專利名稱：：基因OsAAT1在控制水稻谷粒品質(zhì)中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種控制水稻谷粒品質(zhì)的基因^A477基因的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：水稻(0^加5加/w/L.)是我國(guó)主要糧食作物之一，稻米蛋白是人們膳食中重要的蛋白質(zhì)來源。隨著人民生活水平的不斷提高，稻米的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)日益受到人們的關(guān)注。水稻谷粒中的氨基酸水平和蛋白質(zhì)含量是決定水稻品質(zhì)的重要性狀之一。通過轉(zhuǎn)基因的方法，在水稻品種中花ll(來自與中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所的商業(yè)品種)中超量表達(dá)編碼葉綠體中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶^^M77基因，發(fā)現(xiàn)水稻谷粒中，氨基酸水平和蛋白質(zhì)含量都顯著提高。因此，在水稻中超量表達(dá)O^J77對(duì)于提高水稻的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)具有重要的意義。種子里的氨基酸含量直接決定了此品種的品質(zhì)優(yōu)劣。水稻是主要的糧食作物，也是人類補(bǔ)充蛋白質(zhì)的重要來源。在世界人口持續(xù)增長(zhǎng)的情況下，提高水稻種子中的氨基酸含量，對(duì)于緩解氨基酸供給方面的壓力有著十分重要的作用(Wang等，ActaAgronomicaSinica，2005，31:603-607)?，F(xiàn)階段，轉(zhuǎn)基因技術(shù)開始運(yùn)用于遺傳育種中，并且獲得了一些可喜的成果。Shaul和Galili報(bào)導(dǎo)，在轉(zhuǎn)基因煙草中發(fā)現(xiàn)了蘇氨酸的積累(Shaul和Galili，PlantPhysiol，1992，100:1157-1163)。Falco等人在轉(zhuǎn)基因大豆中提高了賴氨酸的含量(Falco等，Bio/Technology，1995，13:577-582)。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶是氮代謝中的關(guān)鍵酶，對(duì)氮代謝起作關(guān)鍵性作用，超量表達(dá)編碼這個(gè)酶的基因，很可能會(huì)提高種子里氨基酸的水平和蛋白質(zhì)的含量(Murooka等，JBiosciBioeng，2002，94:225-230)。2002年Murooka等人在擬南芥中超量表達(dá)了來源于大豆的A47基因，使得擬南芥的種子中游離氨基酸的含量顯著上升(Murooka等，JBiosciBioeng，2002，94:225-230)。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶是氮代謝途徑中一個(gè)重要的催化酶(Givan，Thebiochemistryofplants,1980，329-357)，在植物不同部位和生長(zhǎng)時(shí)期，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶都發(fā)200810197031.5說明書第2/15頁(yè)揮著重要的功能。在很多模式植物中，都發(fā)現(xiàn)了編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶同工酶的基因家族。并且這些同工酶在植物細(xì)胞中很多部位(例如胞質(zhì)，線粒體，葉綠體，質(zhì)體和乙醛酸體)中都有表達(dá)。在擬南芥中A47基因家族有5個(gè)成員(CoruzziandLast,BiochemistryandMolecularBiologyofPlants,2000，358-410;Coruzzi，TheArabidopsisbook,2003，1-17;Wilkie等，PlantMolBiol1995，27:1227-1233)，而在水稻中則有3個(gè)成員分別編碼位于葉綠體，胞質(zhì)和線粒體中的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的同工酶(Song等，DNARes,1996，3:303-310)。有報(bào)導(dǎo)表明，在小麥中定位在葉綠體和胞質(zhì)中的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶對(duì)于該酶的活性起決定性作用(Marcin和Andrzej，JApplGenet,2004，45:411-417)。.本發(fā)明在水稻品種中花11中，超量表達(dá)了編碼葉綠體中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的foA4W基因，提高了水稻米粉中氨基酸含量和蛋白質(zhì)含量。為水稻的品質(zhì)育種提供新的思路。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的技術(shù)缺陷，提供了一種控制水稻谷粒品質(zhì)的基因OsAATl的應(yīng)用。基因OsAATl在控制水稻谷粒品質(zhì)中的用途，在水稻中超量表達(dá)編碼葉綠體中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的OsAATl基因后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的種子中的氨基酸總含量為119.36rag/g'比其對(duì)應(yīng)的陰性植株的含量(102.84mg/g)提高了16.1%;轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的種子中的蛋白質(zhì)含量為71.06mg/g，比其對(duì)應(yīng)的陰性植株的含量(58.18mg/g)提高了22.2%。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明利用0sAAT1的基因組片段作為應(yīng)用基因，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因超量表達(dá)驗(yàn)證，將該基因轉(zhuǎn)入水稻品種中花11，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出在谷粒中氨基酸和蛋白質(zhì)含量極顯著提高的現(xiàn)象。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶能催化天冬氨酸生成天冬酰胺，對(duì)植物氮代謝有重要意義。申請(qǐng)人在NCBI網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上輸入"AspartateAminotransferase"和"rice",得到序列號(hào)為AY157306的一段編碼葉綠體中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的基因的DNA序列，在K0ME網(wǎng)站上，根據(jù)同源匹配，找到此基因的全長(zhǎng)cDNA序列。再到NCBI網(wǎng)站上，比對(duì)水稻全基因組序列，得到0sAAT1基因的全長(zhǎng)基因組序列OSAAT1全長(zhǎng)基因組序列為4367bp,全長(zhǎng)cDNA為726bp，編碼241個(gè)氨基酸。該基因包括4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。本發(fā)明是通過PCR方法，擴(kuò)增出feA477基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)，連接到超量表達(dá)載體pCAMBIA1301s上。再進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，在水稻品種中花ll中，超量表達(dá)這個(gè)基因，得到超量表達(dá)植株。在轉(zhuǎn)基因T2代植株中發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性植株種子中的氨基酸水平和蛋白質(zhì)含量都顯著高于陰性植株。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于-(1)本發(fā)明提供了一種控制水稻谷粒品質(zhì)的基因fl^^77的應(yīng)用。申請(qǐng)人在水稻品種中花ll中，超量表達(dá)編碼葉綠體中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的C^4乂77基因后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的種子中的氨基酸總含量為119.36mg/g，比其對(duì)應(yīng)的陰性植株的含量(102.84mg/g)提高了16.1%;轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的種子中的蛋白質(zhì)含量為71.06mg/g，比其對(duì)應(yīng)的陰性植株的含量(58.18mg/g)提高了22.2%。(2)本發(fā)明首次在水稻中超量表達(dá)一個(gè)影響水稻谷粒品質(zhì)的基因ft^力77。為水稻培育優(yōu)質(zhì)品種提供了新的思路，也為其它作物利用同源基因法提高品質(zhì)提供了理論支持。(3)本發(fā)明中應(yīng)用的基因可以為水稻等未谷類作物以及其它作物的營(yíng)養(yǎng)代謝研究提供支持。圖1為一種控制水稻谷粒品質(zhì)的基因OsAATl的應(yīng)用技術(shù)路線示意圖。圖2為載體pC旭BIA1301s結(jié)構(gòu)示意圖。圖2a是載體pCAMBIA1301結(jié)構(gòu)示意圖2b是在多克隆位點(diǎn)中，插入片段的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2c是改造后的載體pCAMBIA1301s的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為超表達(dá)轉(zhuǎn)化載體的結(jié)構(gòu)示意圖?？梢奜sAATl基因被35S啟動(dòng)子超表達(dá)。具體實(shí)施例方式天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶能催化天冬氨酸生成天冬酰胺，對(duì)植物氮代謝有重要意義。根據(jù)圖1的技術(shù)路線，申請(qǐng)人在NCBI網(wǎng)站(麗w.ncbi.nlm.nih.gov)上輸入"AspartateAminotransferase"和"rice"，得到序列號(hào)為AY157306的一段編碼葉綠體中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的基因的DNA序列，在K0ME網(wǎng)站上，根據(jù)同源匹配，找到此基因的全長(zhǎng)cDNA序列。再到NCBI網(wǎng)站上，比對(duì)水稻全基因組序列，得到&^477基因的全長(zhǎng)基因組序列。6M^77全長(zhǎng)基因組序列為4367bp，全長(zhǎng)cDNA為726bp,編碼241個(gè)氨基酸。該基因包括4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。本發(fā)明是通過PCR方法，以水稻品種中花11的總DNA為模板，擴(kuò)增得到包括了全長(zhǎng)fe^477基因編碼區(qū)4227bp的序列，把該片段連接到超表達(dá)載體質(zhì)粒pCAMBIA1301s(本實(shí)驗(yàn)改造的載體，能用于基因的超表達(dá)，后面詳細(xì)說明了改造過程)上，用農(nóng)桿菌(EHA105由澳大利亞C細(xì)BIA實(shí)驗(yàn)室提供)介導(dǎo)的方法，在水稻品種中花ll中超量表達(dá)0"J77基因。觀察轉(zhuǎn)基因植株后代(T2代)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出期望的性狀變化，即種子里氨基酸水平和蛋白質(zhì)含量顯著上升。以下實(shí)施例進(jìn)一步定義本發(fā)明，并描述了分離Os^!77基因，遺傳轉(zhuǎn)化，以及氨基酸水平和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法和該基因在水稻中的表達(dá)模式。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施事例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。實(shí)施例l:flft^77基因確定和序列的獲得在NCBI網(wǎng)站上輸入"aspartateaminotransferase"禾口"rice'，，搜索序列。根據(jù)NCBI網(wǎng)站上公布的序列，得到一段編碼葉綠體中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的基因的DNA序列。在日本KOME網(wǎng)站上，根據(jù)同源匹配，找到此基因的全長(zhǎng)cDNA序列。再到NCBI網(wǎng)站上，比對(duì)水稻全基因組序列，從而得到fts^(77基因的全長(zhǎng)基因組序列。實(shí)施例2:超量表達(dá)轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建根據(jù)基因的已知全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物，以水稻品種中花11的總DNA為模板，擴(kuò)增得到包括&A477基因全長(zhǎng)編碼區(qū)的4227bp片段。申請(qǐng)人擴(kuò)增6te/!/!77基因時(shí)，在引物上添加了SalI的酶切接頭，因此擴(kuò)增得到的片段可以用限制性核酸內(nèi)切酶Sail進(jìn)行酶切，然后連接到超表達(dá)載體pCAMBIA1301s上(本實(shí)驗(yàn)改造的載體，能用于基因的超表達(dá)，載體圖參見圖2),然后再用表3所示的引物對(duì)得到的克隆進(jìn)行測(cè)序，確定基因按正確的方向連接到pCAMBIA1301s載體上。超表達(dá)載體pCAMBIA1301s是本實(shí)驗(yàn)在載體pCAMBIA1301(來自澳大利亞一個(gè)公開報(bào)道和使用的質(zhì)粒)的基礎(chǔ)上改造得到的。首先把載體pCAMBIA1301，用多克隆位點(diǎn)最外端的兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶HindIII和EcoRI進(jìn)行酶切，去掉多克隆位點(diǎn)，再連接上一段包含C"MF35S啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和polyA終止子的序列，從而得到了可以運(yùn)用于基因超量表達(dá)的新載體pC旭BIA1301s。此載體包含GUS的報(bào)告基因和潮霉素的篩選基因。表l用于本發(fā)明的自行設(shè)計(jì)的引物名稱具體內(nèi)容左端引物(5'-3')GATTAACCACAATAGCAGTGACCT右端引物(5'-3')ATTAAACCACGTGATGGGTGT擴(kuò)增所得片段大小(bp)4227用途^r/M77基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)的擴(kuò)增實(shí)施例3:超量表達(dá)ftsA477的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)包含編碼葉綠體中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的0"J77基因的片段連接到載體pCAMBIA1301s上后，采用轉(zhuǎn)基因的方法，得到轉(zhuǎn)基因的水稻小植株，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因具體步驟如下將得到的正確克隆的質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌介(EHA105由澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室提供)導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系導(dǎo)入到水稻品種中花ll中，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、練苗移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌(EHA105)介導(dǎo)的水稻(粳稻亞種)遺傳轉(zhuǎn)化體系主要應(yīng)用Hiei等人報(bào)道的方法(參見Efficienttransformationofrice，<2r"<3ssdraL.，mediatedby4§ro63"er_z'"i77andsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA，1994，PlantJournal6:271-282)基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。本發(fā)明的遺傳轉(zhuǎn)化的主要步驟、培養(yǎng)基及其配制的方法如下所述(1)試劑和溶液縮寫本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表示如下6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-節(jié)基腺嘌呤);CN(Carbenicillin，羧節(jié)青霉素);KT(Kinetin，激動(dòng)素)；NAA(Napthaleneaceticacid,萘乙酸)；IAA(Indole-3-aceticacid,n引哚乙酸)；2,4-D(2，4-Dichlorophe麗yaceticacid，2,4-二氯苯氧乙酸);AS(Acetosringone,乙酰丁香酮);CH(CaseinEnzymaticHydrolysate，水解酪蛋白);HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(DimethylSulfoxide,二甲基亞砜);N6麗(N6大量元素成分溶液);N6mix(N6微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)(2)溶液配方1)N6培養(yǎng)基大量元素母液(按照10倍濃縮液(10X)配制)硝酸鉀(KN0:,)28.3克磷酸二氫鉀(KH2P04)4.0克硫酸銨((NH4)2S0,,)4.63克硫酸鎂(MgS047H20)1.85克氯化鈣(CaCl_,2H20)1.66克將上述試劑逐一溶解，然后用蒸餾水定容至1000毫升。2)N6培養(yǎng)基微量元素母液(按照100倍濃縮液(100X)配制碘化鉀(KI)0.08克硼酸(H..,BO:,)0.16克硫酸錳(MnS044H20)0.44克硫酸鋅(ZnS047H20)0.15克將上述試劑在20-25攝氏度下溶解并用蒸餾水定容至1000毫升。3)鐵鹽(F&EDTA)貯存液(按照100X濃縮液配制)將3.73克乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA2H20)和2.78克FeS(V7H20分別溶解，混合并用蒸餾水定容至1000毫升，至70'C溫浴2小時(shí)，4"保存?zhèn)溆谩?)維生素貯存液(按照100X濃縮液配制)煙酸(Nicotinicacid)0.l克維生素B1(ThiamineHC1)0.l克維生素B6(PyridoxineHC1)0.l克甘氨酸(Glycine)0.2克肌醇(Inositol)10克加蒸餾水定容至1000毫升，4'C保存?zhèn)溆谩?)MS培養(yǎng)基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X濃縮液配制)硝酸銨(NH4N0:,)16.5克硝酸鉀19.0克磷酸二氫鉀1.7克硫酸鎂3.7克氯化鈣4.4克將上述試劑在20-25。C溫度下溶解，并用蒸餾水定容至1000毫升。6)MS培養(yǎng)基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X濃縮液配制)硫酸錳(MnS044H20)2.23克硫酸鋅(ZnS04'7&0)0.86克硼酸(H,BO:,)0.62克碘化鉀(KI)0.083克鉬酸鈉(Na2Mo042H20)0.025克硫酸銅(CuS045H20)0.0025克氯化鈷(CoCl2'6H20)0.0025克將上述試劑在20-25。C溫度下溶解，并用蒸餾水定容至1000毫升。7)2,4-D貯存液(l毫克/毫升)的配制秤取2,4-DIOO毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解完全后定容至100毫升，于20-25。C溫度下保存。8)6-BA貯存液(l毫克/毫升)的配制秤取6-BAIOO毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解完全后定容至100毫升，20-25'C溫度保存。9)萘乙酸(NAA)貯存液(l毫克/毫升)的配制秤取NAA100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解完全后定容至100毫升，4'C保存?zhèn)溆谩?0)吲哚乙酸(IM)貯存液(l亳克/毫升)的配制秤取IAA100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解完全后定容至100毫升，4'C保存?zhèn)溆谩?1)葡萄糖貯存液(0.5克/毫升)的配制秤取葡萄糖125克，然后用蒸餾水溶解定容至250毫升，滅菌后4'C保存?zhèn)溆谩?2)AS貯存液的配制秤取ASO.392克，加入DMSOIO毫升溶解，分裝至l.5毫升離心管內(nèi)，4。C保存?zhèn)溆谩?3)1N氫氧化鉀貯存液秤取氫氧化鉀5.6克，用蒸餾水溶解定容至IOO毫升，20-25'C溫度保存?zhèn)溆谩?3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6max母液(取巳經(jīng)制備好的10X濃縮液，下同)IOO毫升N6mix母液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同)IO毫升Fe2+EDTA貯存液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同)IO毫升維生素貯存液(取己經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同)IO毫升2，4-D貯存液(取上述制備好的)2.5毫升脯氨酸(Proline)0.3克CH0.6克蔗糖30克Phytagel3克加蒸餾水至900毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常規(guī)方法滅菌G2rC下滅菌25分鐘，下述的培養(yǎng)基滅菌方法與本培養(yǎng)基的滅菌方法相同)。2)繼代培養(yǎng)基N6max母液(10X)N6mix母液(100X)Fe2+EDTA歸液(100X)維生素貯存液(100X)2，4-D貯存液脯氨酸CHIOO毫升IO毫升IO亳升IO毫升2.0毫升0.5克0.6克蔗糖t30克Phytagel3克加蒸餾水至900毫升，lN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9,煮沸并定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法滅菌。3)預(yù)培養(yǎng)基N6麗母液(10X)N6mix母液(100X)Fe2+EDTA貝亡存液(100X)維生素貯存液(100X)2,4-D貯存液CH蔗糖瓊脂粉12.5毫升1.25毫升2.5毫升2.5毫升0.75毫升0.15克5克1.75克加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25毫升/皿)。4)共培養(yǎng)基N6max母液(10X)12.5毫升N6mix母液(100X)1.25毫升Fe2+EDTAC存液(100X)2.5毫升維生素貯存液(100X)2.5毫升2，4-D貯存液0.75毫升CH0.2克蔗糖5克瓊脂粉1.75克加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25毫升/每皿)。5)懸浮培養(yǎng)基N6max母液(10X)5毫升N6mix母液(100X)0.5毫升Fe2+EDTA貯存液(100X)0.5毫升維生素貯存液(100X)l毫升2,4-D貯存液0.2毫升CH0.08克蔗糖2克加蒸餾水至100毫升，調(diào)節(jié)pH值到5.4，分裝到兩個(gè)100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法滅菌。使用前加入l毫升無菌葡萄糖貯存液和100微升ASC:存液。6)選擇培養(yǎng)基N6max母液(10X)25毫升N6mix母液(100X)2.5毫升Fe2+EDTA貯存液(100X)2.5毫升維生素貯存液(100X)2.5毫升2，4-D貯存液0.625毫升CH0.15克蔗糖7.5克瓊脂粉1.75克加蒸餾水至250毫升，調(diào)節(jié)pH值到6.0，封口，按上述方法滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(250毫克/毫升)分裝倒入培養(yǎng)皿中(25毫升/皿)。(注第一次選擇培養(yǎng)基羧芐青霉素濃度為400毫克/升，第二次及以后選擇培養(yǎng)基羧節(jié)青霉素濃度為250毫克/升)。7)預(yù)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X)25毫升N6mix母液(100X)2.5毫升Fe2+EDTA貯存液(100X)2.5毫升維生素貯存液(100X)2.5毫升6-BA貯存液0.5毫升KT貯存液0.5毫升NAA貯存液50微升IAA貯存液50微升CH0.15克蔗糖7.5克瓊脂粉1.75克加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，封口，按上述方法滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克/毫升)，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25毫升/皿)。8)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X)IOO毫升N6raix母液(100X)IO毫升Fe2+EDTA|￡存液(100X)IO毫升維生素貯存液(100X)IO毫升6-BA貯存液2毫升KT貯存液2毫升NAA貯存液0.2毫升IAA貯存液0.2毫升CHl克蔗糖30克Phytagel3克加蒸餾水至900毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6.0。煮沸并用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法滅菌。9)生根培養(yǎng)基MSmax母液(10X)50毫升MSmix母液(100X)5毫升Fe2+EDTAfc存液(100X)5毫升維生素貯存液(100X)5毫升蔗糖20克Phytagel3克加蒸餾水至900毫升，用1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.8。煮沸并用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法滅菌。(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟(EHA105由澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室提供)3.l愈傷誘導(dǎo)1)將成熟的中花11水稻種子去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分鐘，0.15%氯化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；2)用滅菌水洗種子4-5次；3)將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；4)將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25土rC。3.2愈傷繼代挑選亮黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25士rc。3.3預(yù)培養(yǎng)挑選緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25士rc。3.4農(nóng)桿菌培養(yǎng)1)在帶有對(duì)應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基(LA培養(yǎng)基的配制參照J(rèn).薩姆布魯克等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學(xué)出版社，2002，北京)上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌^朋705(該菌株來自CAMBIA公司公開使用的農(nóng)桿菌菌株)兩天，溫度28°C;2)將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28'C搖床上培養(yǎng)2-3小時(shí)。3.5農(nóng)桿菌侵染1)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅好菌的瓶子內(nèi)；2)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD,0.8-1.0;3)將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；4)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20°C。3.6愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)1)滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；2)浸泡在含400毫克/L羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；3)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；4)轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)2-3次，每次2周。3.7分化1)將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上于黑暗處培養(yǎng)5-7天；2)轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26'C。3.8生根1)剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根；然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26°C。3.9移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最初的幾天保持水分濕潤(rùn)。轉(zhuǎn)化粳稻品種中花ll，得到轉(zhuǎn)基因單株L代植株。用southern檢測(cè)拷貝數(shù)，用northern檢測(cè)基因在植物體內(nèi)的表達(dá)量。得到單拷貝、超表達(dá)的植株，并且進(jìn)行繁殖，得到T,和T2代轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)施例4:超表達(dá)OsW7V的轉(zhuǎn)基因植株的功能鑒定測(cè)定T,代轉(zhuǎn)基因植株種子里氨基酸水平和蛋白質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)T,代轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株相比，表現(xiàn)出期望的表型變化，即種子里氨基酸水平和蛋白質(zhì)含量顯著高于對(duì)照。同時(shí)測(cè)定了T2代轉(zhuǎn)基因植株種子里氨基酸水平和蛋白質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)T2代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株和其對(duì)應(yīng)的陰性植株相比，也表現(xiàn)出期望的表型變化。這同時(shí)也證明了這個(gè)基因可以通過遺傳轉(zhuǎn)化來改良水稻品質(zhì)。1、氨基酸含量的測(cè)定方法樣品預(yù)處理方法采用的是鹽酸水解法，其步驟如下1.米粉必須粉碎60-80目篩，以保證取樣均勻和水解效果。2.稱樣量控制50-100毫克，將樣品送入水解管底部，稱量并記錄。天平要求為1/10000天平。153.用可調(diào)定量加液器向已裝有樣品的水解管中加入6-8毫升的6mol/L的鹽酸，注意先加入0.5毫升左右浸濕。4.抽真空減壓,使丁烷噴燈能灼燒封口。5.ll(TC烘箱中水解22小時(shí)。6.水解管中液體搖勻，濾紙(llcm*llcm)過濾于50毫升容量瓶中并用雙蒸水定容至50毫升。此步驟一定要注意潤(rùn)洗水解管三次以上，并每次濾紙上的水已過濾至容量瓶后再加水過濾，保證水解管及濾紙上不殘留氨基酸。7.搖勻后取l毫升于塑料離心管中，凍干機(jī)真空濃縮4-6小時(shí)至近干燥狀態(tài)。此步驟也可用其它儀器代替，只需要達(dá)到真空干燥就行。8.加入1毫升0.02mol/L的鹽酸于離心管中震蕩均勻。9.14000rpm/min離心15分鐘，吸上清液0.8毫升于自動(dòng)進(jìn)樣瓶，氨基酸測(cè)定儀(L-8800HITACHI)上機(jī)測(cè)定，機(jī)測(cè)結(jié)果為ml。計(jì)算公式lmg米粉氨基酸含量=1111/20*1000*50ng=2.5ml嗎2、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法取100mg左右已過100目篩的精米粉入指形管中，置105'C烘箱中烘一小時(shí)后置干燥器中冷卻30分鐘，再將指形管中的樣品送入消化管中，利用差減法得出樣品質(zhì)量，加入O.1克左右固體催化劑(將硫酸鉀、硫酸銅、硒粉按質(zhì)量比100:10:1混合磨勻過80目篩)、lmL蒸餾水及2mL濃硫酸放置一夜炭化，第2天置紅外消化爐(DigiPREPHTSCP)380。C消化80min,直到消化液清亮，將消化液NH4濃度稀釋至lmg/L-10mg/L的濃度范圍，取5mL于流動(dòng)分析儀(IntegralFuturaversionIIALLIANCE.)進(jìn)樣管，上機(jī)測(cè)試，將測(cè)定的NH4濃度折算成N含量，再乘以系數(shù)5.95折算成該樣品蛋白質(zhì)含量(Sotelo等，CerealChem，1990，67(2):209-212)。表2本發(fā)明克隆的feA477基因轉(zhuǎn)基因T2單株的表現(xiàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注釋"表示T2代陽(yáng)性和陰性植株性狀間差異t測(cè)驗(yàn)的概率值，在1%水平顯著差異。權(quán)利要求1、一種基因OsAAT1在控制水稻谷粒品質(zhì)中的用途。全文摘要本發(fā)明公開了一種基因OsAAT1在控制水稻谷粒品質(zhì)中的用途，利用OsAAT1的基因，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因超量表達(dá)，將該基因轉(zhuǎn)入水稻品種中，得到編碼葉綠體中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的基因的DNA序列，根據(jù)同源匹配，找到此基因的全長(zhǎng)cDNA序列。得到OsAAT1基因的全長(zhǎng)基因組序列。該基因包括4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。通過PCR方法，擴(kuò)增出OsAAT1基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)，連接到超量表達(dá)載體pCAMBIA1301s上。再進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，在水稻品種中，超量表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因T₂代植株中發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性植株種子中的氨基酸水平和蛋白質(zhì)含量都顯著高于陰性植株。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的種子中的氨基酸總含量為119.36mg/g，比其對(duì)應(yīng)的陰性植株的含量提高了16.1％；轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的種子中的蛋白質(zhì)含量為71.06mg/g，比其對(duì)應(yīng)的陰性植株的含量提高了22.2％。文檔編號(hào)A01H5/00GK101386867SQ20081019703公開日2009年3月18日申請(qǐng)日期2008年9月19日優(yōu)先權(quán)日2008年9月19日發(fā)明者瑩周,張啟發(fā),練興明申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)