專利名稱：：一種人工合成的對(duì)鱗翅目害蟲表達(dá)高毒力蛋白的基因序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物防治
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種人工合成的對(duì)鱗翅目害蟲表達(dá)高毒力蛋白的基因序列及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：蟲害是世界農(nóng)作物減產(chǎn)的一個(gè)重要因素，平均每年因此損失糧食總產(chǎn)量的10%，直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億美元。我國(guó)水稻、玉米和棉花的種植面積分別為2837萬、2544萬、569萬公頃(2006，中國(guó)農(nóng)業(yè)信息網(wǎng))，主要的害蟲有水稻螟蟲、玉米螟蟲和棉鈴蟲等，嚴(yán)重威脅著這些重要的糧食和經(jīng)濟(jì)作物的安全生產(chǎn)。過去幾十年的防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，在為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)做出巨大貢獻(xiàn)的同時(shí)，化學(xué)農(nóng)藥卻造成了環(huán)境污染、人畜中毒、生態(tài)失衡等嚴(yán)重后果。在這些巨大的代價(jià)面前，全球都在尋找和開辟新的病蟲害防治策略和技術(shù)。蘇云金芽胞桿菌(^"ci//^/mn'"g/em^簡(jiǎn)稱Bt)是一種分布極其廣泛的革蘭氏陽性細(xì)菌。它在形成芽胞的同時(shí)，能產(chǎn)生蛋白性質(zhì)的伴胞晶體(parasporalcrystal),對(duì)鱗翅目(Lepid叩tera)、雙翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多種昆蟲，以及線蟲、螨類和原生動(dòng)物具有特異性的殺蟲活性(Schnepf,E.etal.，1998，Mz'croWo/.爿"dMo/ecw/flr及'o/ogyieWew，62(3):775-806)。這種殺蟲晶體蛋白(InsecticidalCrystalProteins,ICPs)又稱5-內(nèi)毒素(Delta-endotoxin)，在昆蟲中腸首先溶解，成為原毒素，之后被腸道蛋白酶降解為具有專一活性的毒素，與中腸上特異的受體進(jìn)行結(jié)合(Craig，2007，M/cra&o/.Mo/.歷o/.71(2):255-281)，導(dǎo)致對(duì)人畜無害，不污染環(huán)境，因而Bt在害蟲的生物防治中得到了廣泛應(yīng)用。目前人們己經(jīng)克隆了415多種編碼殺蟲晶體蛋白的Bt殺蟲基因，它們分屬180種模式基因(可參見http:〃www.biols.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/list,html)。1987年，Vaeck等人首次將Bt殺蟲晶體蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草，開創(chuàng)了人類利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)防治害蟲的先河(Vaeck，etal,1987，iVa加re,328:33-37)。但是在轉(zhuǎn)基因研究中人們發(fā)現(xiàn)將來源于Bt的殺蟲蛋白基因直接轉(zhuǎn)入植物，存在著表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定、表達(dá)量少的缺陷(vanAarssen，etal，1995，P/a"fMo/編，28:513-524)。具體問題包括1)天然Bt基因高含AT，超過60%，在植物體內(nèi)這樣的基因表達(dá)的mRNA極易被植物降解；2)天然Bt基因中存在類似真核基因的內(nèi)含子切點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止子序列，從而造成轉(zhuǎn)錄不完整、mRNA異常剪切等；3)天然Bt基因中使用的密碼子與植物存在較大差異，會(huì)造成蛋白翻譯效率降低；4)天然Bt基因作為原核生物來源的基因，其結(jié)構(gòu)與植物等真核生物差異顯著，如真核生物含有5'-UTR序列，3'末端的polyA尾序列。因此，這些關(guān)鍵問題的解決是實(shí)現(xiàn)Bt基因在植物中高效、穩(wěn)定表達(dá)的重要保證。隨著這些技術(shù)的改進(jìn)和完善，自1996年來的十二年內(nèi)，轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米、馬鈴薯、水稻等作物相繼研制成功，并逐步進(jìn)入應(yīng)用階段(JamesC，ISAAABriefs,2007)。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所獲得的co;L^基因(國(guó)家發(fā)明專利ZL20041000998.9)，對(duì)棉鈴蟲、小菜蛾、玉米螟、水稻二化螟等重要的鱗翅目害蟲具有高毒力。本發(fā)明對(duì)該基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，這樣一方面使改造的基因在常見作物中能高效穩(wěn)定表達(dá)，增強(qiáng)殺蟲效果，獲得實(shí)用性更強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因抗蟲植物；另一方面將豐富轉(zhuǎn)基因抗蟲植物中殺蟲基因的種類，增強(qiáng)國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述領(lǐng)域的不足，本發(fā)明提供一種人工合成的對(duì)鱗翅目害蟲表達(dá)高毒力蛋白的基因序列，利用植物偏好的密碼子序列對(duì)，使co;L^基因的表達(dá)量增多，提高轉(zhuǎn)基因植物的抗蟲能力。一種人工合成的對(duì)鱗翅目害蟲表達(dá)高毒力蛋白的基因序列，其特征在于編碼區(qū)具有與SeqNo.2相似性達(dá)81%，且與SeqNo.2編碼相同氨基酸序列的核苷酸序列。所述具有的核苷酸序列如SeqNo.3所示。所述人工合成的對(duì)鱗翅目害蟲表達(dá)高毒力蛋白的基因序列，如SeqNo.4所示。所述具有的核苷酸序列與SeqNo.3相似性為93%，且與SeqNo.3編碼相同氨基酸序列的核苷酸序列。所述具有的核苷酸序列如SeqNo.7所示。所述人工合成的對(duì)鱗翅目害蟲表達(dá)高毒力蛋白的基因序列，如SeqNo.5所示。包含上述基因序列的植物表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體為pUbi-mAh，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。所述植物表達(dá)載體為pCAMBIASlAh,其結(jié)構(gòu)如圖3所示。所述植物表達(dá)載體為pCAMBIAUbi-mrAh，其結(jié)構(gòu)如圖5所示。上述植物表達(dá)載體的應(yīng)用。所述應(yīng)用是指將pUbi-mAh轉(zhuǎn)化到玉米中，所述轉(zhuǎn)化指基因槍法、花粉管通道法。所述應(yīng)用是指將pCAMBIASlAh轉(zhuǎn)化煙草和甘藍(lán)，所述轉(zhuǎn)化指農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。所述應(yīng)用指將pCAMBIAUbi-mrAh轉(zhuǎn)化水稻。一種轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于該植物轉(zhuǎn)化的外源基因?yàn)樯鲜鋈我换蛐蛄?。一種轉(zhuǎn)基因微生物，其特征在于該微生物轉(zhuǎn)化的外源基因?yàn)樯鲜鋈我换蛐蛄?。所述轉(zhuǎn)基因植物在表達(dá)具有SeqNo.l所示氨基酸序列的對(duì)鱗翅目害蟲有高毒力蛋白上的應(yīng)用。所述轉(zhuǎn)基因微生物在表達(dá)具有S叫No.l所示氨基酸序列的對(duì)鱗翅目害蟲有高毒力蛋白上的應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)CrylAh的氨基酸序列(SEQNO.l)，在保證氨基酸序列不變的前提下，首先采用植物偏好的密碼子對(duì)07L4/z基因的l-2001bp的序列(SEQN0.2)進(jìn)行人工優(yōu)化改造，剔除植物稀有密碼子，并調(diào)整密碼子的使用頻率，使CrylAh蛋白的密碼子使用頻率與植物中的使用頻率接近(表l)。在此基礎(chǔ)上，去除DNA序列中存在的典型的造成植物基因轉(zhuǎn)錄本不穩(wěn)定的富含AT序列，并去除了發(fā)夾結(jié)構(gòu)和常用限制性酶切位點(diǎn)，為了在起始密碼子處形成一個(gè)WcoI(CCATGG)，在第一個(gè)起始密碼子后加入了一個(gè)氨基酸(甘氨酸，GGA)，得到人工改造的基因序列，如SEQN0.3所示，該序列與crj;L4/1基因l-2001bp的同源性為86.18%(圖21)，而G+C含量由原來的37%提高到了48%，此人工改造的基因序列能更高效穩(wěn)定地在大多數(shù)植物中表達(dá)。在上述人工改造的基因序列的5'端添加了如SeqNo.6所示的Q序列和Kozak序歹ij(GallieDRetal，1987，iVwc/e/cA7'A及^，15:3257-3273;KozakM，1984，A^c/e/c爿"論i^，12(2):857-872)，Q序列是衍生于植物病毒衣殼蛋白質(zhì)基因編碼區(qū)的翻譯增強(qiáng)序列，(Richardsetal,五^J歷oc/^w1987,84:513-519)。Kozak序列是促進(jìn)外源基因在植物細(xì)胞內(nèi)翻譯過程的編碼核糖體結(jié)合蛋白質(zhì)的序列(Kozaketal，Wwc/ez'c爿ci^i^1984,12:857-872)，能提高wo^L^基因在普通植物中的表達(dá)水平，在3'端添加了polyA序列(MunroeD，1990，il必/Ce〃祝o/,10:3441-3455)，并設(shè)計(jì)了幾個(gè)連續(xù)的終止密碼子，以確保翻譯的準(zhǔn)確終止，然后在3'端與5'端分別引入了S"mHI和K/wI位點(diǎn)，以便于后續(xù)克隆，最終確定本發(fā)明人工設(shè)計(jì)的Btcr少L4/基因序列即wctjL4/基因，如SEQN0.4所示。對(duì)本發(fā)明根據(jù)水稻基因的密碼子偏好性與其它植物的密碼子偏好性有一定的差異，及CrylAh的氨基酸序列(SEQNO.l)，保證氨基酸序列不變的前提下，在本發(fā)明SEQN0.3的序列基礎(chǔ)上進(jìn)一歩改造，采用水稻偏好的密碼子對(duì)SEQN0.3的序列進(jìn)行人工優(yōu)化改造。調(diào)整密碼子的使用頻率，使CrylAh蛋白的密碼子使用頻率與水稻中的使用頻率接近(表2)，得到適合于在水稻中高效表達(dá)的改造基因序列，如SEQN0.7所示，為了后續(xù)基因操作方便，在人工合成的基因兩邊加上了適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)，最后確定進(jìn)一步改造的mcr;;L^基因即,c77/屈基因的核苷酸序列，如SEQN0.5所示。本步驟中改造得到2001bp序列SEQIDNO.7與SEQN0.3的相似性為93。/。(圖23)，是在SEQN0.3基礎(chǔ)上稍微的改動(dòng)，與c7"/2基因SEQIDN02相似性只有81%(圖22),而G+C含量由原來的37%提高到了51%，但保證了其編碼的氨基酸不變的情況下使其在水稻中能更高效率地表達(dá)。將本發(fā)明人工設(shè)計(jì)的基因序列進(jìn)行人工合成并插入到合適的克隆載體中，獲得植物表達(dá)載體。將本發(fā)明中獲得的基因序列即wctjL^基因克隆到質(zhì)粒骨架pGEM-7Zf(+)(為常用質(zhì)粒，可在美國(guó)Promega公司購(gòu)買到)中得到植物表達(dá)載體pUbi-mAh(圖l)，該載體的多克隆位點(diǎn)中連有啟動(dòng)子序列為玉米泛素蛋白u(yù)biquitin啟動(dòng)子，和NOS終止子，及moyL4/2基因，該質(zhì)粒可以通過直接轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化植物，在植物中表達(dá)外源基因。用于驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子并不限于ubiqiiitin啟動(dòng)子，可以是來源于水稻的actin啟動(dòng)子、來源于花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動(dòng)子等。為了在轉(zhuǎn)化玉米中利于將轉(zhuǎn)基因愈傷組織篩選出來，可在該載體種連入抗生素篩選基因，本發(fā)明在pUbi-mAh連入潮霉素篩選基因，構(gòu)建得到pUbi-mAh-hpt質(zhì)粒。篩選標(biāo)記基因不限于潮霉素篩選標(biāo)記基因，可以選擇來自土壤吸水鏈霉菌(5^印Mw少c^/y^myco^o^的kw基因和來自S.討n'cfoc/zrawog柳ey的基因，也可以選擇耐草甘膦的編碼EPSP合酶的ara^基因。通過如圖3所示的流程構(gòu)建了含有本發(fā)明的wcr;;"/2基因的表達(dá)載體pCAMBIASlAh，該載體為雙元載體，可以在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中表達(dá)，可以通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物，在植物中表達(dá)外源基因。將本發(fā)明獲得的mrcr;;L^基因按照?qǐng)D5所示的步驟構(gòu)建，得到植物表達(dá)載體pCAMBIAUbi-mrAh，該載體為雙元載體，可以在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中表達(dá)，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物，特別是適合于在水稻中表達(dá)/wro^4/7基因。將包含本發(fā)明人工合成的基因序列的植物表達(dá)載體，應(yīng)用到植物轉(zhuǎn)基因工程中，使植物獲得對(duì)鞘翅目害蟲的抗性，從而達(dá)到植物保護(hù)的目的。將本發(fā)明中的植物表達(dá)載體pUbi-mAh基因槍法和花粉管通道法，轉(zhuǎn)化到玉米中，對(duì)獲得的陽性轉(zhuǎn)基因玉米植株接種玉米螟，結(jié)果表明，在檢測(cè)的175株陽性植株中有60株表現(xiàn)抗性，按照國(guó)際玉米螟協(xié)作組制定的九級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)，此60株的抗性皆為1級(jí)或者2級(jí)(圖10);將植物表達(dá)載體pCAMBIASlAh通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到煙草，對(duì)煙草陽性植株的葉片接種棉鈴蟲，由于mco;L4/7基因表達(dá)的BtCrylAh的毒害作用，陽性被測(cè)植株都表現(xiàn)了較高的殺蟲毒性(圖14)，棉鈴蟲的矯正死亡率在90%以上。轉(zhuǎn)化得到的甘藍(lán)也同樣明顯獲得抗性(圖15)。將pCAMBIAUbi-mrAh通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻，將對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因水稻在田間人工接蟲，用毛筆輕輕蘸取二齡二化螟，接種于分蘗期水稻葉片，每株接二化螟50頭，一月后觀察結(jié)果。轉(zhuǎn)基因水稻的對(duì)二化螟的殺蟲效果見圖20，轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)二化螟有抗蟲性，而非轉(zhuǎn)基因水稻被二化螟為害，有些植株已經(jīng)枯死。將含有本發(fā)明中獲得的基因序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，結(jié)果顯示附07"/基因在能夠在大腸桿菌中表達(dá)。并對(duì)提取出的蛋白進(jìn)行生物活性測(cè)定，結(jié)果表明，moyL^基因表達(dá)的蛋白對(duì)小菜蛾與棉鈴蟲均有較高的致死效應(yīng)(表3)。mrcr;;L^基因表達(dá)的蛋白對(duì)水稻二化螟有較高的致死效應(yīng)(表4)。因此可利用轉(zhuǎn)化了本發(fā)明的改造基因的微生物生產(chǎn)對(duì)鱗翅目害蟲有毒力的蛋白，由于本發(fā)明的改造基因在植物中能高效表達(dá)，因此也可利用轉(zhuǎn)該基因的植物生產(chǎn)對(duì)鱗翅目害蟲有毒力的蛋白，這些毒力蛋白可以應(yīng)用于生產(chǎn)中的害蟲防治。本發(fā)明通過對(duì)cT7L4/z基因的人工改造，使該基因更適于在植物中表達(dá)，將本發(fā)明獲得的基因序列建植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化各種農(nóng)作物，可以提高玉米、棉花、水稻、蔬菜、林木等植物抗對(duì)鱗翅目害蟲的能力。圖說明圖1為pUbi-mAh質(zhì)粒構(gòu)建圖。圖2為質(zhì)粒pUbi-mAh酶切鑒定圖，M為X/歷力din+五coRImarker,從上到下依次為21227，5148，4973，4268，3530，2027，1904，1584，1375，947，831，564bp;泳道1和泳道3為未酶切的pUbi-mAh載體；泳道2為5awHI+A:/7"I酶切pUmG2質(zhì)?；厥蘸蟮妮d體片段；泳道4為5amHI+^pnl酶切驗(yàn)證pUbi-mAh載體。圖3為pCAMBIASlAh質(zhì)粒構(gòu)建圖。圖4為pCAMBIASlAh質(zhì)粒酶切鑒定圖，M為D15000+2000marker,從上到下依次為15000，10000，7500，5000，2500，2000，1000，750，500，250，100bp;泳道1為iZ/mffll/EcoRI酶切pCAMBIASlAh質(zhì)粒；泳道2為Wol酶切pCAMBIASlAh質(zhì)粒；泳道3為TVcoI酶切pCAMBIASlAh質(zhì)粒。圖5為pCAMBIAUbi-mrAh質(zhì)粒構(gòu)建圖。圖6為pCAMBIAUbi-mrAh質(zhì)粒酶切鑒定圖，泳道M為L(zhǎng)amdaDNAAEco1301Marker,依次為19329，7743,6223,4254,3472,26卯，1882,1489，925,421，71bp;泳道1為///^/111酶切pCAMBIAUbi-mrAh質(zhì)粒；泳道2為歷"dm+五coRI酶切pCAMBIAUbi-mrAh質(zhì)粒。圖7pET-lAhp質(zhì)粒酶切鑒定及PCR檢測(cè)圖，泳道M為L(zhǎng)amdaDNA/五co1301Marker,依次為19329，7743,6223,4254，3472,2690,1882,1489,925,421,71bp;泳道1為BamHI酶切pET-lAhp質(zhì)粒；泳道2為SawHI+Sa/1酶切pET-lAhp質(zhì)粒；泳道3為PCR檢測(cè)擴(kuò)增的陽性條帶；泳道4為PCR檢測(cè)陰性對(duì)照。圖8mc7L4/在大腸桿菌中表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)圖，泳道l、2、3在上清表達(dá)的mCrylAh蛋白；泳道4為沉淀中表達(dá)的mCrylAh蛋白；泳道5為大分子量蛋白Marker,從上到下依次為200、116、97.4、66.2、45kD。圖9為金標(biāo)試紙條檢測(cè)結(jié)果，泳道l為陽性蛋白檢測(cè)結(jié)果；泳道2為非轉(zhuǎn)基因玉米蛋白檢測(cè)結(jié)果；泳道3-ll為轉(zhuǎn)基因玉米蛋白檢測(cè)結(jié)果。箭頭所指為陽性條帶。圖10為玉米植株生物活性檢測(cè)結(jié)果，A為轉(zhuǎn)基因玉米植株接蟲20天后結(jié)果；B為非轉(zhuǎn)基因植株接蟲20天后結(jié)果；C為轉(zhuǎn)基因植株接蟲40天后結(jié)果；D為非轉(zhuǎn)基因植株接蟲40天后結(jié)果。圖11為轉(zhuǎn)基因玉米的PCR檢測(cè)結(jié)果，泳道l為100bpladder;泳道2為非轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照；泳道3為陽性對(duì)照泳道4-8為轉(zhuǎn)基因玉米樣品。圖12為轉(zhuǎn)基因玉米的Westernblot檢測(cè)結(jié)果，泳道l-6為轉(zhuǎn)基因玉米樣品；CK-為陰性對(duì)照；CK+為陽性對(duì)照?qǐng)D13為轉(zhuǎn)wojL4/2基因抗蟲煙草的PCR檢測(cè)結(jié)果，泳道M為500bpLadder,從上到下依次為2000，1000，卯0，800，700，600，500，400，300，200bp;泳道1為陰性對(duì)照；泳道2為陽性對(duì)照；泳道3-11為轉(zhuǎn)化煙草植株。圖14為轉(zhuǎn)基因煙草的抗蟲性檢測(cè)結(jié)果，左圖非轉(zhuǎn)化植株，右圖轉(zhuǎn)基因植株圖15為獲得的轉(zhuǎn)化甘藍(lán)植株，左上具柄子葉，左下由具柄子葉獲得的轉(zhuǎn)化植株；右上下胚軸，右下由下胚軸獲得的轉(zhuǎn)化植株圖16轉(zhuǎn)化甘藍(lán)的PCR檢測(cè)結(jié)果，泳道M為DNAMarker,從上到下一次為900，800，700，600，500bp;泳道N為陰性對(duì)照；泳道P為陽性對(duì)照；泳道1-10為轉(zhuǎn)化甘藍(lán)植株。圖17轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)的金標(biāo)試紙條檢測(cè)結(jié)果。圖18轉(zhuǎn)wc77L4/z基因水稻的PCR檢測(cè)結(jié)果，泳道M為L(zhǎng)amdaDNA/Eco1301Marker,依次為19329，7743,6223，4254,3472,2690,1882，1489,925，421,71bp;泳道1、CK為陰性對(duì)照；泳道2為陽性對(duì)照；泳道3-13為轉(zhuǎn)化水稻植株。圖19轉(zhuǎn)ww7L4/2基因水稻的Westernblot檢!則結(jié)果，泳道P為陽性對(duì)照；泳道CK為陰性對(duì)照；泳道l-4為轉(zhuǎn)基因水稻植株。圖20轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)水稻二化螟的生物活性檢測(cè)結(jié)果。圖21SeqNo.2與SeqNo.3相似性比對(duì)圖。圖22SeqNo.2與SeqNo.7相似性比對(duì)圖。圖23SeqNo.3與SeqNo.7相似性比對(duì)圖。具體實(shí)施方法實(shí)施例l用于普通植物轉(zhuǎn)化的cij!4/i基因的改造合成本發(fā)明根據(jù)c/^L4/;基因(中國(guó)專利，專利號(hào)200410009918.9)的氨基酸序列(SEQNO.l)，在保證氨基酸序列不變的前提下，首先采用植物優(yōu)化密碼子對(duì)co;L4A基因的l-2001bp序列(SEQN0.2)進(jìn)行人工優(yōu)化改造。盡量避免使用植物稀有密碼子，并調(diào)整了密碼子的使用頻率(表l)，使CrylAh蛋白的密碼子使用頻率與植物中的使用頻率接近(表l)。在此基礎(chǔ)上，去除DNA序列中存在的典型的造成植物基因轉(zhuǎn)錄本不穩(wěn)定的富含AT序列，并去除了發(fā)夾結(jié)構(gòu)和常用限制性酶切位點(diǎn)，為了在起始密碼子處形成一個(gè)(CCATGG),在第一個(gè)起始密碼子后加入了一個(gè)氨基酸(甘氨酸，GGA)，得到核苷酸序列為SEQN0.3。該序列與cryL^基因同源性只有86.18%，而G+C含量由原來的37%提高到了48%。密碼子在植物、c^"/基因和/nc/7/^z基因中的使用頻率見表1。除了上述發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)CrylAh的DNA編碼序列外，為了提高該序列在受體生物中的表達(dá)水平，在其5'端添加了Q序列和Kozak序列，如SeqNo.6。Q序列是衍生于植物病毒衣殼蛋白質(zhì)基因編碼區(qū)的翻譯增強(qiáng)序列，Q序列由68bp組成，富集TTAAC序列，5，端有一個(gè)UAUUUUUACAACAA序列以及4個(gè)UUAC序列，這些序列在蛋白質(zhì)合成的翻譯過程中構(gòu)成核糖體和rRNA結(jié)合位點(diǎn)(Richardsetal，￡wJ歷oc/zew1987,84:513-519)。Kozak序列是促進(jìn)外源基因在植物細(xì)胞內(nèi)翻譯過程的編碼核糖體結(jié)合蛋'白質(zhì)的序列(Kozaketal，M^/e/c^"&i^1984，12:857-872)。另外，在編碼序列3'端設(shè)計(jì)了幾個(gè)連續(xù)的終止密碼子，以確保翻譯的準(zhǔn)確終止。為了克隆方便，在上述序列兩端引入分別引入了5a柳HI和A:;wI，最終確定人工設(shè)計(jì)基因mc^L4/2基因，如SEQN0.4所示?；瘜W(xué)合成SEQN0.4序列，并克隆到常用T-載體pTeasy上，獲得質(zhì)粒pTeasy-mcrylAh。表l密碼子在植物、蘇云金芽孢桿菌和改造基因中的使用頻率比較<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例2、用于水稻轉(zhuǎn)化的co^4A基因的改造合成本發(fā)明根據(jù)水稻基因的密碼子偏好性對(duì)mcT_yL^基因進(jìn)行了植物用密碼子優(yōu)化。根據(jù)ma7L4/基因的氨基酸序列(SEQN0.3)，在保證氨基酸序列不變的前提下，采用水稻偏好密碼子對(duì)SEQN0.3進(jìn)行人工優(yōu)化改造。調(diào)整密碼子的使用頻率，使CrylAh蛋白的密碼子使用頻率與水稻基因的使用頻率接近。最后確定進(jìn)一步改造的mcr;;L4/2基因即mroy"/基因的核苷酸序列為SEQIDNO.7所示，為了后續(xù)基因操作方便，在人工合成的基因兩邊加上了SawHI位點(diǎn)。最后確定進(jìn)一步改造的mcr;;L^基因即7wro;L4/2基因的核苷酸序列，如SEQN0.5所示。SEQN0.7與SEQN0.2同源性只有81%,而G+C含量由原來的37%提高到了51%。密碼子在普通植物、在普通栽培稻、在秈稻和/wro;L4/1基因中的使用頻率見表2。twwjM;基因克隆到常用T-載體pTeasy上，獲得質(zhì)粒pTeasy-mrcrylAh。表2密碼子在普通植物、水稻和改造基因中的使用頻率比較<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例3、附co^4A基因及附/r/j」L4A基因在大腸桿菌中的表達(dá)以pTeasy-mcrylAh質(zhì)粒為摸板，用特異性引物擴(kuò)增2Kb的PCR產(chǎn)物，回收純化，用^附HI、S"/I消化后，與同樣處理的pET-21b質(zhì)粒(常用質(zhì)粒，可以在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)外源基因，可以在Novagen公司購(gòu)買)連接，轉(zhuǎn)化co//JM110，通過酶切分析及PCR鑒定(圖7)，篩選出陽性重組子，把所獲得的重組表達(dá)載體質(zhì)粒命名為pET-lAhp。將重組質(zhì)粒pET-lAhp轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，150rpm，18'C誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，超聲破碎，離心，分別取上清與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE(8%)分析(圖8)。wc7;y"/1基因能夠在大腸桿菌中表達(dá)。同樣的步驟使wrcr;;L4/2基因在大腸桿菌中表達(dá)。實(shí)施例4、mCrylAh蛋白生物活性的測(cè)定(1)對(duì)小菜蛾(i3x_y/oWe//a)的室內(nèi)殺蟲活性測(cè)定蛋白用無菌水稀釋，用清水作為陰性對(duì)照。將新鮮甘藍(lán)葉片清洗，晾干；分別在蛋白液中浸潤(rùn)10s，取出，晾干，放入廣口瓶中(每片葉柄裹無菌水浸濕的脫脂棉進(jìn)行葉片保鮮)；每瓶接蟲20頭(每個(gè)處理20頭蟲，三次重復(fù))，蟲齡23齡。放入25。C光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于72hrs后進(jìn)行調(diào)查。(2)對(duì)棉鈴蟲(//.flrw&era)的室內(nèi)殺蟲活性測(cè)定稱取IOg人工飼料置于滅菌培養(yǎng)皿中，加入lml待測(cè)樣品稀釋液，充分混勻，分裝于經(jīng)消毒(5%福爾馬林浸泡)的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。用毛筆輕輕接入棉鈴蟲1-2齡幼蟲，每孔一頭，每處理重復(fù)三次，放置25'C光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)七天調(diào)査死、活蟲數(shù)。生物活性測(cè)定結(jié)果見表3。表3mCrylAh蛋白生物活性測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例5、用于水稻轉(zhuǎn)化的附rc77L^基因表達(dá)產(chǎn)物殺蟲活性測(cè)定水稻二化螟室內(nèi)殺蟲活性測(cè)定稱取30克人工飼料放置于培養(yǎng)皿中，分別加入1ml不同含量的待測(cè)樣品(m^L4/z基因在大腸桿菌的表達(dá)產(chǎn)物)，充分混勻，分裝于經(jīng)滅菌的試管當(dāng)中，用毛筆輕輕接入初孵幼蟲，每管10頭，每次重復(fù)5次，放置25。C光照培養(yǎng)箱中，96小時(shí)調(diào)查結(jié)果，計(jì)算LC50。表4mrCiylAh蛋白對(duì)水稻二化螟殺蟲結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)施例6、轉(zhuǎn)化玉米植物表達(dá)載體的構(gòu)建用5awffl和酶切質(zhì)粒實(shí)施例1中獲得的pTeasy-mcrylAh(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物技術(shù)組保存)回收2.0Kb片段，用同樣的內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒pUmG2(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)微生物基因工程實(shí)驗(yàn)室保存)，回收5.4Kb片段，連接，構(gòu)建完成質(zhì)粒pUbi-mAh，質(zhì)粒構(gòu)建圖見圖l，質(zhì)粒酶切鑒定圖見圖2。質(zhì)粒pUmG2的結(jié)構(gòu)描述如下質(zhì)粒骨架為pGEM-7Zf(+)(該質(zhì)粒為常用質(zhì)粒，可在美國(guó)Promega公司購(gòu)買到)，多克隆位點(diǎn)中連有啟動(dòng)子序列為玉米泛素蛋白u(yù)biquitin啟動(dòng)子(ChristensenAHetal，1992，Pto加Mo/別o/，18(4):675-89)，mG2基因和《os終止子；質(zhì)粒pUbi-mAh的結(jié)構(gòu)描述如下質(zhì)粒骨架為pGEM-7Zf(+)(該質(zhì)粒為常用質(zhì)粒，可在美國(guó)Promega公司購(gòu)買到)，多克隆位點(diǎn)中連有啟動(dòng)子序列為玉米泛素蛋白u(yù)biquitin啟動(dòng)子(ChristensenAHetal，1992，戶/aWM0/歷0/，18(4):675-89)，本發(fā)明獲得的may"h基因和mw終止子，該質(zhì)?？梢栽谥参镏斜磉_(dá)外源基因。用于驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子并不限于ubiquitin啟動(dòng)子，可以是來源于水稻的actin啟動(dòng)子、來源于花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動(dòng)子等。為了在轉(zhuǎn)化玉米中利于將轉(zhuǎn)基因愈傷組織篩選出來，利用/f/MdlII酶切質(zhì)粒p-Hyg(含有表達(dá)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，對(duì)潮霉素有抗性，該質(zhì)粒在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所保存)，連入用同樣酶切的質(zhì)粒pUbi-mAh，構(gòu)建得到pUbi-mAh-hpt質(zhì)粒。作為篩選標(biāo)記基因的不限于潮霉素篩選標(biāo)記基因，可以選擇來自土壤吸水鏈霉菌CSfrepto附y(tǒng)c"/ygrascop/cM9的Zw基因禾口來自S.v/n'ctoc/y-o附oge"ay的p欲基因，也可以選擇耐草甘膦的編碼EPSP合酶的wo4基因。實(shí)施例7、花粉管通道轉(zhuǎn)化玉米和轉(zhuǎn)基因植株篩選玉米轉(zhuǎn)化用花粉管通道法(周光宇.從生物學(xué)角度探討遠(yuǎn)緣雜交的理論.1987，11(2):16-20)。大量提取質(zhì)粒pUi-mAh，質(zhì)粒DNA提取采用QiagenPlasmidKit(tip-100)試劑盒，方法同試劑盒說明書。在玉米授粉前一天對(duì)玉米雄穗和雌穗套袋隔離，授粉時(shí)，收集雄穗的花粉，均勻的散布于雌穗花絲上，套好紙袋，并在植株上掛上標(biāo)記牌，詳細(xì)標(biāo)明玉米品種、授粉方式、授粉時(shí)間等信息。于授粉后1620h左右進(jìn)行花粉管導(dǎo)入，DNA濃度為150250ng4iL，每穗滴入約200nLDNA，即每穗DNA滴注量為3050嗎；重新套好紙袋，并在標(biāo)記牌上詳細(xì)標(biāo)明導(dǎo)入時(shí)間、導(dǎo)入基因種類與濃度、總計(jì)導(dǎo)入量等信息；待導(dǎo)入玉米穗自然結(jié)實(shí)后收獲；于次年播種檢測(cè)。田間播種花粉管轉(zhuǎn)化的玉米種子，待植株生長(zhǎng)到4-5葉期，取適量玉米葉片，提取葉片蛋白，用BT-CrylAb/Ac金標(biāo)免疫檢測(cè)試劑盒檢測(cè)葉片蛋白，轉(zhuǎn)基因植株會(huì)顯現(xiàn)陽性條帶(圖9)，轉(zhuǎn)基因植株占檢測(cè)植株的1.8%。實(shí)施例8、基因槍轉(zhuǎn)化玉米剝離授粉后1012天的玉米幼胚，在含有24mg/L2，4-D的N6培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚性愈傷組織。取狀態(tài)良好繼代培養(yǎng)的胚性愈傷組織，放入含有N6培養(yǎng)基的直徑6cm的培養(yǎng)皿中，用由金粉包裹質(zhì)粒的子彈進(jìn)行轟擊，每皿轟擊一次。子彈的處理方法取50^1金粉懸浮液放入500pl離心管中，加入5pl質(zhì)粒DNA溶液(l叫/ul)，混勻后加入5pl2.5MCaCl2溶液和20^10.1M的亞精胺,在室溫下放置10分鐘，短暫離心，棄去上清，重懸于70°/。乙醇，低速Vortex,保持懸浮狀態(tài)。待轟擊后的玉米材料暗培養(yǎng)過夜，然后轉(zhuǎn)移到N6培養(yǎng)基，然后轉(zhuǎn)移到含有20mg/L潮霉素的N6培養(yǎng)基含(2mg/L2，4-D)上進(jìn)行篩選。2~3周后選擇能夠正常生長(zhǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到20mg/L潮霉素的N6培養(yǎng)基含(2mg/L2，4-D)上繼續(xù)篩選。將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入含有60g/L蔗糖的N6培養(yǎng)基(含減半的2，4-D)上，培養(yǎng)兩周，誘導(dǎo)形成胚狀體。將發(fā)育好的胚狀體轉(zhuǎn)移到不含激素的N6培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)。當(dāng)小植株長(zhǎng)到l~2cm長(zhǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)移到三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。34葉期且根系發(fā)達(dá)時(shí)，將小苗移入小花盆，外罩塑料袋保溫保濕，移入溫室栽培5-7天，去掉塑料袋后，再培養(yǎng)一周，移入大花盆，直至開花結(jié)實(shí)。實(shí)施例9、轉(zhuǎn)化植株的生物活性檢測(cè)和分子檢測(cè)待轉(zhuǎn)基因植株種植長(zhǎng)到七八葉期時(shí)，人工接蟲玉米螟將即將孵化的玉米螟卵接種到玉米的心葉中和葉腋處，接蟲量在100頭左右，5天后第二次接蟲，接蟲量同第一次，20天后統(tǒng)計(jì)玉米為害情況。通過生物活性檢測(cè)結(jié)果表明，在檢測(cè)的175株陽性植株有60株植株表現(xiàn)高抗，按國(guó)際玉米螟協(xié)作組制定的九級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)，60株植株均為1級(jí)或2級(jí)(圖IO)。提取抗性玉米的基因組DNA，取l嗎基因組DNA做模板，引物序列如下1Ahl:5'-GACTTGACCGAAGGCATTAGC-3'1Ah2:5'-TTGTTGTTCTGTGGTGGGATC-3'PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94°C，5分鐘，l個(gè)循環(huán)；94°C，1分鐘，56°C，1分鐘，72°C，2分鐘，30個(gè)循環(huán)，電泳結(jié)果如圖ll所示。提取玉米的葉片可溶性蛋白，50嗎蛋白10%SDS-PAGE電泳，將電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)化方法參見Bio-Rad說明書，用3%BSA封閉，用h1000的CrylAh蛋白的多克隆抗體作為一抗，用堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗以1:10000(Sigma公司購(gòu)買)雜交，顯色后可見轉(zhuǎn)基因植株有陽性條帶，證明BtCrylAh蛋白在玉米中表達(dá)(圖12)。利用基因槍轉(zhuǎn)化玉米，獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的轉(zhuǎn)化率為1.5%。實(shí)施例10、轉(zhuǎn)mcijL4A基因抗蟲煙草的獲得首先構(gòu)建植物表達(dá)載體，載體骨架是雙元載體pCAMBIA2301(該質(zhì)粒為常用質(zhì)粒，CAMBIA機(jī)構(gòu)可以提供)，基因的表達(dá)盒由CaMV35S啟動(dòng)子、本發(fā)明獲得的wtrj;L4/z基因和NOS終止子(一段DNA序列，含有基因表達(dá)的終止信號(hào))。最終得到質(zhì)粒命名為pCAMBIASlAh。對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖3所示；構(gòu)建圖譜見圖4。構(gòu)建步驟用歷"dIII、五coRI雙酶切質(zhì)粒pUC19(該載體為常用載體，可在美國(guó)Promega公司購(gòu)買到)和pBI121(該載體為常用載體，GenBank登錄號(hào)為AF485783。見ChenPY,etal，2003，Mol.Breed,11:287-293.。申請(qǐng)人的生物實(shí)驗(yàn)室可向公眾發(fā)放)，將pBI121上的組成型表達(dá)啟動(dòng)子CaMV35S、GUS基因和NOS終止子連接到pUC19上，構(gòu)成pUC19-SGN。用5"mHI、￡coRI酶切pUC19-SGN，回收大片段，同時(shí)用BamHI、￡coRI酶切實(shí)施例6中獲得的載體pUbi-mAh，回收wc^L4/2基因和NOS終止子，約2.4kb的片段。兩個(gè)片段進(jìn)行連接，構(gòu)建成載體pUCSlAh。然后用歷"dIII、五coRI雙酶切質(zhì)粒pCAMBIA2301(該質(zhì)粒為常用質(zhì)粒，CAMBIA機(jī)構(gòu)可以提供)回收大片段，同時(shí)州'"dIII、￡coRI雙酶切質(zhì)粒pUCSlAh，回收約3.1kb的片段，將兩個(gè)片段連接，可以得到載體pCAMBIASlAh(圖3)，質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果見圖4。該載體為雙元載體，可以在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中表達(dá)，可以通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物，在植物中表達(dá)外源基因。采用凍融直接轉(zhuǎn)化法，將構(gòu)建好的質(zhì)粒pCAMBIASlAh轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404。轉(zhuǎn)化子在卡那霉素100pg/ml和鏈霉素125pg/ml的雙抗性YEB培養(yǎng)基的平板上篩選。隨機(jī)選取轉(zhuǎn)化得到的克隆，少量提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，證明質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。煙草轉(zhuǎn)化采用葉盤法(HorschRB，1986，ProcNatlAcadSciUSA.83(8):2571-5)，轉(zhuǎn)化外植體取培養(yǎng)的煙草無菌苗頂部幼嫩葉片。共培養(yǎng)三天后，轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+I00pg/mlKn+50(^g/mlCb+3mg/ml6-BA+0.2mg/mlNAA)進(jìn)行見光分化，2周后，在葉片邊緣有綠色愈傷點(diǎn)出現(xiàn)，而大部分轉(zhuǎn)化體則可以直接分化出抗性芽，抗性芽長(zhǎng)到2-3cm時(shí)，移至生根培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+100嗎/mlKn+500ng/mlCb)生根，約2周后可生出細(xì)嫩小根，逐漸成苗。提取轉(zhuǎn)化煙草的基因組DNA，取1嗎基因組DNA做模板，引物序列如下AHF:5'-GCTCTAGAGCCATCGATTGAGCCATGTTTCCAH2R1:5'-GTCAAAATTCAACAGCTGATCAATGTGGTAGTCAGTPCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94°C，7分鐘，1個(gè)循環(huán)；94°C，1分鐘，56°C，1分鐘，72°C，2分鐘，30個(gè)循環(huán)，電泳結(jié)果如圖13所示。轉(zhuǎn)基因煙草占轉(zhuǎn)化煙草的陽性率為26%。選取七葉期煙草的第二、第三、第四片葉子作為生測(cè)對(duì)象；將脫脂棉球把葉柄包裹，置于放有滅過菌濾紙的平皿中，并滴加ddH2O50(HU于棉球上；接蟲初孵棉鈴蟲ll頭接于每片葉片上；實(shí)驗(yàn)共選三株進(jìn)行檢測(cè)，每株選取三片葉子，各三個(gè)重復(fù))。編號(hào)封口，將平皿放于鋪有濕紗布的筐中，并將四周蓋上濕紗布，置于28'C培養(yǎng)室中；每天注意觀察，保持紗布濕度和室內(nèi)溫度；三天后統(tǒng)計(jì)試蟲死亡數(shù)，計(jì)算死亡率。圖14即為接蟲后三天的結(jié)果，可以看出非轉(zhuǎn)化植株葉片已造成許多缺刻，還可以看到試蟲的糞便，而轉(zhuǎn)基因植株葉片在被咬成小空洞之后，由于BtCrylAh的毒害作用，試蟲死亡，可以看到幼蟲的尸體。對(duì)各樣品的死蟲數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算得出了各個(gè)樣品的對(duì)照死亡率，各個(gè)樣品都表現(xiàn)出了較高的殺蟲毒性，校正死亡率在卯％以上。實(shí)施例11、轉(zhuǎn)柳c/jL4A基因抗蟲甘藍(lán)的獲得采用直接凍融轉(zhuǎn)化法，將構(gòu)建好的質(zhì)粒pCAMBIASlAh轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404。轉(zhuǎn)化子在卡那霉素100pg/ml和鏈霉素125pg/ml的雙抗性YEB培養(yǎng)基的平板上篩選。隨機(jī)選取轉(zhuǎn)化得到的克隆，少量提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，證明質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。甘藍(lán)轉(zhuǎn)化采用下胚軸和具柄子葉作為轉(zhuǎn)化外植體，轉(zhuǎn)化方法見文獻(xiàn)(張七仙等，2001，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，9(1):72-76)。共培養(yǎng)2天后，轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+10(Hig/LKn+500昭/LCb+0.02mg/LNAA+0.2mg/L2，4一D)進(jìn)行篩選，10d后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，見光分化，2周后，在葉片邊緣有綠色愈傷點(diǎn)出現(xiàn)，而大部分轉(zhuǎn)化體則可以直接分化出抗性芽，抗性芽長(zhǎng)到2-3cm時(shí)，移至生根培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+100嗎/LKn+500昭/LCb+0.15mg/LNAA+20mg/Lsugar)生根，約2周后可生出細(xì)嫩小根，逐漸成苗(圖15)。提取轉(zhuǎn)化甘藍(lán)的基因組DNA，取1嗎基因組DNA做模板，引物序列如下AHF:5'-GCTCTAGAGCCATCGATTGAGCCATGTTTCCAH2R1:5'-GTCAAAATTCAACAGCTGATCAATGTGGTAGTCAGTPCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94°C，7分鐘，1個(gè)循環(huán)；94°C，1分鐘，56°C，1分鐘，72°C，2分鐘，30個(gè)循環(huán)，電泳結(jié)果如圖16所示。取適量甘藍(lán)葉片，提取葉片蛋白，用BT-CrylAb/Ac金標(biāo)免疫檢測(cè)試劑盒檢測(cè)葉片蛋白，轉(zhuǎn)基因植株會(huì)顯現(xiàn)陽性條帶(圖17)。檢測(cè)結(jié)果顯示甘藍(lán)的平均轉(zhuǎn)化率為1.5%。實(shí)施例12、轉(zhuǎn)mre/^L4A基因抗蟲水稻的獲得用fi，HI酶切質(zhì)粒實(shí)施例2中獲得的pT-mrcrylAh(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物技術(shù)組保存，含有SEQNO.5序列的mrcrylAh基因)，回收2.0Kb片段，用Klenow酶補(bǔ)平，用S側(cè)HI和《;wl酶切質(zhì)粒pUbi-mAh(本專利中質(zhì)粒，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)微生物基因工程實(shí)驗(yàn)室保存)，回收5.4Kb片段，用Klenow酶補(bǔ)平，兩個(gè)片段連接，構(gòu)建完成質(zhì)粒pUbi-mrAh。然后用歷"dIII、五coRI雙酶切質(zhì)粒pCAMBIA3301(該質(zhì)粒為常用質(zhì)粒，CAMBIA機(jī)構(gòu)可以提供)回收大片段，同時(shí)預(yù)"din、feoRl雙酶切質(zhì)粒pUbi-mrAh，回收約4.4kb的片段，將兩個(gè)片段連接，可以得到載體pCAMBIAUbi-mrAh。質(zhì)粒構(gòu)建圖譜見圖5，質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果見圖6。將含有pCAMBIAUbi-mrAh質(zhì)粒的農(nóng)桿菌克隆接種于含有卡那霉素100嗎/ml和鏈霉素125昭/ml的YEB液體培養(yǎng)基中，28'C振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8，在4。C4000rpm離心10min，倒掉上清,沉淀用100ml的AAM培養(yǎng)液加lmlAS、52ul2，4-D、20ulKT懸浮，即為共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化水稻用的農(nóng)桿菌懸浮液；將胚性愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)20分鐘；取出水稻愈傷組織，用滅菌濾紙吸干菌液，放置到鋪有一層濾紙的培養(yǎng)基中，26'C暗培養(yǎng)3天，3天后轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基(25mg/LBasta)，26°C，光/暗=15小時(shí)/9小時(shí)，2周后，移至分化培養(yǎng)基，有綠色愈傷點(diǎn)出現(xiàn)，2周后，愈傷點(diǎn)分化成小植株，將小植株切下移至生根培養(yǎng)基生根，根部發(fā)育健壯后，移至花盆在土中繼續(xù)生長(zhǎng)。提取轉(zhuǎn)化水稻的基因組DNA，取0.5嗎基因組DNA做模板，引物序列如下mrHF:5'-ATGAAGAACAGCATCAAACTCTCmrHR:5'-CGGTATCTGGTAGATGTGGACGGPCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94°C，5分鐘，1個(gè)循環(huán)；94°C，1分鐘，56'C，1分鐘，72°C，1分鐘30秒，30個(gè)循環(huán)，PCR檢測(cè)結(jié)果見圖18。提取水稻葉片蛋白，30嗎蛋白10。/。SDS-PAGE電泳，將電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)化方法參見Bio-Rad說明書，用3。/。BSA封閉，用1:1000的Cry1Ah蛋白的多克隆抗體作為一抗，用堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗以1:10000(Sigma公司購(gòu)買)雜交，顯色后可見轉(zhuǎn)基因植株有陽性條帶，證明BtCrylAh蛋白在水稻中表達(dá)(圖19)。轉(zhuǎn)基因水稻的轉(zhuǎn)化率為1.91%。序列表SeqNO.1基因氨基酸序列1MKNSIKLSELWYFNERK麗FMEIVNNQNQCVPYNCLNNPEIEILEGGRISVGNTPIDIS61LSLTQFLLSEFVPGAGFVLGLIDL賜FVGPSQWDAFLAQVEQL職IAEAVR脂IQE121LEG臓VYRTYATAFAEWEKAPDDPELREALRTQFTATETYISGRISVLKIQTFEVQLLS181VFAQAANLHLSLLRDVVFFGQRWGFSTTTV隨YYNDLTEGISTHDYAVRWYNTGLERVW241GPDSRDWRYNQFRRELTLTVLDIVALFPNYDSRRYPIRTVSQLTREIYTNPVLENFDGS301FRGSAQGIERSIRSraLMDILNSITIYTDAHRGYYYWSGHQIMASPVGFSGPEFTFPLYG361TMGNAAPQQRIVAQLGQGVYRTLSSTFYRRPFNIGINNQQLSVLDGTEFAYGTSSNLPSA421VYRKSGTVDSLDEIPPQNNNVPPRQGFS冊(cè)LSHVSMFRSGSSSSVSIIRAPMFSWI冊(cè)SA481EFNNIIASDSITQIPAVKGNFLFNGSVISGPGFTGGDLVRLNSSG駆QNRGYIEVPIHF541PSTSTRYRVRVRYASVTPIHLN麗GNSSIFSNTVPATATSLDNLQSSDFGYFESANAFT601SSLGNIVGVRNFSGTAGVIIDRFEFIPVTATLEAEYNLERAQKAVNALFTSTNQLGLKTN661VTDYHIDQVSNLVTCLSDEFCLDEKRELSEKVKHAKRLSDE亂LQDSNFKDINRQPERG721WGGSTGITIQGVDDVFKENYVTLSGTFDECYPTYLYQKIDESKLKAFTRYQLRGYIEDSQ781DLEVYLIRYNAK冊(cè)TLNVPGTGSLWPLAVKSPIGRCGEPNRCA朋S冊(cè)FSLDIDVGCTDL841NEDLGVWVIFKIKTQDGHAKIGNLEFLEEKLLLGEALARVKKAE歸RDKREKLEWETNI901VYKEAKESVDALFVDSQYNRLQTDTN週I腸DKRV冊(cè)I服AYLPELSVIPGVNAAIFE961ELEGLIFTAFSLYDARNVIKNGDFNYGLSCWNVKGHVDVEEQNN冊(cè)SVLVIPE呢AEVSQ願(yuàn)EVRVCPGRGYILRVTAYKEGYGEGCVTIHEIEDNTDELKFSNCVEEEVYP麗VTCNDYT1081ATQEEYEGTYTSRNRGYDGAYESNSSVPADYASAY孤AYTDG服DNPCES跳YRDYTP1141LPAGYVTKELEYFPETDKVWIEIGETEGTFIVDSVELLLMEESeqNO.2基因的l-2001bp1ATGMAAACAGTATCAAATTATCAGAACTTTGGTATTTCAATGAA八GAAAATGGAGGTAT61TTTATGGAGATAGTGAATAATCAGMTCAATGCGTGCCTTATAATTGTTTGAATAATCCC121GAAATCGAAATATTAGAAGGCGGAAGAATATCAGTTGGTAATACCCCAATTGATATTTCT181CTTTCGCTTACTCAGTTTCTTTTGAGTGMTTTGTCCCAGGTGCGGGGTTTGTATTAGGA241TTAATTGATTTAATATGGGGATTTGTAGGTCCTTCCCAATGGGACGCATTTCTTGCTCAA301GTGGAACAGTTAATTMCCAAAGAATAGCAGMGCTGTAAGMATACAGCAATTCAGGAA361TTAGAGGGAATGGCACGGGTTTATAGAACCTATGCTACTGCTTTTGCTGAGTGGGAAAAA421GCTCCTGATGACCCAGAGCTAAGAGAAGCACTACGTACACAATTTACAGCAACTGAGACT481TATATAAGTGGAAGMTATCCGTTTTAAAAATTCAMCTTTTGAAGTACAGCTGTTATCA541GTGTTTGCCCMGCTGCAAATTTACATTTATCTTTATTAAGAGACGTTGTGTTTTTTGGG601CAAAGATGGGGTTTTTCAACGACAACCGTAAATAATTACTACAATGATTTAACAGAAGGG661ATTAGTACCTATACAGATTATGCTGTACGCTGGTACMTACGGGATTAGAACGTGTATGG721GGACCGGATTCTAGAGATTGGGTAAGGTATAATCAATTTAGAAGAGAATTAACACTMCT781GTATTAGATATCGTTGCTCTGTTCCCGAATTATGATAGTAGMGATATCCAATTCGMCA841GTTTCCCMTTAACMGAGAMTTTATACAAACCCAGTATTAGAAAATTTTGATGGTAGT901TTTCGAGGCTCGGCTCAGGGCATAGAAAGAAGTATTAGGAGTCCACATTTGATGGATATA961CTTMCAGTATAACCATCTATACGGATGCTCATAGGGGTTATTATTATTGGTCAGGGCAT廳CAAATAATGGCTTCTCCTGTCGGTTTTTCGGGGCCAGAATTCACGTTTCCGCTATATGGA1081ACCATGGGAAATGCAGCTCCACAACAACGTATTGTTGCTCAACTAGGTCAGGGCGTGTAT1141AGAACATTATCCTCTACTTTTTATAGAAGACCTTTTMTATAGGGATAAATAATCAACAA讓CTATCTGTTCTTGACGGGACAGAATTTGCTTATGGMCCTCCTCAMTTTGCCATCCGCT1261GTATACAGAAMAGCGGAACGGTAGATTCG1321GTGCCACCTAGGCAAGGATTTAGTCATCGA1381TCTAGTAGTAGTGTMGTATMTAAGAGCT1441GAATTTAATAATATAATTGCATCGGATAGT1501TTTCTTTTTAATGGTTCTGTAATTTCAGGA1561TTAMTAGTAGTGG楊TAACATTCAGAAT1621CCATCGACATCTACCAGATATCGAGTTCGT1681CTCAACGTTAATTGGGGTAATTCATCCATT1741TCATTAGATAATCTACAATCMGTGATTTT1801TCTTCATTAGGTAATATAGTAGGTGTTAGA1861GACAGATTTGAATTTATTCCAGTTACTGCA簡(jiǎn)GCGCAGAAGGCGGTGAATGCGCTGTTTACG1981GTAACGGATTATCATATTGATSeqNO.3ww;;L4/z基因的改造區(qū)段1ATG^AAGAACAGCATCAAACTCTCAGAA61TACTTCATGGAGATAGTGAACAACCAGAATmCCCGAAATCGAGATCCTCGAAGGCGGAAGG181TCTCTTTCACTTACTCAGTTCCTTTTGAGC241GGCTTGATCGACTTGM"CTGGGGATTTGTA301CAAGTGGAGCAGTTGATCAACCAGAGGATC361GAACTTGAGGGAATGGCACGGGTTTACAGA421AAGGCTCCTGATGACCCAGAGCTTCGTGM481ACTTACATCAGTGGACGCATCTCCGTTCTC541TCAGTGTTTGCCCAAGCTGCCAACCTCCAC601GGTCAAAGATGGGGTTTCTCCACTACCACC661GGCATTAGCACCTACACCGACTATGCTGTT721TGGGGACCGGATTCTCGTGATTGGGTCAGG781ACTGTGTTGGACATCGTTGCTCTGTTTCCG841ACTGTTTCCCMCTCACACGTGAAATCTAC卯lAGTTTCCGAGGCTCAGCTCAGGGCATAGM961ATACTTAACAGCATCACCATCTATACCGAT1021CACCAAATCATGGCTTCTCCTGTCGGTTTC麵GGAACTATGGGAAATGCAGCTCCACAACAA1141TATAGAACCTTGTCCTCTACTTTCTACCGC1201CAACTCTCTGTTCTTGACGGGACAGAGTTT1261GCTGTGTACAGAAAMGCGGMCTGTAGAT1321AACGTGCCACCAAGGCAAGGCTTTAGCCAT1381GGCTCTAGTAGCAGTGTCAGCATCATAAGA1441GCTGAGTTCAACAACATCATTGCATCGGAT1501AACTTCCTTTTCAATGGTTCTGTCATTTCA1561AGATTGAACAGCAGTGGAAATAACATTCAG1621TTTCCATCCACATCTACCAGATACCGAGTT腿CACCTCAACGTCAACTGGGGTAATTCCTCC1741ACCTCCCTTGACAACCTACAATCTAGCGAC腿ACATCTTCACTTGGTAATATCGTTGGTGTT1861ATAGACAGATTCGAGTTCATTCCCGTTACTCTGGATG嵐TACCACCACAGAATAACMCTTAAGCCATGTTTCAATGTTTCGTTCAGGCCCTATGTTCTCTTGGATACATCGTAGTGCTATTACTCAAATCCCTGCAGTGAAGGGAMCCCAGGATTTACTGGTGGGGACTTAGTTAGAAGAGGGTATATTGAAGTTCCAATTCACTTCGTACGGTATGCTTCTGTAACCCCGATTCACTTTTCCMTACAGTACCAGCTACAGCTACGGGTTATTTTGAMGTGCCAATGCTTTTACAAATTTTAGTGGGACTGCAGGAGTGATMTAACACTCGAGGCTGAATATAATCTGGAAAGATCTACAMCCAACTAGGGCTAAMAC嵐TCTTTGGTATTTCAACGAGAGGAAGTGGAGGCAGTGCGTGCCTTACMTTGCTTGAACMCATCTCCCTTGGTAATACCCCCATTGACATTGAGTTTGTCCCAGGTGCGGGGTTTGTCCTTGCTCCTTCCCAATGGGACGCATTTCTTGCTGCAGAAGCTGTCAGGMCACAGCCATCCAGACCTATGCTACTGCTTTCGCTGAGTGGGAAGCACTTCGTACCCAATTCACCGCAACTGAGAAGATTCAAACTTTCGAAGTACAGCTGTTGTTGTCTTTGCTTAGAGACGTTGTGTTCTTTGTGAACMCTACTACMCGACTTGACCGAACGCTGGTACAATACCGGACTCGAACGTGTTTACAACCAGTTCAGGAGAGAGTTGACCCTCAATTACGATAGTAGGCGCTATCCCATTCGAACAAACCCAGTCTTGGAGAACTTCGATGGTCGTAGCATTAGGAGTCCACACTTGATGGATGCTCATAGGGGTTACTACTACTGGTCAGGTTCAGGTCCAGAGTTTACCTTTCCGCTCTATCGTATTGTTGCCCAACTAGGTCAGGGCGTGAGACCCTTCAACATAGGCATCAACAACCAGGCCTATGGAACCTCCTCCAATTTGCCATCCTCCCTGGATGAGATCCCACCACAGAACMCCGATTGAGCCATGTTTCCATGTTTCGTTCAGCACCTATGTTCTCTTGGATTCATCGTAGTAGCATTACTCAMTCCCTGCTGTGAAGGGAGGACCAGGATTCACTGGTGGGGACTTAGTTAATAGAGGGTACATTGAAGTTCCCATTCACCGTGTTCGGTACGCCTCTGTTACCCCGATTATTTTCTCCAACACAGTTCCAGCTACTGCTTTCGGTTACTTCGAGAGCGCCAACGCCTTCAGAAATTTCAGTGGGACTGCTGGAGTGATCGCAACACTTGAGGCTGAGTACAACCTGGAAagagcccagaaggccgtgaaaatgtcactgactaccacat簡(jiǎn)1981SeqNO.4附oyL4ft基因1—aagctttcta^;q5g卿Gl一121181tgccctgtttacctctacaaaccagctagggctcaagacctgatatccatcctatttttacaacaattaccaacaacaacaaacaacmacmcattacmttactatttacmtmccatg§^2413013614214815416016617217818419019611021讓11411201126113211381144115011561162116811741180118611921198120412101cagmctttgagaatcagtggaaggatctctgagcgagttttgtaggtccggatcgcagaacagaacctagtgmgcactttctcaagattccacttgtcccaccgtgaactgttcgctgtcaggtacaattccgaattatctacmmatagaacgtagccgatgctcagtttctcaggaacaacgtataccgcagaccagtttgcctatagattccctgccatcgatttaagagcacccggatagcattttcaggaccttcagaataggagttcgtgtcctccattttgcgacttcgggtgttagmattactgcmctgtttacctcaatagctcgagtatttcaaccgtgccttaccgttggtaattgtcccaggtttcccmtggagctgtcaggtgctactgcttcgtacccaatcaaactttctttgcttagacaactactacgtacaataccccagttcaggcgatagtaggcccagtcttgcattaggagttaggggttactccagagttttgttgcccaacttcmcatatggaacctccggatgagatcgagccatgtttatgttctcttactcaaatcaggattcactagggtacatttcggtacgccctccmcacattacttcgagtttcagtgggacttgaggcttacaaaccaggagatctggtgagaggaagtmttgcttgaacccccattggcggggtttggacgcatttcmcacagccattcgctgagtttcaccgcaagaagtacagcgacgttgtgtmcgacttgaggactcgaacagagagttgacgctatcccagagaacttcgccacacttgatactactggtacctttccgcctaggtcaggggcatcaacatccaatttgcccaccacagatccatgtttctggattcatccctgctgtgaggtggggactgaagttcccatctgttacccgttccagctaagcgccaacgactgctggaggagtacaaccctagggctcaaccgggccccggaggtacttacaaccccgaacatttctcttccttggcttttgctcmgttccaggaactggga嵐ggcctgagacttatgttgtcagttctttggtcaccgaaggcatgtgtttggggccctcactgtttcgaactgtatggtagttttggatatactcaggtcaccatctatggaacgcgtgtatagaccagcmctcatccgctgtacaacmcgtgttcaggctcgtagtgctgaagggamctttagttagattttcactttcccgattcacctctgctacctcccttcacatctgatcatagatggaaagagcagaccmtgtccctcgaggc^mgaacagccatggagataaatcgagatcttcacttactgatcgacttgggagcagttgtgagggaatgtcctgatgaccatcagtggagtttgcccaaaagatggggttagcacctacaccggattctgttggacatcttcccmctcccgaggctcatmcagcatcaatcatggcttatgggaaataaccttgtccctctgttcttgtacagaaaagccaccaaggtagtagcagtgttcaacaacccttttcaatgaacagcagtatccacatctcaacgtcaacccttgacaacttcacttggtcagattcgagccagaaggcccactgactactgagtmggtatcaaactctgtgaacaaccctcgaaggcgcagttcctttatctggggatatcaaccagagcacgggtttccagagcttccgcatctccggctgccmccttctccactaaccgactatgcgtgattggggttgctctgtacacgtgmagctcagggcaaccatctatatctcctgtcggcagctccactctactttctgacgggacagagcggaactgcaaggctttagtcagcatcaatcattgcatggttctgtcaggmatmcaaccagatacctggggtmttctacaatctaaatatcgttgttcattcccggtgaatgcccc織ttgat工taactttgag2161tattatggcattgg嵐agccattgttctgcttgtmtttactgtgttctttcagttttg2221ttttcggacatcaagttaacmaamaamaaaaa嵐aaamaatttaacamaaama2281aaamaamamaaatttaacaaamaamamaamaaaamaaatttamgagctcSeqNO.5/wrr少L4/z基因1|ggatcc|atcctattttt織61tactatttacmtaacaatgacmttaccaacmcaacaaacaacaaacaacattacmtaagaacagcatcaaactctcagagctgtggtatttcmcg121AGAGGAAGTGGAGGTACTTCATGGAGATAG181ATTGCCTCMCAACCCCGAAATCGAGATCC241CCCCCATTGACATTTCGCTGTCACTTACTC301CGGGGTTTGTCCTTGGCCTAATCGACCTCA361ACGCATTTCTTGCGCAAGTGGAGCAGCTCA421ACACAGCCATCCAGGMCTGGAGGGAATGG481TCGCTGAGTGGGAGMGGCTCCTGATGACC541TCACAGCMCGGAGACGTACATCTCAGGAC601AAGTACAGCTGCTATCAGTGTTTGCCCMG661ACGTCGTGTTCTTTCGTCA-AGGCTGGGGTT721ACGACCTCACCGMGGCATTAGCACGTATA781GACTCGAACGTGTCTGGGGACCGGATTCTC841GAGAGTTGACGCTCACTGTGTTGGACATCG卯lGCTATCCCATACGMCTGTTTCCCAACTCA961AGAACTTCGATGGCAGCTTCCGAGGCTCAG1021CGCACTTGATGGATATACTGMCAGCATCA1081ACTACTGGTCAGGTCACCMATCATGGCGT1141CCT丁TCCGCTCTATGGCACGATGGGCAATG1201TAGGGCAGGGCGTGTATCGGACCTTGTCGT1261GCATCAACAACCAGCAACTCTCTGTGCTTG1321CCAATTTGCCGTCGGCTGTGTATCGCAAAA1381CACCGCAGAACAACMCGTGCCACCGAGGC1441CCATGTTTCGGTCAGGCTCTAGTAGCAGTG1501GGATTCATCGTAGTGCGGAGTTCMCAACA1561CTGCTGTGMAGGCAACTTCCTGTTCAATG1621GTGGGGACTTAGTCCGATTGMCAGCAGTG1681MGTTCCCATACAC丁TTCCG丁CCACATCTA1741CTGTTACCCCGATTCACCTCMTGTCAACT憩TTCCAGCGACTGCGACCTCCCTGGACMCC腿GCGCCAATGCCTTCACATCGTCACTTGGCA1921CTGCTGGAGTGATCATAGACCGCTTCGAGT1981AGTACAACCTGGMAGAGCCCAGAAGGCCG2041TAGGGCTCAAGACCMTGTCACTGACTATCSeqNO.6wcryL4/2基因的5'端序列1I|^|ttctagacccgggggatccatccta61AACMACMCATTACAATTACTATTTACMSeqNO.77WOjL4/z基因的改造區(qū)段77ATGAAGAACAGCA121AGAGGAAGTGGAGGTACTTCATGGAGATAG181ATTGCCTCAACAACCCCGAAATCGAGATCC241CCCCCATTGACATTTCGCTGTCACTTACTC301CGGGGTTTGTCCTTGGCCTAATCGACCTCA361ACGCATTTCTTGCGCAAGTGGAGCAGCTCA421ACACAGCCATCCAGGMCTGGAGGGAATGGTGAACAACCAGAATCAGTGCGTGCCTTACATCGAAGGCGGACGAATCTCCGTAGGCAATAAGTTCCTTCTCAGCGAGTTTGTCCCAGGTGTCTGGGGATTTGTAGGTCCTTCCCAGTGGGTCAACCAGAGGATCGCAGAAGCGGTCAGGACACGGGTCTACCGAACGTATGCGACTGCGTCAGAGCTTCGTGAAGCCCTTCGGACCCAGTGCATCTCGGTGCTCMGATTCAGACGTTCGCTGCCAATCTCCACTTGTCGTTGCTTCGCGTCTCC條ACCAGCGTGAACAACTACTACACCGACTATGCCGTTCGCTGGTACMTACCGGGGATTGGGTCAGGTACMCCAGTTCAGGATTGCGCTGTTTCCGAATTACGATTCGAGGCCACGGGAAATCTACACAAACCCAGTCTTAGCTCAGGGCATAGMCGTAGCATTCGGAGTCCGATCTATACCGATGCGCATAGGGGTTACTCGCCTGTCGGCTTCTCAGGTCCAGAGTTTACAGCTCCGCAGCAACGGATTGTTGCCCMCCTACGTTCTACCGGAGACCCTTCAACATAGACGGGACAGAG7TTGCCTATGGCACCTCCTGCGGAACTGTAGATTCCCTGGATGAGATCCAAGGCTTTAGCCATCGATTGAGCCATGTCTTCAGCATCATAAGAGCACCTATGTTCTCGTTCATTGCATCGGATAGCATTACGCMATCCGGTCTGTCATTTCAGGACCAGGCTTCACTGGCAATAACATTCAGAATAGAGGGTACATTGCCAGATACCGAGTTCGTGTTCGCTATGCCTGGGGTMTTCCTCCATTTTCTCCAACACAGTACAGTCTAGCGACTTCGGGTACTTCGAGAATATCGTTGGCGTCCGCAATTTCAGTGGGATCATTCCCGTTACTGCAACACTGGAGGCTGTGAATGCCCTGTTTACCTCTACAAACCAGCACATTGATTGATAAGGATCCTTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACTMCCTCAAACTCTCAGAGCTGTGGTATTTCAACGTGAACAACCAGAATCAGTGCGTGCCTTACATCGAAGGCGGACGAATCTCCGTAGGCAATAAGTTCCTTCTCAGCGAGTTTGTCCCAGGTGTCTGGGGATTTGTAGGTCCTTCCCAGTGGGTCAACCAGAGGATCGCAGAAGCGGTCAGGACACGGGTCTACCGAACGTATGCGACTGCGT22481TCGCTGAGTGGGAGMGGCTCCTGATGACC541TCACAGCAACGGAGACGTACATCTCAGGAC601AAGTACAGCTGCTATCAGTGTTTGCCCAAG661ACGTCGTGTTCTTTGGTCAACGCTGGGGTT721ACGACCTCACCGAAGGCATTAGCACGTATA781GACTCGAACGTGTCTGGGGACCGGATTCTC841GAGAGTTGACGCTCACTGTGTTGGACATCG901GCTATCCCATACGAACTGTTTCCCAACTCA961AGAACTTCGATGGCAGCTTCCGAGGCTCAG體CGCACTTGATGGATATACTGMCAGCATCA1081ACTACTGGTCAGGTCACCAAATCATGGCGT1141CCTTTCCGCTCTATGGCACGATGGGCAATG1201TAGGGCAGGGCGTGTATCGGACCTTGTCGT1261GCATCAACAACCAGCMCTCTCTGTGCTTG1321CCAATTTGCCGTCGGCTGTGTATCGCAAM1381CACCGCAGAACAACMCGTGCCACCGAGGC1441CCATGTTTCGGTCAGGCTCTACTAGCAGTG1501GGATTCATCGTAGTGCGGAGTTCAACMCA1561CTGCTGTGAAAGGCAACTTCCTGTTCAATG1621GTGGGGACTTAGTCCGATTGMCAGCAGTG讓AAGTTCCCATACACTTTCCGTCCACATCTA1741CTGTTACCCCGATTCACCTCMTGTCAACT1801TTCCAGCGACTGCGACCTCCCTGGACAACC讓GCGCCAATGCCTTCACATCGTCACTTGGCA1921CTGCTGGAGTGATCATAGACCGCTTCGAGT1981AGTACAACCTGGAAAGAGCCCAGAAGGCCG2041TAGGGCTCAAGACCMTGTCACTGACTATCCAGAGCTTCGTGAAGCCCTTCGGACCCAGTGCATCTCGGTGCTCAAGATTCAGACGTTCGCTGCCMTCTCCACTTGTCGTTGCTTCGCGTCTCCACGACCACCGTGAACAACTACTACACCGACTATGCCGTTCGCTGGTACAATACCGGGGATTGGGTCAGGTACAACCAGTTCAGGATTGCGCTGTTTCCGAATTACGATTCGiVGGCCACGGGMATCTACACAAACCCAGTCTTAGCTCAGGGCATAGAACGTAGCATTCGGAGTCCGATCTATACCGATGCGCATAGGGGTTACTCGCCTGTCGGCTTCTCAGGTCCAGAGTTTACAGCTCCGCAGCAACGGATTGTTGCCCMCCTACGTTCTACCGGAGACCCTTCAACATAGACGGGACAGAGTTTGCCTATGGCACCTCCTGCGGAACTGTAGATTCCCTGGATGAGATCCAAGGCTTTAGCCATCGATTGAGCCATGTCTTCAGCATCATAAGAGCACCTATGTTCTCGTTCATTCCATCGGATAGCATTACGCAAATCCGGTCTGTCATTTCAGGACCAGGCTTCACTGGCAATMCATTCAGAATAGAGGGTACATTGCCAGATACCGAGTTCGTGTTCGCTATGCCTGGGGTMTTCCTCCATTTTCTCCAACACAGTACAGTCTAGCGACTTCGGGTACTTCGAGAATATCGTTGGCGTCCGCAATTTCAGTGGGATCATTCCCGTTACTGCAACACTGGAGGCTGTGAATGCCCTGTTTACCTCTACMACCAGCACATTGA207權(quán)利要求1、一種人工合成的對(duì)鱗翅目害蟲表達(dá)高毒力蛋白的基因序列，其特征在于編碼區(qū)具有與SeqNo.2相似性達(dá)81％，且與SeqNo.2編碼相同氨基酸序列的核苷酸序列。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的基因序列，所述具有的核苷酸序列如SeqNo.3所示。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因序列，如SeqNo.4所示。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因序列，所述具有的核苷酸序列與SeqNo.3相似性為93M，且與SeqNo.3編碼相同氨基酸序列的核苷酸序列。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因序列，所述具有的核苷酸序列如SeqNo.7所示。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因序列，如SeqNo.5所示。7、包含權(quán)利要求l-6所述任一基因序列的植物表達(dá)載體。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的植物表達(dá)載體pUbi-mAh，其結(jié)構(gòu)如圖l所示。9、根據(jù)權(quán)利要求7所述的植物表達(dá)載體pCAMBIASlAh，其結(jié)構(gòu)如圖3所示。10、根據(jù)權(quán)利要求7所述的植物表達(dá)載體pCAMBIAUbi-mrAh,其結(jié)構(gòu)如圖5所示。11、權(quán)利要求7-10所述任一植物表達(dá)載體在轉(zhuǎn)化植物中的應(yīng)用。12、根據(jù)權(quán)利要求U所述的應(yīng)用，是指將pUbi-mAh轉(zhuǎn)化到玉米中，所述轉(zhuǎn)化方法指基因槍法、花粉管通道法。13、根據(jù)權(quán)利要求ll所述的應(yīng)用，是指將pCAMBIASlAh轉(zhuǎn)化煙草和甘藍(lán)，所述轉(zhuǎn)化方法指農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法。14、根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，是指將pCAMBIAUbi-mrAh轉(zhuǎn)化水稻，所述轉(zhuǎn)化方法指農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法。15、一種轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于該植物轉(zhuǎn)化的外源基因?yàn)闄?quán)利要求l-6所述的任一基因序列。16、一種轉(zhuǎn)基因微生物，其特征在于該微生物轉(zhuǎn)化的外源基因?yàn)闄?quán)利要求l-6所述的任一基因序列。17、權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因植物在表達(dá)具有SeqNo.l所示氨基酸序列的對(duì)鱗翅目害蟲有高毒力蛋白上的應(yīng)用。18、權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因微生物在表達(dá)具有SeqNo.l所示氨基酸序列的對(duì)鱗翅目害蟲有高毒力蛋白上的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供一種人工合成的對(duì)鱗翅目害蟲表達(dá)高毒力蛋白的基因序列及其在植物保護(hù)領(lǐng)域的應(yīng)用，屬于生物防治
技術(shù)領(lǐng)域：
。一種人工合成的對(duì)鱗翅目害蟲表達(dá)高毒力蛋白的基因序列，其特征在于編碼區(qū)具有與crylAh基因相似性達(dá)81％，且與crylAh基因編碼相同氨基酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明通過調(diào)整crylAh基因的核苷酸組成，使其接近植物基因的密碼子頻率而不改變編碼的氨基酸序列，將本發(fā)明獲得的基因序列構(gòu)建到適合的骨架載體中并轉(zhuǎn)化受體植物，使該基因序列得以在植物中表達(dá)，檢測(cè)結(jié)果顯示，陽性植株因表達(dá)了該基因而獲得對(duì)鱗翅目害蟲的抗性。文檔編號(hào)A01H1/00GK101358190SQ20081011931公開日2009年2月4日申請(qǐng)日期2008年9月3日優(yōu)先權(quán)日2008年9月3日發(fā)明者何康來,宋福平,杰張,束長(zhǎng)龍,梁革梅,郎志宏,黃大昉申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所