專利名稱：一種鹿x/y精子分離冷凍精液及其生產(chǎn)方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種哺乳動物X/Y精子分離技術(shù)，特別涉及一種鹿X/Y精子 分離冷凍精液及其生產(chǎn)方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
以家畜為主的冷凍精液、人工受精和體外受精技術(shù)廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)繁育和 生殖生物學(xué)研究。在正常情況下，鹿的子代繁育公母各占50%，但是在生產(chǎn)實 際中，為了提高鹿的養(yǎng)殖效應(yīng)，對于特定品系需要更多繁育母鹿(育種和擴群) 或公鹿(商品鹿茸生產(chǎn))，于是就需要通過分離精子來控制鹿的子代性別。此 外，分離后的精子在授精前通常需要冷凍保存，而各個物種的不同，其對于pH 值、冷凍緩沖液及冷凍處理方法的要求也不同，這對冷凍條件及其緩沖液提出 了較高的要求。CN1232231C公開了一種家畜X/Y精子分離的方法，該方法需要使用磷 酸緩沖溶液洗滌精液，通過流式細胞分離機分離，其速度為3000個/秒。然而， 使用該方法分離鹿的X/Y精子時，其分離速度、分離準確率、緩沖液使用、冷 凍保存后的精子活力等方面仍有較大提高空間。CN101112392A公開了一種底劑量家畜精液及其生產(chǎn)方法，該方法通過使 用冷凍平衡液A(Tris-A)和添加了甘油的冷凍平衡液B(Tris-B)來處理多種家畜 精液，通過多種動物精液生理特性研究，發(fā)現(xiàn)特定異種動物精子間的受精促進 效果。該方法需要添加異種家畜的精液，使用該方法單獨處理鹿的精子時，所 得到的鹿精子的數(shù)量和活力均不能達到理想產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的水平。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供鹿X/Y精子分離冷凍精液及其生產(chǎn)及方法和應(yīng)用，可 以將鹿X/Y精子分離，并實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用，從而控制鹿的子代性別。 本發(fā)明提供了一種鹿X/Y精子分離冷凍精液，包括冷凍平衡液A、冷凍平衡液B和鹿X或Y精子分離冷凍精液，其含量如下冷凍平衡液ATris-A 50%冷凍平衡液B含20M甘油冷凍保護劑的Tris-B50。/。，其中 鹿X或Y精子分離冷凍精液濃度為200-400萬精子/0.25mL。 上述冷凍平衡液A， pH6.8，由以下組分組成Tris三羥甲基氨基甲烷 檸檬酸291.7 mM95.1 mM70.2 mM20%由以下組分組成291.7 mM95.1 mM70.2 mM卵黃 20% 甘油 20% 超純水。本發(fā)明還提供了上述的鹿X/Y精子分離冷凍精液的生產(chǎn)方法，包括下述超純水；并且，所述冷凍平衡液B， pH6.8, Tris三羥甲基氨基甲垸步驟:1) 從健康的公鹿采集新鮮精液2-5mL (總精子數(shù)25-50億個)，由于鹿的 鮮精非常容易失去活力，因此需用TALP液保護。為抑制精液中細菌增殖用 TALP液等倍稀釋并添加適量抗生素(慶大霉素Gentamicin:0.8mg/mL，林可一 奇霉素Linco-spectin:0.3mg/mL)，在18-20X:條件下保溫，供X/Y精子分離使 用。每份新鮮精液在該條件下可使用6-8小時；2) 使用精子密度一活力儀檢測新鮮精液的濃度和活力，只有活力在80% 以上的樣品可用于分離處理。根據(jù)精液濃度折合體積取4億精子離心去除精漿， 添加10 u g/mL Hochest 33342在24。C溫水浴中染色30分鐘；3) 鹿X/Y精子分離的DNA差異設(shè)定為2.8-3.0。％，根據(jù)鹿XY精子DNA 含量差別設(shè)定流式細胞分離機參數(shù)(第一相區(qū)初取精子噴流總數(shù)的70%/第二 相區(qū)原精液死精率15X-X/Y單性精子分離取率40X)，通過流式細胞分離機 分離X和Y精子，使X/Y精子分離速度控制在4000-5000個/秒，X或Y精子分離純度達到85-95%;4) 根據(jù)分離精子累計顯示，取分離的X或Y精子2億，下機后以2000 轉(zhuǎn)/5分鐘進行離心處理，用冷凍平衡液A稀釋到最終設(shè)計濃度的2倍，在4-5 "C條件下放置60分鐘；5) 冷凍平衡液A平衡后，添加等量的含20%甘油冷凍保護劑的冷凍平衡 液B，在4"C冰箱平衡60分鐘；6) 把分離X或Y精液在4"C條件下裝入冷凍管，制成鹿X/Y精子分離冷 凍精液。7) 因為冷凍保護液的效果不同，進一步將步驟6)制得的鹿X/Y精子分 離冷凍精液裝入0.25mL冷凍管，置入-90。C的氮蒸汽中處理60分鐘，然后把 精液管投入液化氮中保存。上述鹿X/Y精子分離冷凍精液用于常規(guī)人工授精或手術(shù)人工授精方法，每 只受體一次可輸入200-400萬分離精子，按照生產(chǎn)需要定向繁育公犢或母犢； 或者，通過鹿X/Y精子分離冷凍精液生產(chǎn)性控胚胎，再進行胚胎移植加快優(yōu)良 個體的繁育速度。本發(fā)明應(yīng)用鹿X、 Y精子DNA含量的差異，通過流式細胞方式分離X和 Y精子，然后制成性別控制冷凍精液，以人工授精方式根據(jù)生產(chǎn)需要來控制鹿 產(chǎn)犢的性別。本發(fā)明的方法通過添加TALP液來保護鹿的鮮精，有效的保護了 其精子活力。其X/Y精子的分離速度可達4000-5000個/秒，分離效率高，使 用本發(fā)明的產(chǎn)品人工授精的受胎率能夠達到產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的水平，其產(chǎn)犢的性別 控制準確率可達88%以上。本發(fā)明的產(chǎn)品和方法能夠適用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和養(yǎng) 殖，從而大幅度提高鹿的養(yǎng)殖效應(yīng)。
具體實施方式
下面將結(jié)合具體實施方案對本發(fā)明的方法做更詳細的說明。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)當理解，下述實施例均用于對本發(fā)明所要求保護的范圍進行實例性的描 述，以此概括本發(fā)明的各參數(shù)的相對范圍，因而不能將之理解為對本發(fā)明的一 種具體限制。實施例1鹿Y冷凍精液的制作和人工授精控制產(chǎn)犢性別1) 從一只健康的馬鹿(鉆石1號)麻醉后，以電刺激法采集4mL、總精 子數(shù)為40億的新鮮精液，經(jīng)檢測，該精子活力為83%。由于鹿的鮮精非常容 易失去活力，因此需用TALP液保護。使用TALP液等倍稀釋并添加抗生素(慶 大霉素Gentamicin:0.8mg/mL，禾木可一奇霉素Linco-spectin:0.3mg/mL)后在 18-2(TC條件下保溫。使用精子密度一活力儀檢測新鮮精液的濃度和活力，經(jīng) 檢測，該精液的活力為85%，運回實驗室供X/Y精子分離使用6小時。2) 根據(jù)精液濃度折合體積取4X2億精子(供2臺精子分離機使用)離心 去除精漿，添加lOu g/mLHochest33342在24。C溫水浴中染色30分鐘。3) 鹿X/Y精子分離的DNA差異設(shè)定為2.8-3.0% ，根據(jù)鹿X、 Y精子DNA 含量差別設(shè)定精子流式細胞分離機(美國XY公司的SX-MoFlo流式細胞分離機) 參數(shù)(第一相區(qū)初取精子噴流總數(shù)的70%/第二相區(qū)原精液死精率15%=X/Y 單性精子分離取率40%)，通過流式細胞分離機分離X和Y精子，使X/Y精 子分離速度控制在4000-5000個/秒，Y精子分離純度達到85-95 % 。4) 根據(jù)分離精子累計顯示，取分離的Y精子2億，下機后以2000轉(zhuǎn)/5 分鐘進行離心處理，用顯微鏡一電腦精子記數(shù)法檢測分離精子濃度，用Tris-A(冷凍平衡液A)稀釋到最終設(shè)計濃度的2倍，在4-5X:條件下放置60分鐘； 其中，Tris-A (冷凍平衡液A) pH6.8，由以下組分組成Tris三羥甲基氨基甲垸 291.7 mM檸檬酸 95.1 mM果糖 70.2 mM卵黃 20% 超純水。5) Tris-A平衡后，添加等量的含20%甘油冷凍保護劑的Tris-B (冷凍平 衡液B)，在4"C冰箱平衡60分鐘；其中，Tris-B (冷凍平衡液B)， pH6.8，由以下組分組成Tris三羥甲基氨基甲烷 291.7 mM檸檬酸 95.1 mM果糖 70.2 mM卵黃 20%甘油 20%超純水。6) 分離Y精液在4"C條件下裝入0.25mL冷凍管，制成含200萬精子的鹿 性控冷凍精液；該樣品供2臺分離機使用6小時，制作鹿Y精子分離冷凍精液 68支。7) 因冷凍保護液的效果不同，將裝入0.25mL冷凍管的分離精液置入-90 "C的氮蒸汽中處理60分鐘；然后把冷凍管投入液化氮中保存。該鹿Y精子分離冷凍精液以手術(shù)人工授精方法(每只受體一次可使用200 萬精子)，授精處理母鹿68只，受胎38只，產(chǎn)犢35只(流產(chǎn)3只)，其中公 犢32只，性控準確率為92%。實施例2鹿X冷凍精液的制作和人工授精控制產(chǎn)犢性別1) 從一只健康的馬鹿(鉆石3號)麻醉后，以電刺激法采集3mL、總精 子數(shù)為24億的新鮮精液，經(jīng)檢測，精子活力為80%。由于鹿的鮮精非常容易 失去活力，因此需用TALP液保護。用TALP液等倍稀釋并添加抗生素(慶大 霉素Gentamicin:0.8mg/mL，才木可一奇霉素Linco-spectin:0.3mg/mL)后在18 — 2(TC條件下保溫。使用精子密度一活力儀檢測新鮮精液的濃度和活力，經(jīng)檢測， 該精液的活力為85% ，運回實驗室供X/Y精子分離使用4小時。2) 根據(jù)精液濃度折合體積取4X2億精子(供2臺精子分離機使用)離心 去除精漿，添加10 " g/mLHochest33342在24"溫水浴中染色30分鐘。3) 鹿X/Y精子分離的DNA差異設(shè)定為2.8-3.0%，根據(jù)鹿XY精子DNA 含量差別設(shè)定精子流式細胞分離機(美國XY公司的SX-MoFlo流式細胞分離機) 參數(shù)(第一相區(qū)初取精子噴流總數(shù)的70%/第二相區(qū)原精液死精率15。％=X/Y 單性精子分離取率40%)，通過流式細胞分離機分離X和Y精子，使X/Y精 子分離速度控制在4000-5000個/秒，X精子分離純度達到85-95% 。4) 根據(jù)分離精子累計顯示，取分離的X精子按2億，下機后以2000轉(zhuǎn)/5 分鐘進行離心處理，用顯微鏡一電腦精子記數(shù)法檢測分離精子濃度，用Tris-A(冷凍平衡液A)稀釋到最終設(shè)計濃度的2倍，在4-5。C條件下放置60分鐘； 其中，Tris-A (冷凍平衡液A) pH6.8，由以下組分組成Tris三羥甲基氨基甲烷 291.7 mM
擰檬酸 95.1 mM
果糖 70.2 mM
卵黃 20% 超純水。
5) Tris-A平衡后，添加等量的含12-20%甘油冷凍保護劑的Tris-B (冷凍 平衡液B)，在4。C冰箱平衡60分鐘；其中，Tris-B (冷凍平衡液B)， pH6.8，
由以下組分組成
Tris三羥甲基氨基甲烷 291.7 mM
檸檬酸 95.1 mM
果糖 70.2 mM
卵黃 20%
甘油 20% 超純水。
6) 分離X精液在4"C條件下裝入0.25mL冷凍管，制成含400萬精子的 鹿性控冷凍精液；該樣品供2臺分離機使用3小時，制作鹿X精子分離冷凍精 液28支。
7) 因冷凍保護液的效果不同，將裝入0.25mL冷凍管的分離精液置入-90 。C的氮蒸汽中處理60分鐘，然后把冷凍管投入液化氮中保存。
該鹿X精子分離冷凍精液以手術(shù)人工授精方法(每只受體一次可使用400 萬精子)，授精處理母鹿28只，受胎18只，產(chǎn)犢17只(流產(chǎn)1只)，其中母 犢15只，性控準確率為88%。
此外，也可以通過鹿X/Y分離冷凍精液生產(chǎn)性控胚胎，再進行胚胎移植加 快優(yōu)良個體的繁育速度。
本發(fā)明應(yīng)用鹿X、 Y精子DNA含量的差異，通過流式細胞方式分離X和 Y精子，然后制成性別控制冷凍精液，以人工授精方式根據(jù)生產(chǎn)需要來控制鹿 產(chǎn)犢的性別。本發(fā)明的方法分離效率高，所得到的產(chǎn)品其產(chǎn)犢的性別控制準確率 可達88%以上。本發(fā)明的產(chǎn)品和方法能夠適用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和養(yǎng)殖，從而大幅 度提高鹿的養(yǎng)殖效應(yīng)。
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權(quán)利要求
1.一種鹿X/Y精子分離冷凍精液，包括冷凍平衡液A、冷凍平衡液B和鹿X或Y精子分離冷凍精液，其含量如下冷凍平衡液A Tris-A 50％冷凍平衡液B 含20％甘油冷凍保護劑的Tris-B 50％，其中鹿X或Y精子分離冷凍精液濃度為200-400萬精子/0.25mL。
3.1) 采集公鹿新鮮精液2-5mL (總精子數(shù)25-50億個)，用TALP液等倍稀 釋并添加抗生素，在18-20。C條件下保溫；2) 檢測新鮮精液的濃度和活力，只有活力在80%以上的樣品可用于分離 處理，根據(jù)精液濃度折合體積取4億精子離心去除精漿，添加10嗎/mLHochest 33342在24'C溫水浴中染色30分鐘；3) 鹿X/Y精子分離的DNA差異設(shè)定為2.8-3.0% ，根據(jù)鹿X、 Y精子DNA 含量差別設(shè)定流式細胞分離機參數(shù)，通過流式細胞分離機分離X和Y精子， 使X/Y精子分離速度控制在4000-5000個/秒；4) 取分離的X或Y精子2億，下機后以2000轉(zhuǎn)/5分鐘進行離心處理， 用冷凍平衡液A稀釋到最終設(shè)計濃度的2倍，在4-5t:條件下放置60分鐘；5) 冷凍平衡液A平衡后，添加等量的含20%甘油冷凍保護劑的冷凍平衡 液B，在4'C冰箱平衡60分鐘；6) 把分離X或Y精液在4t:條件下裝入冷凍管，制成鹿X/Y精子分離冷 凍精液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述抗生素為慶大霉素 0.8mg/mL，林可一奇霉素0.3mg/mL。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3的所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述精子分離機參數(shù)為 第一相區(qū)初取精子噴流總數(shù)的70%/第二相區(qū)原精液死精率15%=)(/￥單性 精子分離取率40%。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3的所述的生產(chǎn)方法，進一步包括如下步驟將步驟6)制得 的鹿X/Y精子分離冷凍精液裝入0.25mL冷凍管，置入-9(TC的氮蒸汽中處 理60分鐘，然后把精液管投入液化氮中保存。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2的所述的鹿X/Y精子分離冷凍精液用于人工授精或生產(chǎn)性 控胚胎再進行胚胎移植。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的鹿X/Y精子分離冷凍精液用于人工授精或生產(chǎn)性控 胚胎再進行胚胎移植，其特征在于所述鹿X/Y分離冷凍精液人工授精劑 量為200-400萬精子/只或次。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鹿X/Y精子分離冷凍精液及其生產(chǎn)方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種鹿X/Y精子分離冷凍精液，包括冷凍平衡液A，含12％甘油冷凍保護劑冷凍平衡液B和鹿X或Y精子分離冷凍精液。本發(fā)明使用TALP液保護鹿的鮮精，并且應(yīng)用鹿X、Y精子DNA含量的差異，通過流式細胞方式分離X和Y精子，然后制成性別控制冷凍精液，其冷凍保存條件為-90℃處理60分鐘。本發(fā)明得到的冷凍精液用于以人工授精方式或胚胎移植方式控制鹿產(chǎn)犢的性別，分離效率高，性別控制準確率可達88％以上，適用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和養(yǎng)殖，從而大幅度提高鹿的養(yǎng)殖效應(yīng)。
文檔編號A01N1/02GK101322489SQ20081013535
公開日2008年12月17日 申請日期2008年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月1日
發(fā)明者劉樹江, 偉 孫, 李喜和, 王建國, 胡樹香, 董云祥, 錢松晉 申請人:內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團)股份有限公司