.13a10,97b0.560.0350.37850.6667注同行肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P〉0.05)，相鄰字母表示差異顯著(P〈0.05)，相間字母表示差異極顯著(P〈0.01)。由表3可以看出，奶牛日糧中添加不同水平復(fù)合微生物制劑引起血液中超氧化物歧化酶(SOD)含量的變化，試驗(yàn)I、II血液中SOD的含量與對(duì)照組相比分別提高了4.42%、5.39%，差異不顯著(P〉0.05)，試驗(yàn)III與對(duì)照組相比提高了ll.55%，差異顯著(P<0.05)，試驗(yàn)IV提高了11.98X，差異極顯著(P〈0.01)。試驗(yàn)組比對(duì)照組血液中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)含量分別提高了9.72%、5.94%、4.88%、5.43%，差異不顯著(P>0.05)。血液中丙二醛(MDA)的含量隨著復(fù)合微生物制劑添加量的增加呈遞減趨勢(shì)，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。血液中SOD、GSH-Px、MDA的含量在試驗(yàn)組各處理之間均無(wú)差異顯著性。結(jié)果表明，飼喂復(fù)合微生物制劑，可以有效地提高機(jī)體谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量，對(duì)清除機(jī)體脂類氫過(guò)氧化物、有機(jī)氫過(guò)氧化物、H202，協(xié)同維生素E保護(hù)細(xì)胞免受脂質(zhì)過(guò)氧化損害有一定的作用，脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)顯著降低。16本發(fā)明奶牛飼料用復(fù)合微生物添加劑與單一微生物添加劑效果比較復(fù)合微生物制劑由多種菌復(fù)合配制而成，能適應(yīng)多種條件和宿主，具有促進(jìn)生長(zhǎng)、提高飼料轉(zhuǎn)化率、調(diào)整正常菌群平衡、提高免疫力等多種功效。相對(duì)于單一微生物添加劑而言，復(fù)合微生物制劑對(duì)奶牛生產(chǎn)性能的促進(jìn)作用效果更佳。據(jù)劉飛等(2006)報(bào)道，飼喂添加乳酸茵的玉米青貯詞料對(duì)奶牛的產(chǎn)奶量沒(méi)有顯著影響，雖然牛乳中蛋白質(zhì)和非脂乳固體的含量有小幅提高，而對(duì)乳脂肪的含量沒(méi)有影響。Wallace等(1993)綜合18個(gè)研究結(jié)果后報(bào)道，飼喂酵母培養(yǎng)物平均產(chǎn)奶量提高7.8%;本領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員在泌乳牛日糧中添加酵母菌培養(yǎng)物，產(chǎn)奶量平均提高7.8%。從瑞士進(jìn)口的"環(huán)保樂(lè)"Biogreen，每克含活菌約2X109(乳桿菌7X107g、枯草桿菌7X107g、鏈球菌6X107g)。實(shí)驗(yàn)人員用上述環(huán)保樂(lè)制劑，通過(guò)對(duì)泌乳前期60頭奶牛詞喂50天的試驗(yàn)，結(jié)果表明，試驗(yàn)組比對(duì)照組每頭奶牛增奶量為1.76%,而乳脂率沒(méi)有下降反而略有升高。本發(fā)明產(chǎn)品在奶牛上的實(shí)際應(yīng)用效果顯示，本發(fā)明復(fù)合微生物添加劑可顯著提高標(biāo)準(zhǔn)奶量最高達(dá)18.31%，提高乳脂率最高達(dá)19.34%，在提高奶量和乳脂率的同時(shí)可降低奶牛的體細(xì)胞數(shù)，證明了本發(fā)明奶牛飼料用復(fù)合微生物添加劑比較現(xiàn)有單一制劑的應(yīng)用效果更為顯著，并不是簡(jiǎn)單的疊加的效果，且明顯優(yōu)于現(xiàn)有復(fù)合微生物添加劑。權(quán)利要求1、一種奶牛飼料用復(fù)合微生物添加劑，其特征在于，該微生物添加劑含有納豆枯草芽孢桿菌、屎腸球菌和釀酒酵母菌的發(fā)酵產(chǎn)物混合物，細(xì)菌總數(shù)為109cfu/g以上。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種奶牛詞料用復(fù)合微生物添加劑，其特征在于，所述微生物添加劑還含有載體，所述載體為豆粕、玉米粉和紅薯淀粉中的一種或幾種。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種奶牛詞料用復(fù)合微生物添加劑，其特征在于，所述載體為豆粕。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種奶牛飼料用復(fù)合微生物添加劑，其特征在于，所述發(fā)酵產(chǎn)物混合物為含有納豆枯草芽孢桿菌活菌的發(fā)酵菌液、含有屎腸球菌活菌的發(fā)酵菌液和含有釀酒酵母菌活菌的發(fā)酵菌液的混合菌液，各發(fā)酵菌液之間的體積比為O.51.5:12:12。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種奶牛飼料用復(fù)合微生物添加劑，其特征在于，所述混合菌液與載體的體積重量比為0.24。6、根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種奶牛飼料用復(fù)合微生物添加劑，其特征在于，所述納豆枯草芽孢桿菌、屎腸球菌和釀酒酵母菌的發(fā)酵菌液菌液濃度分別為>109cell/mL、〉108cell/mL禾口〉109cell/mL。7、一種奶牛飼料用復(fù)合微生物添加劑的制備方法，其特征在于，其制備步驟如下(1)發(fā)酵菌液的制備納豆枯草芽孢桿菌菌液的制備從PDA斜面培養(yǎng)基上取兩環(huán)活化納豆枯草芽孢桿菌菌種，接入裝有30mL種子培養(yǎng)基的100mL錐形瓶，30°C、180r/min培養(yǎng)24h;所述種子培養(yǎng)基成分蔗糖1%，大豆蛋白胨1%，NaC10.5%，Na2HP040.6%，NaH2P040.1%，CaCl20.02%，MgSO40.05%，pH值調(diào)至7;取2。/ov/v種子液加入裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的100mL錐形瓶中，37°C、180r/min培養(yǎng)24h，所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分葡萄糖1%，蔗糖1%，大豆蛋白胨6%，胰蛋白胨4%，Na2HP040.6%，NaH2P040.1%,CaCl20.02%，MgSO40.05%，pH值調(diào)至7;培養(yǎng)后的發(fā)酵菌液稀釋至菌液濃度>10<9>cell/niL，置于4t:保存?zhèn)溆?；屎腸球菌菌液的制備從MRS瓊脂培養(yǎng)基中取兩環(huán)活化屎腸球菌菌種，接種入裝有30mLMRS液體培養(yǎng)基的100mL錐形瓶，37°C、厭氧培養(yǎng)24h制得種子液，取2%V/V種子液加入裝有30mLMRS液體培養(yǎng)基的100mL錐形瓶，37°C、厭氧培養(yǎng)24h制得屎腸球菌發(fā)酵菌液；該發(fā)酵液稀釋至菌液濃度>108cell/mL，置于4t:保存?zhèn)溆茫会劸平湍妇旱闹苽鋸腨PD瓊脂培養(yǎng)基中取兩環(huán)活化釀酒酵母菌菌種，接種入裝有30mLYPD液體培養(yǎng)基的100mL錐形瓶，37"C培養(yǎng)24h制得種子液，取2%V/V種子液加入裝有30mLYPD液體培養(yǎng)基的100mL錐形瓶，37°C培養(yǎng)24h制得屎腸球菌發(fā)酵菌液，該發(fā)酵菌液稀釋至菌液濃度MO、ell/mL，置于4"C保存?zhèn)溆茫?2)將上述制備的納豆枯草芽孢桿菌、屎腸球菌和釀酒酵母菌的發(fā)酵菌液按體積比為0.51.5:12:12的比例混合均勻制成混合菌液。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種奶牛飼料用復(fù)合微生物添加劑的制備方法，其特征在于，還包括下述步驟(3)高壓滅菌熟化載體，12rC，30min;(4)以l:lv/w的比例將步驟(2)制備的混合菌液添加到熟化后的載體中混合均勻。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種奶牛飼料用復(fù)合微生物添加劑的制備方法，其特征在于，所述載體為豆粕、玉米粉和紅薯淀粉中的一種或幾種。10、根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種奶牛詞料用復(fù)合微生物添加劑的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述納豆枯草芽孢桿菌菌種為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，其保藏編號(hào)為CGMCCNo.2420，分離自納豆；所述屎腸球菌菌種為屎腸球菌(^^racoccM/"ec/wm)，其保藏編號(hào)為CGMCCNo.2419;所述釀酒酵母菌菌種為釀酒酵母菌(Sacc/zaramyc^cereWw'fle),其保藏編號(hào)為CGMCCNo.2418。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種奶牛飼料用復(fù)合微生物添加劑，該微生物添加劑含有納豆枯草芽孢桿菌、屎腸球菌和釀酒酵母菌的發(fā)酵產(chǎn)物混合物，細(xì)菌總數(shù)為10⁹cfu/g以上。本發(fā)明所述的復(fù)合微生物制劑，三種微生物產(chǎn)生協(xié)同作用，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期反復(fù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，可以顯著提高飼喂奶牛的產(chǎn)奶量，且產(chǎn)奶中乳脂率有顯著提高，乳蛋白產(chǎn)量也顯著增高，奶牛泌乳期體細(xì)胞數(shù)明顯下降，可以使奶牛患乳房炎和隱形乳房炎的發(fā)病幾率減少，奶牛機(jī)體的自身免疫能力明顯增強(qiáng)。本發(fā)明成本低廉，效果顯著，具有很好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。文檔編號(hào)A23K1/00GK101253934SQ20081010348公開(kāi)日2008年9月3日申請(qǐng)日期2008年4月7日優(yōu)先權(quán)日2008年4月7日發(fā)明者卜登攀,周凌云,王加啟,鄧露芳,魏宏陽(yáng)申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所