專利名稱：一種抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種的選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種家蠶品種的選育方法，更具體地說，是涉及一種采用分子標(biāo) 記輔助選擇法選育抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種的育種方法。
背景技術(shù)：
養(yǎng)蠶繅絲在我國已經(jīng)有五千多年的歷史，是我國最具特色的傳統(tǒng)優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)之 一，也是我國能夠主導(dǎo)國際市場的少數(shù)產(chǎn)品之一，目前，我國的蠶繭和生絲產(chǎn)量 均居世界第一，分別占世界總產(chǎn)量的75%左右。
蠶絲業(yè)不僅對增加農(nóng)民收入和擴(kuò)大勞動就業(yè)方面具有重要的作用，而且蠶的 食物-桑樹在環(huán)境保護(hù)、退耕還林等方面也具有重要的作用和意義，因此，許多 地區(qū)在生態(tài)保護(hù)和退耕還林中，把發(fā)展蠶桑業(yè)作為首選和重點(diǎn)項(xiàng)目。
家蠶新品種選育是蠶絲業(yè)科技進(jìn)步的基礎(chǔ)和核心之一，在新中國成立后，我 國的家蠶品種選育取得了巨大的成就，在全國范圍內(nèi)先后進(jìn)行了 4-5次蠶品種的 更新?lián)Q代，極大地促進(jìn)了蠶絲業(yè)的發(fā)展。然而，隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，勞動 力成本也隨之增加，環(huán)境污染尤其是氟化物污染嚴(yán)重危害蠶業(yè)生產(chǎn)，選育經(jīng)濟(jì)性 狀優(yōu)良，抗性強(qiáng)的家蠶品種已經(jīng)是迫在眉睫，也是穩(wěn)定蠶絲業(yè)的重要舉措之一。 隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，本課題組先后篩選了家蠶對濃核病鎮(zhèn)江株不感 染基因nsd-Z的SSR分子標(biāo)記(MuwangLi等，Genome， 2006， 49: 397-402) 和家蠶耐主基因Def的SSR分子標(biāo)記(白會釵等，蠶業(yè)科學(xué)，2008， 34: 191-196)。 到目前為止，還沒有該類型分子標(biāo)記用于家蠶輔助育種選擇，加速育種進(jìn)程的報(bào) 道。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是為了解決分子標(biāo)記用于家蠶輔助育種選擇的技術(shù) 問題，提供一種采用分子標(biāo)記輔助選擇法選育抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種的育種方 法。
3技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明的一種抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種的選 育方法，其技術(shù)方案包括如下步驟
(1)用全國廣泛推廣的菁松為輪回親本，多化性品種蘭10為抗?jié)夂瞬?yōu)質(zhì) 目標(biāo)性狀供體親本進(jìn)行雜交，得雜交1代；再用雜交1代與耐氟優(yōu)質(zhì)目標(biāo)性狀供 體親本T6雜交，獲得雜交2代；之后用輪回親本與雜交2代連續(xù)回交，獲得回 交6代；對每一世代在詞育過程中進(jìn)行農(nóng)藝性狀選擇，留種個(gè)體采用分子標(biāo)記選 擇其基因型，獲得遺傳背景與菁松相同，且對家蠶濃核病毒鎮(zhèn)江株不感染并全齡
耐氟100mg/kg的目標(biāo)材料JsFnsd-Z;
(2)用全國廣泛推廣的皓月為輪回親本，多化性品種蘭10為濃核病優(yōu)質(zhì)目 標(biāo)性狀供體親本進(jìn)行雜交，得雜交1代；再用雜交1代與耐氟優(yōu)質(zhì)目標(biāo)性狀供體 親本T6雜交，獲得雜交2代，之后用輪回親本與雜交2代連續(xù)回交，獲得回交 6代；對每一世代在飼育過程中進(jìn)行農(nóng)藝性狀選擇，留種個(gè)體采用分子標(biāo)記選擇 其基因型，獲得遺傳背景與菁松相同，且對家蠶濃核病毒鎮(zhèn)江株不感染并全齡耐 氟100mg/kg的目標(biāo)材料HyFnsd-Z;
(3)用目標(biāo)材料JsFnsd-Z與目標(biāo)材料HyFnsd-Z進(jìn)行雜交，獲得雜交1代， 即為抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種。
上述步驟(1)所述的菁松為中國系統(tǒng)；
上述步驟(2)所述的皓月為日本系統(tǒng)；
上述步驟(3)所述的抗?jié)夂瞬閷倚Q濃核病毒鎮(zhèn)江株不感染；所述的耐 氟為全齡耐氟100mg/kg。
有益效果本發(fā)明所提供的一種抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種的選育方法與傳統(tǒng) 的雜交回交育種技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)
傳統(tǒng)的雜交育種技術(shù)存在工作量大，選擇可靠性差，特別是對于抗性選育必 須累代或隔代添食病源或氟化物的方法來保證目標(biāo)性狀不丟失，不僅選育周期 長，而且在添食病源時(shí)有可能造成環(huán)境污染，而本發(fā)明通過分子標(biāo)記輔助選擇輪 回親本的遺傳背景和供體親本的目標(biāo)性狀，可在3-4年內(nèi)快速高效培育出高產(chǎn)、
優(yōu)質(zhì)、兼抗?jié)夂瞬〖澳头募倚Q新品系。
本發(fā)明方法育成的品種"JsFnsd-Z";
主要特征為，中系二化性四眠品種，幼蟲為素斑，蠶體粗壯，食桑旺盛，發(fā)
4育整齊，老熟齊涌，體質(zhì)強(qiáng)健，不感染濃核病鎮(zhèn)江株，全齡耐氟100mg/kg (桑 葉含氟量)。催青經(jīng)過10日，幼蟲期經(jīng)過23-24天，蛹期經(jīng)過14-15天，繭形橢 圓，繭色潔白，縮皺中等，全繭量1.8-2.0g，繭層率23%左右，繭絲長1300米 左右，解舒好。羽化集中，雄蛾活潑、交配性能好，雌蛾產(chǎn)卵性能良好，單蛾卵 數(shù)500-600粒，與HyFnsd-Z對交需推遲2日開始飼養(yǎng)。 育成的品種"HyFnsd-Z";
主要特征為，日系二化性四眠品種，幼蟲為普斑，蠶體粗壯，食桑旺盛，發(fā) 育整齊，老熟較齊，體質(zhì)強(qiáng)健，不感染濃核病鎮(zhèn)江株，全齡耐氟100mg/kg (桑 葉含氟量)。催青經(jīng)過10日，幼蟲期經(jīng)過24-25天，蛹期經(jīng)過15-16天，繭形淺 束腰，繭色潔白，縮皺中等，全繭量1.8-2.0g，繭層率23%左右，繭絲長1300 米左右，解舒好。羽化集中，雄蛾活潑、交配性能好，雌蛾產(chǎn)卵性能良好，單蛾 卵數(shù)500-600粒，與JsFnsd-Z對交需提前2日開始飼養(yǎng)。
具體實(shí)施例方式
一、對采用材料的說明
已有的研究結(jié)果表明，家蠶對濃核病鎮(zhèn)江株的不感染性由隱性單基因nsd-Z 控制(完全抵抗)，只有在基因純合情況下才能表現(xiàn)對濃核病鎮(zhèn)江株的不感染(完 全抵抗)(胡雪芳，錢元駿，王紅林.家蠶濃核病毒(DNV)對不同蠶品種的侵染 抵抗性.蠶業(yè)科學(xué)，1984， 10 (2): 87~90);家蠶對氟化物的耐受性由顯性主效 基因De/控制(耐氟閾值為200mg^g)(林昌麟,糜懿殿，姚勤,等.家蠶耐氟顯性 主效基因的發(fā)現(xiàn)，蠶業(yè)科學(xué)，1997 ，23(4) :237-239)，只要該基因存在，無論是雜 合型還是純合型，都表現(xiàn)出對氟化物的耐受性。
(—)、對濃核病鎮(zhèn)江株不感染親本家蠶品種蘭10 (公知公用，《中國家蠶 品種志》農(nóng)業(yè)出版社，1987年5月，第193頁)；
1、 來源中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所收集保存的家蠶品種，并通過國家經(jīng) 濟(jì)昆蟲資源平臺對外共享。
2、 主要特征特性中國系統(tǒng)、有滯育多化性四眠品種，幼蟲素斑，蠶體細(xì) 小，發(fā)育整齊，體質(zhì)強(qiáng)，老熟齊涌，多營上層繭。催青經(jīng)過10日，幼蟲期經(jīng)過 17日8小時(shí)，蛹期經(jīng)過12日，繭形束腰、淺束腰，繭色潔白，縮皺細(xì)，全繭量0.77g左右，繭層率11%左右，繭絲長343米左右，解舒良好，羽化集中，單蛾 產(chǎn)卵粒數(shù)300粒左右，對濃核病鎮(zhèn)江株不感染。
(二) 、家蠶耐氟親本品種T6 (公知公用，見參考文獻(xiàn)林昌麟,糜懿殿，姚 勤,等.家蠶耐氟顯性主效基因的發(fā)現(xiàn)，蠶業(yè)科學(xué),1997 ，23(4) :237-239)，
1、 來源中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院收集保存的家蠶品種，并對外合作共享。
2、 主要特征特性日本系統(tǒng)二化性四眠品種，幼蟲普斑，蠶體細(xì)長，食桑 快，發(fā)育整齊，體質(zhì)強(qiáng)，老熟齊涌，多營上層繭。催青經(jīng)過10日，幼蟲期經(jīng)過 26天左右小時(shí)，蛹期經(jīng)過15-16天，繭形長筒淺束，繭色白，縮皺中等，全繭量 1.6-1.8g，繭層率24%左右，羽化集中，單蛾產(chǎn)卵粒數(shù)500粒左右，高度耐氟(閾 值200mg/kg)。。
(三) 、輪回親本菁松、皓月 菁松X皓月是我國使用最為廣泛的一對家蠶雜交組合，它的產(chǎn)量高、絲質(zhì)優(yōu)、
體質(zhì)強(qiáng)健，但是對濃核病敏感并且耐氟能力差。
二、 具體實(shí)施步驟
(1) 、用菁松為輪回親本，蘭10為濃核病不感染基因供體，T6為耐氟主效 基因供體，用菁松與蘭10進(jìn)行雜交后，得其F1再與T6雜交，即(菁松X蘭IO) XT6,之后用菁松連續(xù)回交，飼育過程中對品種的農(nóng)藝性狀進(jìn)行綜合篩選，采 用分子標(biāo)記對目標(biāo)性狀進(jìn)行篩選，獲得遺傳背景與菁松相同，且對濃核病鎮(zhèn)江株 不感染并高度耐氟的JsFnsd-Z。
(2) 用皓月為輪回親本，蘭10為濃核病不感染基因供體，T6為耐氟主效 基因供體，用皓月與蘭10進(jìn)行雜交后，得其F1再與T6雜交，即(皓月X蘭IO) XT6，之后用皓月連續(xù)回交，飼育過程中對品種的農(nóng)藝性狀進(jìn)行綜合篩選，采 用分子標(biāo)記對目標(biāo)性狀進(jìn)行篩選，獲得遺傳背景與皓月相同，且對濃核病鎮(zhèn)江株 不感染并高度耐氟的HyFnsd-Z。
(3) 用JsFnsd-Z與HyFnsd-Z進(jìn)行雜交，獲得雜交1代，即為抗?jié)夂瞬〖?耐氟家蠶品種。
三、 對濃核病不感染基因及耐氟主基因的PCR的檢測 提取待檢測的家蠶蛾的基因組DNA，取20-50ng作模板，用與nsd-Z基因連鎖
的SSR標(biāo)記弓I物F10316和F10568進(jìn)行擴(kuò)增(2對引物均為公知公用，見文獻(xiàn)Muwang
6Li等，Linkage and mapping analyses of the densonucleosis non-susceptible gene nsd-Z in the silkworm Bombyx mori using SSR markers. Genome, 2006,49: 397-402);用與De堪因連鎖的SSR標(biāo)記引物S1214和S121201進(jìn)行擴(kuò)增(2對引物 均為公知公用，見文獻(xiàn)白會釵等，利用SSR標(biāo)記對家蠶耐氟基因進(jìn)行連鎖定位分 析蠶業(yè)科學(xué)，2008， 34: 191-196)。 F10316引物序列
左端引物序列5、-GCGATAAGACCGCCTATTGAAC-3、 右端引物序列5-GTGTATTAGGCACGAGAACTGACG-3、
F10568引物序列
左端引物序列5、- TCGTCCTACACTTGCGGGTT-3、 右端引物序列5- TGTTTCGTCAAGTCTGCTCGGT-3、
S121201引物序列-
左端引物序列5、-AGTTCTTGCTTGTTTCCGTTCT-3、 右端引物序列5- CGCCGTATGTATTTATTCCTCA -3、
S1214引物序列
左端引物序列5、-AATGGATGCGTGCCAGTTTG國3、 右端引物序列5- CGTTAGTTGCTCTACGCTTTTGG-3、
PCR反應(yīng)程序按照2篇文獻(xiàn)的程序95 °C變性3 min， 63 °C退火40 s， 72 °C 延伸1 min; 16個(gè)Touchdown循環(huán)，94 °C、 45 s，退火溫度依次遞減0.5°C直到 56 。C 40 s， 72 。C 1 min; 94 。C 40 s， 56 。C 40 s， 72 °C 1 min， 24個(gè)循環(huán)；72 0C 10 min。 PCR產(chǎn)物用eGene的HAD-GT12全自動毛細(xì)管核酸分析系統(tǒng)檢測。
回交過程中選擇的個(gè)體PCR產(chǎn)物經(jīng)HAD-GT12全自動毛細(xì)管核酸分析系統(tǒng) 檢測為2條帶的，為雜合型，證明該個(gè)體攜帶目標(biāo)基因，可以使用，淘汰與輪回 親本一致帶型的個(gè)體；
回交后自交的個(gè)體，經(jīng)檢測為與L10 (檢測抗?jié)夂瞬』?或T6 (檢測耐
7氟基因) 一致的純合型(一條帶)，表明該個(gè)體攜帶的目標(biāo)基因己經(jīng)純合，可以 使用，淘汰帶型與輪回親本相同及雜合型(2條帶)的個(gè)體。
權(quán)利要求
1、一種抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種的選育方法，其特征在于，包括如下步驟(1)用全國廣泛推廣的菁松為輪回親本，多化性品種蘭10為抗?jié)夂瞬?yōu)質(zhì)目標(biāo)性狀供體親本進(jìn)行雜交，得雜交1代；再用雜交1代與耐氟優(yōu)質(zhì)目標(biāo)性狀供體親本T6雜交，獲得雜交2代；之后用輪回親本與雜交2代連續(xù)回交，獲得回交6代；對每一世代在飼育過程中進(jìn)行農(nóng)藝性狀選擇，留種個(gè)體采用分子標(biāo)記選擇其基因型，獲得遺傳背景與菁松相同，且對家蠶濃核病毒鎮(zhèn)江株不感染并全齡耐氟100mg/kg的目標(biāo)材料JsFnsd-Z；(2)用全國廣泛推廣的皓月為輪回親本，多化性品種蘭10為濃核病優(yōu)質(zhì)目標(biāo)性狀供體親本進(jìn)行雜交，得雜交1代；再用雜交1代與耐氟優(yōu)質(zhì)目標(biāo)性狀供體親本T6雜交，獲得雜交2代，之后用輪回親本與雜交2代連續(xù)回交，獲得回交6代；對每一世代在飼育過程中進(jìn)行農(nóng)藝性狀選擇，留種個(gè)體采用分子標(biāo)記選擇其基因型，獲得遺傳背景與菁松相同，且對家蠶濃核病毒鎮(zhèn)江株不感染并全齡耐氟100mg/kg的目標(biāo)材料HyFnsd-Z；(3)將目標(biāo)材料JsFnsd-Z與目標(biāo)材料HyFnsd-Z進(jìn)行雜交，獲雜交1代，即為抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種的選育方法，其特 征在于步驟(1)所述的菁松為中國系統(tǒng)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種的選育方法，其特 征在于步驟(2)所述的皓月為日本系統(tǒng)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種的選育方法，其特 征在于步驟(1)、 (2)所述的連續(xù)回交為至少6次。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種的選育方法，其特 征在于步驟(3)所述的抗?jié)夂瞬閷倚Q濃核病毒鎮(zhèn)江株不感染；所述的耐 氟為全齡耐氟100mg/kg。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗?jié)夂瞬〖澳头倚Q品種的選育方法，該方法是以全國廣泛推廣的菁松(中系)、皓月(日系)為輪回親本，多化性品種蘭10為抗?jié)夂瞬?yōu)質(zhì)目標(biāo)性狀供體親本，T6為耐氟優(yōu)質(zhì)目標(biāo)性狀供體親本，用輪回親本與蘭10雜交得雜交1代再與T6雜交，獲得的子代與輪回親本連續(xù)回交，對每一世代在飼養(yǎng)過程中進(jìn)行個(gè)體選擇，選擇留種的個(gè)體采用分子標(biāo)記選擇其基因型，然后再自交純合6代以上，選育出2個(gè)兼抗?jié)夂瞬〖澳头募倚Q品種“JsFnsd-Z”和“HyFnsd-Z”。該品種具有體質(zhì)強(qiáng)健，對家蠶濃核病毒鎮(zhèn)江株不感染并全齡耐氟100mg/kg，耐氟性能比生產(chǎn)用品種菁松、皓月高50％以上，其經(jīng)濟(jì)性狀達(dá)到生產(chǎn)用品種水平。
文檔編號A01K67/04GK101427668SQ20081019525
公開日2009年5月13日 申請日期2008年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月31日
發(fā)明者侯成香, 孫平江, 張?jiān)氯A, 徐安英, 李木旺, 郭錫杰, 錢荷英 申請人:江蘇科技大學(xué)