專利名稱：：蜜橘成年樹營(yíng)養(yǎng)器官離體叢生芽培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物生物技術(shù)，尤其涉及一種蜜橘成年樹營(yíng)養(yǎng)器官離體叢生芽培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：柑橘居世界百果生產(chǎn)之首，其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，色香味兼優(yōu)，既可鮮食，又可加工果汁制品。南豐蜜橘是柑橘類寬皮橘中著名的優(yōu)良品種。南豐蜜橘源出乳桔,又是乳桔中的精品，最突出特點(diǎn)在于皮薄金黃、酸甜適口、香氣濃郁、汁多核少，譽(yù)為"橘中之王"馳名中外，它是我國(guó)特有的優(yōu)良柑橘栽培品種。蜜橘成年樹莖器官離體腋芽叢生培養(yǎng)對(duì)快速繁殖優(yōu)質(zhì)種苗和種質(zhì)離體保存具有重要作用，它能較好地保持品種的遺傳穩(wěn)定性。我國(guó)利用組織培養(yǎng)進(jìn)行柑橘快速繁殖的研究工作較廣泛，上世紀(jì)七十年代王大元報(bào)道后至今，有不少文獻(xiàn)報(bào)告了柑橘科屬的多種植物離體不定芽或叢芽的產(chǎn)生，但選用的外植體幾乎大都是未渡越童期的組織，很少見成年態(tài)營(yíng)養(yǎng)體組織培養(yǎng)再生芽的報(bào)道。原因有兩點(diǎn)一是成年結(jié)果柑橘樹的枝莖外植體表面滅菌困難；二是成年態(tài)柑橘營(yíng)養(yǎng)器官組織離體再分化難。而柑橘成年態(tài)莖段離體培養(yǎng)是柑橘優(yōu)良品系工廠化育苗及其種質(zhì)離體保存等的重要技術(shù)平臺(tái)，必須首先建立有效的離體培養(yǎng)再生體系。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種蜜橘成年樹營(yíng)養(yǎng)器官離體叢生芽培養(yǎng)方法，同時(shí)提供相應(yīng)的培養(yǎng)基質(zhì)。本發(fā)明方法包括以下步驟(1.1)選擇健壯無病蟲害蜜橘結(jié)過果實(shí)的成年優(yōu)株，取當(dāng)年抽生20天以內(nèi)的新枝為外植體；(1.2)對(duì)外植體清洗消毒；(1.3)外植體接種在培養(yǎng)基上培養(yǎng)至腋芽生長(zhǎng)點(diǎn)開始萌動(dòng)，并在芽的基部四周出現(xiàn)黃綠色小凸點(diǎn)，繼續(xù)在腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1215天，此時(shí)主腋芽伸長(zhǎng)迅速；(1.4)培養(yǎng)3040天時(shí)，將長(zhǎng)出的腋芽從外植體(母枝)上分割下來，接種到芽增殖培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢芽分化，培養(yǎng)3040天，平均每個(gè)培養(yǎng)物分化出叢生芽46個(gè)，芽長(zhǎng)23cm;(1.5)分割繼代，小芽成塊繼代培養(yǎng)，大芽切割成頂芽和莖節(jié)，接種到增殖培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，以后每3040天轉(zhuǎn)代一次，繁殖系數(shù)46;建成叢芽無性繁殖體系，繁殖的2cm以上芽可進(jìn)行嫁接育苗，小苗作離體種質(zhì)保存或繼代擴(kuò)本發(fā)明方法所用的培養(yǎng)基如下(1)改良MS培養(yǎng)基，改良MS含以下改良的有機(jī)成分甘氨酸2.0mg/L，VBi1.02.0mg/L，VB61.02.Omg/L，煙酸O.51.Omg/L，肌醇100mg/L，葉酸O.l1.0mg/L，蔗糖4055g/L，其它成分不變。(2)腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基MS+6-BAO.10.6mg/L+Kt0.10.6mg/L+NAAO.010.1mg/L。(3)芽增殖培養(yǎng)基改良MS+6-BA0.20.5mg/L+KtO.040.4mg/L+ZtO.20,5mg/L+NAAO.010.05mg/L。本發(fā)明的培養(yǎng)條件如下(1)培養(yǎng)參數(shù)恒溫24±2°C，相對(duì)濕度60%70%，光照強(qiáng)度為100016000讓，日照時(shí)長(zhǎng)1114小時(shí)/天。(2)技術(shù)參數(shù)外植體污染率低于5%10%;腋芽萌動(dòng)誘導(dǎo)率75%87%;芽叢生增殖系數(shù)46;繼代周期3040天。本發(fā)明方法中對(duì)外植體清洗消毒過程中對(duì)外植體清洗消毒過程中先用偏酸性牙膏溶液浸洗殺菌，再用堿性洗衣粉液浸洗殺菌；最后用75%的乙醇溶液和0.1%0.5Q/。HgCl2溶液消毒。本發(fā)明的培養(yǎng)方法及基質(zhì)配方為蜜橘成年態(tài)莖節(jié)腋芽離體再生提供必需的環(huán)境條件。用本發(fā)明的方法進(jìn)行南豐蜜橘的離體培養(yǎng)，可獲得大量的再生芽。利用這樣的柑橘離體再生芽既可作種質(zhì)保存材料，又可切取lcm的莖端進(jìn)行試管嫁接培育大批量?jī)?yōu)質(zhì)種苗。這對(duì)南豐蜜橘以及柑橘類優(yōu)良種質(zhì)的離體繁殖或種質(zhì)離體保存均具有廣泛的實(shí)用價(jià)值。圖1為本發(fā)明南豐蜜橘成年態(tài)莖節(jié)腋芽萌動(dòng)誘導(dǎo)圖2為本發(fā)明芽叢生增殖培養(yǎng)圖。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例h(一)、選擇健壯無病蟲害南豐蜜橘成年優(yōu)株果樹，取當(dāng)年抽生20d(天)以內(nèi)的成年態(tài)莖抽生新枝，(二)、用自來水洗去灰塵，再用偏酸性商品牙膏適量溶于水，浸泡嫩枝條610min，再用軟毛筆刷洗枝葉后，自來水漂洗干凈；再用堿性洗衣粉液浸洗610min，自來水細(xì)流水中漂洗干凈，修整老葉枝后用蒸餾水沖洗13次，濾紙吸干水滴后裝入無菌容器中進(jìn)行表面滅菌處理；轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)上，先以75%的乙醇溶液浸泡20305，無菌水沖洗24次，再O.1%0.59fflgCl2浸泡柑橘新枝610min，傾去藥液后，用無菌水沖洗56次。然后在無菌條件下，將柑橘新枝切成長(zhǎng)度為0.5lcm左右的小段(帶莖節(jié))，接種到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。(三)、培養(yǎng)至腋芽生長(zhǎng)點(diǎn)開始萌動(dòng)，并在芽的基部四周出現(xiàn)黃綠色小凸點(diǎn)，繼續(xù)在腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1215天，此時(shí)主腋芽伸長(zhǎng)迅速，接種后培養(yǎng)3040天時(shí)，將長(zhǎng)出的腋芽從外植體(母枝)上分割下來，又接種到芽增殖培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢芽分化，培養(yǎng)3040天，平均每個(gè)培養(yǎng)物分化出叢生芽46個(gè)，芽長(zhǎng)23cm;(四)、分割繼代，小芽成塊繼代培養(yǎng)，大芽切割成頂芽和莖節(jié)，接種到增殖培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，以后每3040天轉(zhuǎn)代一次，繁殖系數(shù)46;建成叢芽無性繁殖體系，繁殖的2cm以上芽可進(jìn)行嫁接育苗，小苗作離體種質(zhì)保存或繼代擴(kuò)繁。(五)培養(yǎng)條件1.培養(yǎng)基配方對(duì)培養(yǎng)基中的大量元素、微量元素、有機(jī)成分、植物激素、糖類等各個(gè)組成成分進(jìn)行多次正交設(shè)計(jì)及梯度試驗(yàn)基礎(chǔ)上得到。本發(fā)明基本培養(yǎng)基為改良MS:大量元素、鐵鹽、微量元素三者與MS培養(yǎng)基中相同；有機(jī)成分(改良)用量為甘氨酸2.0/L，VBi1.02.0mg/L，VB61.02.0mg/L，煙酸0.51.0mg/L，肌醇100mg/L，葉酸0.11.0mg/L;蔗糖改為4055g/L。(1)腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基MS(或改良MS)+6-BA0.10.6mg/L(單位下同)+Kt0.10.6+NAA0.010.1;(2)芽增殖培養(yǎng)基改良MS+6-BA0.20.5+Kt0.040.4+Zt0.20.5+NAA0.010.1;以上培養(yǎng)基的pH值5.86.0、瓊脂粉0.6%0.62。/。，并在118120。C高溫高壓下滅菌25min。2.培養(yǎng)環(huán)境提供培養(yǎng)環(huán)境恒溫(24±2)°。，相對(duì)濕度60%70%，光照強(qiáng)度為1000翻lx，日照時(shí)長(zhǎng)1114h(小時(shí))/d(天)實(shí)施例2:選擇健壯無病蟲害蜜橘成年優(yōu)株果樹，取當(dāng)年抽生20d(天)以內(nèi)的成年態(tài)莖抽生新枝，對(duì)外植體清洗消毒時(shí)先以75%的乙醇溶液浸泡20303，無菌水沖洗24次，再O.1%浸泡柑橘新枝10min，在無菌條件下，將柑橘新枝切成長(zhǎng)度為0.5lcm左右的小段(帶莖節(jié))，接種到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。(1)腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基MS+6-BA0.1mg/L(單位下同)+Kt0.1+NAA0.01;(2)芽增殖培養(yǎng)基改良MS十6-BA0.2+Kt0.04+Zt0.2+NAA0.01，其它與實(shí)施例l相同。實(shí)施例3:(1)腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基改良MS+6-BA0.2mg/L(單位下同)+Kt0.6+NAA0.1;(2)芽增殖培養(yǎng)基改良MS+6-BA0.3+Kt0.4+Zt0.5+NAA0.1，其它與實(shí)施例1或2相同。實(shí)施例4:(1)腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基MS+6-BA0.3mg/L(單位下同)+Kt0.5+NAA0.08;(2)芽增殖培養(yǎng)基改良MS+6-BA0.5+Kt0.08+Zt0.3+NAA0.08，其它與實(shí)施例l相同。實(shí)施例5:(1)腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基MS+6-BA0.4mg/L(單位下同)+KtO,3+NAA0.06;(2)芽增殖培養(yǎng)基改良MS+6-BA0.4+Kt0.1+Zt0.4+NAA0.06,其它與實(shí)施例l相同。實(shí)施例6:(1)腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基改良MS+6-BA0.5mg/L(單位下同)+^0.1+NAA0.05;(2)芽增殖培養(yǎng)基改良MS+6-BA0.3+Kt0.2+ZtO.0.5+NAA0.05,其它與實(shí)施例l相同。實(shí)施例7:(1)腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基改良MS+6-BA0.5mg/L(單位下同)+Kt0.10.4+NAA0.06;(2)芽增殖培養(yǎng)基改良MS+6-BA0.2+Kt0.28+Zt0.3+NAA0.04，其它與實(shí)施例l相同。實(shí)施例8:(1)腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基MS+6-BA0.6mg/L(單位下同)+Kt0.1+NAA0.01;(2)芽增殖培養(yǎng)基改良MS+6-BA0.2+Kt0.3+Zt0.2+NAA0.03,其它與實(shí)施例l相同。實(shí)施例9:(1)腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基改良MS+6-BA(Umg/L(單位下同)+Kt0.2+NAA0.07;(2)芽增殖培養(yǎng)基改良MS+6-BA0.3+Kt0.36+Zt0.4+NAA0.07。實(shí)施例10:(1)腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基MS+6-BA0.2mg/L(單位下同)+Kt0.6+NAA0.1;(2)芽增殖培養(yǎng)基改良MS+6-BA0.4+Kt0.4+Zt0.3+NAA0.1,其它與實(shí)施例l相同。實(shí)施例ll:(1)腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基改良MS+6-BA0.3mg/L(單位下同)+Kt0.3+NAA0.09;(2)芽增殖培養(yǎng)基改良MS+6-BA0.4+Kt0.32+Zt0.4+NAA0.09,其它與實(shí)施例l相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表l、表2:表l:激素配方對(duì)柑橘芽啟動(dòng)和增殖的影響''<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>**:基本培養(yǎng)基為MS*:基本培養(yǎng)基為改良MS在表l篩選結(jié)果的基礎(chǔ)上，繼續(xù)深入研究了激素單因素、多因素效應(yīng)，找出了幾種激素對(duì)柑橘芽萌動(dòng)和叢生芽發(fā)生的適宜配比范圍。柑橘成年態(tài)再生芽的成功培養(yǎng)還在于初代以后的繼代培養(yǎng)。通常實(shí)驗(yàn)切取外植體母枝萌發(fā)的初代離體腋芽繼代培養(yǎng)時(shí)，在繼代培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)加外源激素(優(yōu)選的激素配合范圍)上，培養(yǎng)物離體柑橘芽10天內(nèi)幾乎都發(fā)生不可逆的脫分化，產(chǎn)生一團(tuán)無定性的、疏松的含水高的愈傷組織。通過改良MS有機(jī)成分用量的一系列研究，發(fā)現(xiàn)了改良的有機(jī)成分用量組合配與激素組合能有效的維持芽的再分化，獲得了再生芽繼代培養(yǎng)的成功。表2是研究改良有機(jī)成分的其中l(wèi)例。表2改良MS配方對(duì)柑橘芽增殖的影響''<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*:1號(hào)培養(yǎng)基成分與MS相同**:116號(hào)培養(yǎng)基中使用的其它成分和激素均相同。權(quán)利要求1、一種蜜橘成年樹營(yíng)養(yǎng)器官離體叢生芽培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟(1.1)選擇健壯無病蟲害蜜橘結(jié)過果實(shí)的成年優(yōu)株，取當(dāng)年抽生20天以內(nèi)的新枝為外植體；(1.2)對(duì)外植體清洗消毒；(1.3)外植體接種在培養(yǎng)基上培養(yǎng)至腋芽生長(zhǎng)點(diǎn)開始萌動(dòng)，并在芽的基部四周出現(xiàn)黃綠色小凸點(diǎn)，繼續(xù)在腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)12～15天，此時(shí)主腋芽伸長(zhǎng)迅速；(1.4)培養(yǎng)30～40天時(shí)，將長(zhǎng)出的腋芽從外植體(母枝)上分割下來，接種到芽增殖培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢芽分化，培養(yǎng)30～40天，平均每個(gè)培養(yǎng)物分化出叢生芽4～6個(gè)，芽長(zhǎng)2～3cm；(5)分割繼代，小芽成塊繼代培養(yǎng)，大芽切割成頂芽和莖節(jié)，接種到增殖培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，以后每30～40天轉(zhuǎn)代一次，繁殖系數(shù)4～6；建成叢芽無性繁殖體系，繁殖的2cm以上芽可進(jìn)行嫁接育苗，小苗作離體種質(zhì)保存或繼代擴(kuò)繁。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的蜜橘成年樹營(yíng)養(yǎng)器官離體叢生芽培養(yǎng)方法，其特征在于所用的培養(yǎng)基如下(2.1)改良MS培養(yǎng)基，改良MS含以下改良的有機(jī)成分甘氨酸2.0mg/L，VBi1.02.0mg/L，VB61.02,Omg/L，煙酸O.51.Omg/L，肌醇100mg/L，葉酸O.11.0mg/L，蔗糖4055g/L,其它成分不變。(2.2)腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基MS或改良MS+6-BA0.10.6mg/L+KtO.10.6mg/L+NAAO.010.1mg/L。(2.3)芽增殖培養(yǎng)基改良MS+6-BA0.20.5mg/L十KtO.040,4mg/L+Zt0.20.5mg/L+NAAO,010.05mg/L。3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的蜜橘成年樹營(yíng)養(yǎng)器官離體叢生芽培養(yǎng)方法，其特征在于培養(yǎng)條件如下(3.1)培養(yǎng)參數(shù)恒溫24±2°。，相對(duì)濕度60%70%，光照強(qiáng)度為1000扁lx，日照時(shí)長(zhǎng)1114小時(shí)/天。(3.2)技術(shù)參數(shù)外植體污染率低于5%10%;腋芽萌動(dòng)誘導(dǎo)率75%87%;芽叢生增殖系數(shù)46;繼代周期3040天。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的蜜橘成年樹營(yíng)養(yǎng)器官離體叢生芽培養(yǎng)方法，其特征在于對(duì)外植體清洗消毒過程中先用偏酸性牙膏溶液浸洗殺菌，再用堿性洗衣粉液浸洗殺菌；最后用75%的乙醇溶液和0.1%0.5。/。HgCl2溶液消毒。全文摘要本發(fā)明公開了一種包括以下步驟選擇健壯無病蟲害蜜橘結(jié)過果實(shí)的成年優(yōu)株，取當(dāng)年抽生20天以內(nèi)的新枝為外植體；對(duì)外植體清洗消毒；外植體接種培養(yǎng)。腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基MS或改良MS+6-BA0.1～0.6mg/l+Kt0.1～0.6mg/l+NAA0.01～0.1mg/l。改良MS+6-BA0.2～0.5mg/l+Kt0.04～0.4mg/l+Zt0.2～0.5mg/l+NAA0.01～0.05mg/l。本發(fā)明的培養(yǎng)方法及基質(zhì)配方為蜜橘成年態(tài)莖節(jié)腋芽離體再生提供必需的環(huán)境條件。用本發(fā)明的方法進(jìn)行南豐蜜橘的離體培養(yǎng)，可獲得大量的再生芽。利用這樣的柑橘離體再生芽既可作種質(zhì)保存，又可進(jìn)行試管嫁接培育大批量?jī)?yōu)質(zhì)種苗。文檔編號(hào)A01H4/00GK101341854SQ20081010705公開日2009年1月14日申請(qǐng)日期2008年9月3日優(yōu)先權(quán)日2008年9月3日發(fā)明者張楊軍,徐志祥,涂藝聲,蔡險(xiǎn)峰申請(qǐng)人:江西師范大學(xué)