專利名稱：：落羽杉離體快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物的組織培養(yǎng)方法，尤其涉及落羽杉(rs;ra力'鵬力;"c力順)成熟胚離體快速繁殖方法，屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：落羽杉屬(&;ra力'順yic力.)有三個(gè)樹(shù)種，S卩落羽杉、池杉和墨西哥落羽杉；其中，落羽杉(rs;ro心"http://7Ai"c力哪)是古老的"孑遺植物"，在晚侏羅世至早白堊紀(jì)就已繁盛，第四紀(jì)冰川以后在歐亞大陸全部滅絕，僅在北美洲和拉丁美洲部分地區(qū)保留并繁衍至今。從樹(shù)木形態(tài)、生物學(xué)特性看，落羽杉是高大喬木，冠形雄偉秀麗，枝葉繁茂，落葉期遲，常年景觀優(yōu)美，很適合作景觀綠化之用。同時(shí)落羽杉主干明顯，從基部到頂部不分叉，圓滿通直，出材率高，材質(zhì)優(yōu)良，在美國(guó)有"永不腐朽之木"的稱號(hào)，為優(yōu)質(zhì)的用材造林樹(shù)種。落羽杉原分布區(qū)在美國(guó)東部至東南部，范圍跨度大，氣候從亞熱帶至溫帶，且長(zhǎng)期處于沼澤地帶，根系發(fā)達(dá)，在低、濕地帶干基部形成不規(guī)則板根狀，68齡時(shí)即會(huì)在根部向上長(zhǎng)出"根膝"，有呼吸、通氣、固著和貯藏養(yǎng)分等作用，具有很強(qiáng)的耐低溫、耐水淹、耐干旱、耐瘠薄能力，同時(shí)具有很強(qiáng)的抗污染和抗病蟲(chóng)害的能力。落羽杉屬樹(shù)種因其適應(yīng)性強(qiáng)，生長(zhǎng)快，樹(shù)形美，材質(zhì)優(yōu)良，病蟲(chóng)害少，可在我國(guó)(北緯40°)以南廣大地區(qū)作生態(tài)環(huán)境建設(shè)、用材綠化造林，江湖灘地，江河上、中游水源涵養(yǎng)等均可采用。目前，對(duì)于落羽杉的引種較少，對(duì)其種源變異、優(yōu)良種源及無(wú)性系的選育等，尚未見(jiàn)報(bào)道(汪企明等，落羽杉屬種源研究種子和苗期變異.江蘇林業(yè)科技，1993，(1)，1-4，3)。植物組織培養(yǎng)技術(shù)是利用細(xì)胞的全能性，采取植物體上的細(xì)胞團(tuán)或一塊組織，通過(guò)人為條件的控制，使這些組織形成千百萬(wàn)植株，并且保存了母本的全部?jī)?yōu)良性狀，且遺傳性狀穩(wěn)定。這種方法可在短期內(nèi)形成大量?jī)?yōu)良試管苗，進(jìn)行規(guī)?；⒐S化生產(chǎn)。許秀玉等公開(kāi)了一種墨西哥落羽杉離體培養(yǎng)及再生體系的建立方法，該方法以墨西哥落羽杉的幼苗為外植體，依次經(jīng)過(guò)不定芽的誘導(dǎo)、伸長(zhǎng)、增殖培養(yǎng)，壯苗的培養(yǎng)，不定根的誘導(dǎo)培養(yǎng)，再生植株形成和煉苗移栽等步驟，該方法的生根率可達(dá)78%，但移栽成活率比較低，約20%左右(許秀玉等，墨西哥落羽杉離體培養(yǎng)及再生體系的建立.林業(yè)科學(xué)，2007年10月，第43巻第10期)。迄今為止，有關(guān)落羽杉的離體快速繁殖方法尚未見(jiàn)報(bào)道。建立一種落羽杉的離體快速繁殖方法對(duì)于優(yōu)良種源快速選育、遺傳改良以及工廠化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的無(wú)菌苗等方面均具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種落羽杉的離體快速繁殖方法，該方法可以在短期內(nèi)形成大量?jī)?yōu)良落羽杉試管苗，可進(jìn)行規(guī)?；?、工廠化生產(chǎn)。本發(fā)明的技術(shù)方案是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的--種落羽杉的離體快速繁殖方法，包括以下歩驟(1)、將落羽杉的種子消毒后取其成熟胚作為外植體；(2)、將成熟胚接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；(3)、將巳分化出不定芽的胚外植體完整地繼代于不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)不定芽伸長(zhǎng)；(4)、將步驟(3)所培養(yǎng)的不定芽單個(gè)切下后轉(zhuǎn)入不定芽增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽增殖培養(yǎng)；(5)、將具有明顯主莖的小芽苗轉(zhuǎn)移至壯苗培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗培養(yǎng)；(6)、將經(jīng)過(guò)壯苗培養(yǎng)的芽苗轉(zhuǎn)至不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)不定根的發(fā)生；(7)、將形成不定根后的芽苗轉(zhuǎn)至再生植株培養(yǎng)基上進(jìn)行再生培養(yǎng)；(8)、煉苗移栽，即得。其中，上述離體快速繁殖方法中，歩驟(2)中所述的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為SH基本培養(yǎng)基+蔗糖30克/升+瓊脂6.5克/升，pH值為5.8;步驟(3)中所述的不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為大量元素減半的1/2SH基本培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(6-BA)5-6毫克/升+吲哚丁酸(IBA)5-6毫克/升+蔗糖30克/升+瓊脂6.5克/升，其pH值為為5.8;歩驟(4)中所述的不定芽增殖培養(yǎng)基為SH基本培養(yǎng)基+6-BA10-20毫克/升+IBA2-5毫克/升+萘乙酸(NAA)2-5毫克/升+蔗糖30克/升+瓊脂3.25_6.5克/升，該培養(yǎng)基為半固態(tài)，其PH值為5.8;所述的不定芽增殖培養(yǎng)基優(yōu)選為SH基本培養(yǎng)基+6-BA10毫克/升+IBA2毫克/升+NAA2毫克/升+蔗糖30克/升+瓊脂3.25克/升，該培養(yǎng)基為半固態(tài)，其pH值為5.8;步驟(5)中所述的壯苗培養(yǎng)基為SH基本培養(yǎng)基+活性炭l克/升+蔗糖30克/升+瓊脂6.5克/升，pH值為5.8;所述的壯苗培養(yǎng)基優(yōu)選為SH基本培養(yǎng)基+活性炭1克/升+蔗糖30克/升+瓊脂6.5克/升+硝酸銀8.0毫克/升，pH值為5.8;步驟(6)中所述不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為大量元素減半的1/2SH基本培養(yǎng)基+IBA20-25毫克/升+活性炭1克/升+蔗糖20克/升+瓊脂6.5克/升，pH值為5.8;步驟(7)中所述再生植株培養(yǎng)基為SH基本培養(yǎng)基+蔗糖30克/升+瓊脂6.5克/升，pH值為5.8。為了達(dá)到更好的技術(shù)效果，在將成熟胚接種到不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)之前，可將成熟胚按照以下方法進(jìn)行預(yù)處理，即將成熟胚在附加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA8-10毫克/升的SH液體培養(yǎng)基浸泡處理成熟胚8-36小時(shí)，優(yōu)選為24小時(shí)；由于胚在萌發(fā)初期對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收是由子葉進(jìn)行的，而在固體培養(yǎng)基上只有少數(shù)子葉接觸到培養(yǎng)基。與直接將成熟胚接種于附加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的固體培養(yǎng)基中相比，本發(fā)明通過(guò)用附加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA的SH液體培養(yǎng)基浸泡處理成熟胚有利于胚吸收培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，更有利于外植體誘導(dǎo)出更多的不定芽。作為一種更優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟(i)中將落羽杉的種子進(jìn)行消毒之前先將其在0-4'C低溫條件下保存一周，然后再按照以下方法進(jìn)行消毒處理用紗布包裹種子在自來(lái)水中沖洗l-3天，然后在無(wú)菌燒杯中用70%酒精浸泡，無(wú)菌蒸餾水沖洗2-3次后用0.1%升汞(HgCl2)表面滅菌，最后用無(wú)菌水沖洗6-8次；更優(yōu)選的用70%酒精浸泡種子1分鐘，用0.1%升汞表面滅菌的時(shí)間為10分鐘。步驟(2)和步驟(6)中所述的不定芽誘導(dǎo)和不定根誘導(dǎo)的培養(yǎng)優(yōu)選在以下條件進(jìn)行首先在溫度為25'C的黑暗條件下培養(yǎng)一周后再轉(zhuǎn)入光照為2000勒克斯的光照條件下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。步驟(3)、步驟(4)、步驟(5)和歩驟(7)中所述的不定芽伸長(zhǎng)、不定芽增殖、壯苗培養(yǎng)和再生植株培養(yǎng)優(yōu)選在以下條件進(jìn)行培養(yǎng)溫度為25°C，光照強(qiáng)度為2000勒克斯(lux)，光照時(shí)間為10-14小時(shí)/天。步驟(8)中所述的煉苗移栽優(yōu)選為移栽前逐漸打開(kāi)培養(yǎng)瓶的封口膜在光照培養(yǎng)室內(nèi)煉苗5-7天，然后將生根的小苗取出，用自來(lái)水洗去根部殘留的瓊脂培養(yǎng)基，移栽于裝有蛭石與泥碳土等比例混合的基質(zhì)的容器內(nèi)，每周澆一次SH基本培養(yǎng)基。本發(fā)明利用落羽杉成熟胚為外植體進(jìn)行離體快速繁殖，每個(gè)培養(yǎng)階段所采用的基本培養(yǎng)基都是SH基本培養(yǎng)基，由于SH培養(yǎng)基降低了NH/的濃度，大大提高了氨基酸和維生素的用量，與常用的MS基本培養(yǎng)基相比，采用SH基本培養(yǎng)基更有利于落羽杉的生長(zhǎng)。本發(fā)明中涉及的所有培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，皆是在各階段采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)后選擇的最適宜的用量及配比，重復(fù)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在不定芽增殖階段，本發(fā)明將不定芽轉(zhuǎn)入SH半固體培養(yǎng)基，置于70rpm的普通搖床中振蕩培養(yǎng)，可以使不定芽增殖系數(shù)擴(kuò)大10倍，同樣是因?yàn)橐后w、固體混合培養(yǎng)基增大了與外植體的接觸面積，更有利于不定芽吸收培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，同時(shí)有利于培養(yǎng)瓶與外界環(huán)境的通氣狀況。采用植物組織培養(yǎng)的方法繁殖落羽杉，不僅可以節(jié)約大量外匯，而且不受外界條件的限制，四季皆可進(jìn)行，節(jié)約育苗占地，降低生產(chǎn)成本。采用本發(fā)明培育的落羽杉試管苗生長(zhǎng)健壯，繁殖系數(shù)高，誘導(dǎo)生根率達(dá)到80%，移栽成活率高(達(dá)到90%左右)，是工廠化大規(guī)模生產(chǎn)落羽杉幼苗的簡(jiǎn)便、快捷的技術(shù)體系。圖1落羽杉不定芽的分化與伸長(zhǎng)。圖2落羽杉不定芽的增殖。圖3落羽杉在附加活性炭的培養(yǎng)基的培養(yǎng)。圖4落羽杉不定根的誘導(dǎo)。圖5落羽杉再生植株的形成。圖6落羽杉試管苗的主根外觀。圖7移栽后的落羽杉。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1一、試驗(yàn)材料1、成熟落羽杉種子來(lái)自于美國(guó)路易斯安娜州。2、培養(yǎng)基的配制(1)、"SH基本培養(yǎng)基"的組成或配制方法；表lSH培養(yǎng)基(SchenkandIIildebrandt，1972)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上述S11培養(yǎng)基母液配好后，儲(chǔ)存于4'C冰箱待用。根據(jù)配置培養(yǎng)基的數(shù)量，稱量所需瓊脂和蔗糖，將其倒入欲配培養(yǎng)基體積3/4的無(wú)菌水中，順序加入所需的大量元素母液、微量元素母液、鐵鹽母液和有機(jī)成分母液，每加入一種都充分?jǐn)嚢?，最后加水定容至培養(yǎng)基最終體積，用pH計(jì)測(cè)試培養(yǎng)基酸堿度，用0.lmolL—1的KOH或0.lmolL—1的HC1將pH值調(diào)整至5.8。(2)、成熟胚預(yù)處理液體培養(yǎng)基SH基本培養(yǎng)基添加6-BA8-10mg七—'，蔗糖20g七—'，不添加瓊脂，調(diào)節(jié)pH值為5.8，培養(yǎng)基在121'C下滅菌15rain。(3)、不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基SH基本培養(yǎng)基添加蔗糖至30克/升、添加瓊脂至6.5克/升，調(diào)節(jié)pH值為5.8;在121。C下滅菌15min。(4)、不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基大量元素減半的1/2SH基本培養(yǎng)基中添加6-BA至5-6毫克/升、添加iM至5-6毫克/升、添加蔗糖至30克/升、添加瓊脂至6.5亳克/升，調(diào)pH值為5.8;在121'C下滅菌15min。(5)、不定芽增殖培養(yǎng)基SH基本培養(yǎng)基添加6-BA至10毫克/升、添加IBA至2毫克/升、添加NAA至2毫克/升、添加蔗糖至30克/升、添加瓊脂至3.25克/升，該培養(yǎng)基為半固態(tài)，調(diào)pH值為5.8;在121'C下滅菌15min。(6)、壯苗培養(yǎng)基SH基本培養(yǎng)基，添加活性炭至l克/升，添加蔗糖至30克/升、添加瓊脂至6.5克/升，調(diào)pH值為5.8;在12rC下滅菌15min。(7)、不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基大量元素減半的1/2SH固體培養(yǎng)基，添加IBA至20-25毫克/升、添加活性炭至l克/升，添加蔗糖至20克/升、添加瓊脂至6.5克/升，調(diào)pH值為5.8;在12rC下滅菌15min。(8)、再生植株培養(yǎng)基SH基本培養(yǎng)基添加蔗糖至30克/升、添加瓊脂至6.5克/升，調(diào)pH值為5.8;在121。C下滅菌15min。3.培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件采用人工光照，封閉式培養(yǎng)室，光照強(qiáng)度為2000Lux,光照時(shí)間10-14htf1，溫度(25士2)。C。其中，不定芽的誘導(dǎo)和不定根的誘導(dǎo)是在25"C的黑暗條件下培養(yǎng)一周后再轉(zhuǎn)入光照強(qiáng)度為2000Lux的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；不定芽的伸長(zhǎng)培養(yǎng)、不定芽的增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)和再生植株培養(yǎng)均在以下條件下培養(yǎng)溫度為25'C、光照強(qiáng)度為2000Lux，光照吋間10-Mhd—'。二、試驗(yàn)方法將落羽杉成熟種子置于4"C冰箱低溫保存一周，接種前用紗布包裹種子在自來(lái)水中沖洗2天，然后在無(wú)菌燒杯中用70%酒精浸泡種子lmin，無(wú)菌蒸餾水沖洗2-3次，再用0.1%升汞(HgCl2)表面滅菌10min，期間輕輕搖動(dòng)燒杯使其充分接觸，無(wú)菌水沖洗6-8次。將處理好的種子放在無(wú)菌干燥的濾紙上吸取表面水分。在超凈工作臺(tái)用解剖刀小心剝除堅(jiān)硬的外種皮，剝除胚乳并去除胚根部分的成熟胚，備用；將所剝離的成熟胚浸泡在成熟胚預(yù)處理液體培養(yǎng)基中處理24h，然后用滅菌濾紙吸干表面水分；將預(yù)處理后的成熟胚平放于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面，置于25"C黑暗條件下培養(yǎng)一周再轉(zhuǎn)入光照強(qiáng)度為2000Lux的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；不定芽誘導(dǎo)20天后，胚外植體子葉、子葉基部、胚軸開(kāi)始有大量不定芽分化；將已分化出不定芽的胚外植體完整地繼代于不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度25匸，光照強(qiáng)度2000lux(日光燈照明)，光照時(shí)間10-14h.d—1;此階段不定芽在原外植體上伸長(zhǎng)，平均一個(gè)胚外植體可獲得9-12個(gè)長(zhǎng)勢(shì)旺盛、顏色嫩綠、具有明顯可辨莖段的不定芽(圖l);待不定芽長(zhǎng)至1.0-1.5cm長(zhǎng)時(shí)，將其逐一單個(gè)切下，轉(zhuǎn)入不定芽增殖的半固體培養(yǎng)基中，置于70rpm的普通搖床中處理30d進(jìn)行不定芽增殖，培養(yǎng)溫度25'C，光照強(qiáng)度2000lux(日光燈照明)，光照時(shí)間10-14h.d—1(圖2);待不定芽增殖出的新芽長(zhǎng)至1.0-1.5cm長(zhǎng)時(shí)，反復(fù)進(jìn)行此步驟操作，逐一單個(gè)切下1.0-1.5cm長(zhǎng)的不定芽，轉(zhuǎn)入新鮮的SH半固體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。平均每30d更換一次新鮮培養(yǎng)基。不定芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基30d后，每個(gè)伸長(zhǎng)的小枝葉腋有6-8個(gè)新芽產(chǎn)生，同時(shí)小枝基部被切割的部分膨大，有20-30個(gè)綠色突起。如此反復(fù)2-3個(gè)月可將不定芽的繁殖系數(shù)擴(kuò)大到80-IOO倍。為防止芽苗的玻璃化，將具有明顯主莖的小芽苗轉(zhuǎn)移至壯苗培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度25°C，光照強(qiáng)度2000lux的日光燈照明，光照時(shí)間10-14hd—、此階段芽苗的高生長(zhǎng)顯著，主莖平均30d生長(zhǎng)4-5cm(圖3);待優(yōu)質(zhì)芽苗的主干長(zhǎng)至8-10cm左右時(shí)，將芽苗轉(zhuǎn)至不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基，置于25'C黑暗條件下培養(yǎng)一周再轉(zhuǎn)入正常光照條件，誘導(dǎo)不定根的發(fā)生，誘導(dǎo)生根率達(dá)80%(圖4)。不定根形成后將芽苗轉(zhuǎn)至形成再生植株培養(yǎng)基，進(jìn)行根苗的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。培養(yǎng)溫度25°C，光照強(qiáng)度2000lux(円光燈照明)，光照時(shí)間10-14hd—'。30d后，發(fā)達(dá)的主根布滿玻璃瓶底部，主根肉質(zhì)、白色，長(zhǎng)達(dá)20-25cm，苗高生長(zhǎng)達(dá)12-18cm(圖5、圖6);將生長(zhǎng)健壯的再生植株的培養(yǎng)瓶封口膜在光照培養(yǎng)室內(nèi)于移栽前逐漸打開(kāi)，煉苗5-7d，然后將植株取出后，用水洗去根部殘留的瓊脂培養(yǎng)基，移栽于裝有蛭石與泥碳土等比例混合的基質(zhì)的容器內(nèi)。每周澆一次SH基本培養(yǎng)基。2個(gè)月后移栽成活率為90%左右(圖7)。實(shí)施例2除不定芽增殖培養(yǎng)基中所用6-BA至20毫克/升、IBA5毫克/升、添加NAA至5毫克/升，其余均與實(shí)施例l相同。實(shí)施例3除不定芽增殖培養(yǎng)基中所用瓊脂為6.5克/升，其余均與實(shí)施例1相同。實(shí)施例4除壯苗培養(yǎng)基中添加防褐劑硝酸銀8.0mg/L，其余均與實(shí)施例1相同。試驗(yàn)例1表2和表3分別給出了實(shí)施例1至4中不同培養(yǎng)基對(duì)不定芽增殖培養(yǎng)和壯苗培養(yǎng)階段落羽杉生長(zhǎng)的影響數(shù)據(jù)。表2不定芽增殖培養(yǎng)基對(duì)落羽杉不定芽增殖培養(yǎng)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表3壯苗培養(yǎng)基中防褐劑的添加對(duì)芽苗的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求1、落羽杉(Taxodiumdistichum)的離體快速繁殖方法，包括以下步驟(1)、落羽杉的種子消毒后取其成熟胚作為外植體；(2)、將落羽杉的成熟胚接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)不定芽；(3)、將已分化出不定芽的胚外植體完整地繼代于不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)不定芽伸長(zhǎng)；(4)、將步驟(3)所培養(yǎng)的不定芽切下后轉(zhuǎn)入到不定芽增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽增殖培養(yǎng)；(5)、將具有明顯主莖的小芽苗轉(zhuǎn)移至壯苗培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗培養(yǎng)；(6)、將經(jīng)過(guò)壯苗培養(yǎng)的芽苗轉(zhuǎn)至不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)不定根的發(fā)生；(7)、將形成不定根后的芽苗轉(zhuǎn)至再生植株培養(yǎng)基上進(jìn)行再生培養(yǎng)；(8)、煉苗移栽，即得。2、按照權(quán)利要求1所述的離體快速繁殖方法，其特征在于步驟(2)中所述的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是SH基本培養(yǎng)基+蔗糖30克/升+瓊脂6.5克/升，pH值為5.8;步驟(3)中所述的不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基是大量元素減半的1/2SH基本培養(yǎng)基+6-節(jié)氨基嘌呤5-6毫克/升+B引哚丁酸5-6毫克/升+蔗糖30克/升+瓊脂6.5克/升，其pH值為5.8。3、按照權(quán)利要求1所述的離體快速繁殖方法，其特征在于，步驟(4)中所述的不定芽增殖培養(yǎng)基是SH基本培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤10-20毫克/升+吲哚丁酸2-5毫克/升+萘乙酸2-5毫克/升+蔗糖30克/升+瓊脂3.25-6.5克/升，該培養(yǎng)基為半固態(tài)，其pH值為5.8;優(yōu)選的，所述的不定芽增殖培養(yǎng)基是SH基本培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤10毫克/升+吲哚丁酸2毫克/升+萘乙酸2毫克/升+蔗糖30克/升+瓊脂3.25克/升。4、按照權(quán)利要求1所述的離體快速繁殖方法，其特征在于，步驟(5)中所述的壯苗培養(yǎng)基為SH基本培養(yǎng)基+活性炭1克/升+蔗糖30克/升+瓊脂6.5克/升，pH值為5.8;優(yōu)選的，所述的壯苗培養(yǎng)基為SH基本培養(yǎng)基+活性炭1克/升+蔗糖30克/升+瓊脂6.5克/升+硝酸銀8.0毫克/升。5、按照權(quán)利要求1所述的離體快速繁殖方法，其特征在于步驟(6)中所述不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為大量元素減半的1/2SH基本培養(yǎng)基+吲哚丁酸20-25毫克/升+活性炭1克/升+蔗糖20克/升+瓊脂6.5克/升，pH值為5.8;步驟(7)中所述再生植株培養(yǎng)基為SH基本培養(yǎng)基+蔗糖30克/升+瓊脂6.5克/升，pH值為5.8。6、按照權(quán)利要求1所述的離體快速繁殖方法，其特征在于將落羽杉成熟胚接種到不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)之前，先將成熟胚按照以下方法進(jìn)行預(yù)處理將成熟胚在液體培養(yǎng)基中浸泡處理8-36小時(shí)；所述液體培養(yǎng)基是SH基本培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤8-10毫克/升+蔗糖20克/升。7、按照權(quán)利要求1所述的離體快速繁殖方法，其特征在于步驟(1)中將落羽杉種子進(jìn)行消毒之前先將種子在0-4'C低溫條件下保存一周，然后再按照以下方法進(jìn)行消毒處理用紗布包裹種子在自來(lái)水中沖洗1-3天，然后在無(wú)菌燒杯中用70%酒精浸泡，無(wú)菌蒸餾水沖洗2-3次后用0.1%升汞表面滅菌，最后用無(wú)菌水沖洗6-8次；優(yōu)選的，用70%酒精浸泡落羽杉種子的時(shí)間為1分鐘，用0.1%升汞表面滅菌的時(shí)間為10分鐘。8、按照權(quán)利要求1所述的離體快速繁殖方法，其特征在于步驟(2)和歩驟(6)中所述的不定芽的誘導(dǎo)和不定根的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為在25'C黑暗條件下培養(yǎng)7天后再轉(zhuǎn)入光照為2000勒克斯的光照條件下培養(yǎng)。9、按照權(quán)利要求1所述的離體快速繁殖方法，其特征在于步驟(3)、歩驟(4)、歩驟(5)和步驟(7)中所述的不定芽伸長(zhǎng)、不定芽的增殖、壯苗培養(yǎng)和再生植株培養(yǎng)均在以下條件下培養(yǎng)溫度為25"，光照強(qiáng)度為2000勒克斯，光照時(shí)間為10-14小時(shí)/天。10、按照權(quán)利要求1所述的離體快速繁殖方法，其特征在于步驟(8)中所述的煉苗移栽為移栽前打開(kāi)培養(yǎng)瓶的封口膜在光照培養(yǎng)室內(nèi)煉苗5-7天，然后將生根的小苗取出，用自來(lái)水洗去根部殘留的瓊脂培養(yǎng)基，移栽于裝有基質(zhì)的容器內(nèi)，每周澆一次SH基本培養(yǎng)基；所述的基質(zhì)由蛭石與泥碳土按照1:l的重量比例組成。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了落羽杉(Taxodium.distichum)的離體快速繁殖方法，屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域。本發(fā)明方法包括以下步驟(1)落羽杉種子消毒后取其成熟胚作為外植體，(2)不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)，(3)不定芽的伸長(zhǎng)培養(yǎng)，(4)不定芽的增殖培養(yǎng)，(5)壯苗的培養(yǎng)，(6)不定根的誘導(dǎo)培養(yǎng)，(7)形成再生植株，(8)煉苗移栽；其中，每個(gè)培養(yǎng)階段所采用的基本培養(yǎng)基都是SH培養(yǎng)基，各個(gè)培養(yǎng)階段所添加的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，皆是采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)后選擇的最適宜的用量及配比。本發(fā)明方法所培育的落羽杉試管苗生長(zhǎng)健壯，繁殖系數(shù)高，誘導(dǎo)生根率達(dá)到80％，移栽成活率達(dá)到90％左右，可進(jìn)行規(guī)?；?、工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號(hào)A01H4/00GK101347099SQ200810146948公開(kāi)日2009年1月21日申請(qǐng)日期2008年8月27日優(yōu)先權(quán)日2008年8月27日發(fā)明者曹福亮,朱燦燦,楊小虎,汪貴斌申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)