專利名稱：：基因OsPT2在控制磷酸鹽吸收轉運中的用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及植物基因工程
技術領域：
。具體涉及一種控制磷酸鹽吸收的基因&，/57^的應用。
背景技術：
：水稻(PryzasarivaL.)是我國主要糧食作物之一。磷是植物生長所必需大量營養(yǎng)元素之一，磷元素對水稻優(yōu)質高產具有重要意義。通過轉基因的方法，在水稻品種合江19中超量表達編碼磷酸鹽轉運蛋白的^尸7^基因，發(fā)現水稻有效磷和全磷濃度都顯著提高。因此，在水稻中超量表達0s尸7^對于提高水稻磷元素的吸收具有重要的意義。磷是植物生長所必需的17種大量營養(yǎng)元素之一，植物體內的磷占干重的0.05%到0.5%。磷不僅是細胞分子諸如ATP、核酸、磷脂的重要組成成分，而且也在許多新陳代謝過程中起到關鍵性的調節(jié)作用，這些過程包括能量轉移、蛋白質活化及碳和氨基酸代謝(Marschner，1995)。磷元素對水稻優(yōu)質高產具有重要意義，然而土壤有效磷的缺乏是全世界范圍所面臨的共同問題。我國土壤全磷含量大部分在200110(Hig/g之間變化(熊毅，1987)。土壤全磷含量只表明土壤的磷素貯備，它和土壤對作物的供磷能力相關不大。在土壤中，磷素因為吸附、沉積和轉變?yōu)橛袡C磷等原因致使80。/。以上的磷不能被植物體直接利用(Danieletal.，1998)。世界上，13.19億公頃耕地中約43%土壤缺磷(Abdson,1999)，我國更為嚴重，約2/3的耕地缺磷。植物主要通過根部對土壤中磷的吸收來獲得生長發(fā)育所需要的磷，然而大部分土壤中有效磷的濃度很低，約21iM左右(Raghothama,1999)，不超過10pM(Bieleski，1973),因此只有通過向土壤中不斷施用磷肥，作物才能獲得或維持高產。然而磷是不可再生資源，據Raghothama等(1999)統(tǒng)計，世界磷礦資源只能維持6090年，因而人類正面臨著地球磷資源不斷枯竭的局面。磷肥的大量施用，會造成水體的富營養(yǎng)化，破壞生態(tài)環(huán)境。因此，植物挖掘自身的潛力，充分活化和利用潛在磷，是自身進行磷饑餓拯救的重要機制。如果利用遺傳育種的途徑引種或選育磷高效的基因型(即在低磷土壤上能獲得較高產量的作物基因型)，不僅能有效的提高作物產量，還能克服傳統(tǒng)施肥方法中由于過量使用化肥造成的環(huán)境污染問題(嚴小龍等，1992)。所以，研究植物耐低磷脅迫特性并對其進行遺傳改良意義重大。本發(fā)明在水稻品種合江19中，超量表達了編碼磷酸鹽轉運蛋白的fo尸W基因，提高了水稻的有效磷和全磷濃度，為水稻的品質育種提供新的思路。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是在于提供了一種基因09尸7^在控制磷酸鹽吸收轉運中的用途，發(fā)現并證明了一個對控制水稻吸收磷酸鹽具有重要作用基因OsPT2的功能。在水稻中超量表達編碼磷酸鹽轉運蛋白的OsPT2基因后，發(fā)現正常營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下，陽性植株對磷酸鹽的吸收最大吸收速率為94nmol/g/min，極顯著高于陰陰性對照的23.2nmol/g/min，是陰性植株的4.05倍。陽性植株地上部和地下部中的有效磷水平和全磷水平都顯著高于陰性植株轉基因陽性植株中地上部的有效磷濃度為8.3mgPi/gFW，是其對應的陰性植株濃度的5.5倍；轉基因陽性植株中地下部的有效磷濃度為1.8mgPi/gFW，是其對應的陰性植株濃度的2倍。發(fā)現轉基因陽性植株中地上部的全磷濃度為38.5mgP/gDW，是其對應的陰性植株濃度的4倍；轉基因陽性植株中地下部的全磷濃度為16.5mgP/gDW，是其對應的陰性植株濃度的1.5倍。本發(fā)明是這樣實現的本發(fā)明利用OsPZ2的基因組片段作為應用基因，進行轉基因超量表達驗證，將該基因轉入水稻品種合江19，轉基因植株表現出在有效磷水平和全磷水平極顯著提高的現象。磷酸鹽轉運蛋白負責植物體內磷酸鹽的吸收和轉運，對植物磷元素代謝有重要意義。申請人在NCBI網站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上輸入"0sPT2"和"rice"，得到序列號為AF536962的一段編碼磷酸鹽轉運蛋白的基因的DNA序列，在softberry網站上，預測全長0RF，從而得到ft^7^基因的全長基因組序列?；?Ti"全長基因組序列為1587bp，全長cDNA為1587bp，編碼528個氨基酸。該基因包括1個外顯子而無內含子。本發(fā)明是通過PCR方法，擴增出^尸7^基因的全長編碼區(qū)，連接到超量表達載體pCAMBIA1301s上。再進行遺傳轉化，在水稻品種合江19中，超量表達這個基因，得到超量表達植株。在轉基因T2代植株中發(fā)現，陽性植株中的有效磷和全磷水平都顯著高于陰性植株。本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)本發(fā)明證明了一種控制水稻磷酸鹽轉運的基因0sPT2的具體功能。申請人在水稻品種合江19中，超量表達編碼磷酸鹽轉運蛋白的0sPT2基因后，發(fā)現正常營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下，陽性植株對磷酸鹽的吸收最大吸收速率相對于陰性植株提高了4.05倍。陽性植株地上部和地下部中的有效磷水平和全磷水平都顯著高于陰性植株轉基因陽性植株中地上部的有效磷濃度為8.3mgPi/gFW，是其對應的陰性植株濃度的5.5倍；轉基因陽性植株中地下部的有效磷濃度為1.8mgPi/gFW,是其對應的陰性植株濃度的2倍。發(fā)現轉基因陽性植株中地上部的全磷濃度為38.5mgP/gDW，是其對應的陰性植株濃度的4倍；轉基因陽性植株中地下部的全磷濃度為16.5mgP/gDW，是其對應的陰性植株濃度的1.5倍。(2)本發(fā)明首次在水稻中超量表達一個影響水稻磷吸收轉運的基因Gs尸7Z為水稻遺傳育種或選育磷高效的基因型提供了新的思路。(3)本發(fā)明中應用的基因可以為水稻等未谷類作物以及其它作物的磷元素吸收轉運研究提供支持。圖1為一種控制水稻谷粒品質的基因0sPT2的應用技術路線示意圖。圖2為載體pCAMBIA1301s結構示意圖。圖2a是載體pCAMBIA1301結構示意圖2b是在多克隆位點中，插入片段的結構示意圖；圖2c是改造后的載體pCAMBIA1301s的結構示意圖。圖3為超表達轉化載體的結構示意圖。可見OsPT2基因被35S啟動子超表達。具體實施例方式下面結合附圖對本發(fā)明作進一步具體描述磷酸鹽轉運蛋白負責植物體內磷酸鹽的吸收和轉運，對植物磷元素代謝有重要意義。申請人在NCBI網站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上輸入"0sPT2"禾口"rice",得到序列號為AF536962的一段編碼磷酸鹽轉運蛋白的基因的DNA序列，在softberry網站上，預測全長ORF，從而得到Os尸7^基因的全長基因組序列。Os尸7^全長基因組序列為1587bp，全長cDNA為1587bp,編碼528個氨基酸。該基因包括1個外顯子而無內含子。本發(fā)明是通過PCR方法，以水稻品種Nipponbre的總DNA為模板，擴增得到包括了全長^/72"基因編碼區(qū)1587bp的序列，把該片段連接到超表達載體質粒pCAMBIA1301s(超表達載體pCAMBIA1301s是本實驗在載體pCAMBIA130來自澳大利亞一個公開報道和使用的質粒，參見http://www.cambia.org的基礎上改造得到的首先把載體pCAMBIA1301用多克隆位點最外端的兩個限制性核酸內切酶歷>^////和^&0//進行酶切，去掉多克隆位點，再連接上一段包含CaMF35S啟動子、多克隆位點和polyA終止子的序列，從而得到了可以運用于基因超量表達的新載體pCAMBIA1301s，此載體包含GUS的報告基因和潮霉素的篩選基因)上，用農桿菌(EHA105由澳大利亞CAMBIA實驗室提供，參見New^graZ^"m'wwhelperplasmidsforgenetransfertoplants,1993，TransgenicRes2:208-218)介導的方法，在水稻品種合江19中超量表達0^72基因。觀察轉基因植株后代(T2代)，發(fā)現轉基因植株表現出期望的性狀變化，即植株中有效磷和全磷水平顯著上升。以下實施例進一步定義本發(fā)明，并描述了分離fl^72"基因，遺傳轉化，以及氨基酸水平和蛋白質含量的測定方法和該基因在水稻中的表達模式。根據以下的描述和這些實施事例，本領域技術人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。實施例l:Os/^i"基因確定和序列的獲得在NCBI網站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上輸入"0sPT2"禾Q"rice"，得到序列號為AF536962的一段編碼磷酸鹽轉運蛋白的基因的DNA序列，在softberry網站上，預測全長ORF，從而得到Os，尸7^基因的全長基因組序列。實施例2:超量表達轉化載體的構建根據基因OsPT2的已知全長序列設計引物(見表1)，以水稻品種Nipponbre的總DNA為模板，擴增得到包括OsPT2基因全長編碼區(qū)的1825bp片段。申請人擴增OsPT2基因時，在引物上添加了Sacl以及PstI的酶切接頭，因此擴增得到的片段可以用限制性核酸內切酶SacI和PstI進行酶切，然后連接到超表達載體pCAMBIA1301s上(本實驗改造的載體，能用于基因的超表達，載體圖參見圖2)，然后再用表1所示的引物對得到的克隆進行測序，確定基因按正確的方向連接到pCAMBIA1301s載體上。超表達載體pCAMB工A1301s是本實驗在載體pCAMBIA1301(來自澳大利亞一個公開報道和使用的質粒)的基礎上改造得到的。首先把載體pCAMBIA1301，用多克隆位點最外端的兩個限制性核酸內切酶HindIII和EcoRI進行酶切，去掉多克隆位點，再連接上一段包含CaMK35S啟動子、多克隆位點和polyA終止子的序列，從而得到了可以運用于基因超量表達的新載體pCAMBIA1301s。此載體包含GUS的報告基因和潮霉素的篩選基因。表l用f本發(fā)明的自行設計的引物名稱具體內容左端引物(5'-3')GCTTATAACTTTGCAGCTTGAGG右端引物(5'-3，)GGGAAAGTTCACAAAATCTCACA擴增所得片段大小(bp)1825用途fls尸7^基因的全長編碼區(qū)的擴增實施例3:超量表達ft9/T^的轉基因實驗包含編碼磷酸鹽轉運蛋白的CWT2基因的片段連接到載體pCAMBIA1301s上后，采用農桿菌介導的轉基因的方法，得到轉基因的水稻植株，本發(fā)明的轉基因具體步驟如下將得到的正確克隆的質粒通過農桿菌介(EHA105由澳大利亞CAMBIA實驗室提供，參見New々ro6""m'鵬helperplasmidsforgenetransfertoplants,1993，TransgenicRes2:208-218)導水稻遺傳轉化體系導入到水稻品種合江19中，經過預培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、煉苗移栽，得到轉基因植株。農桿菌(EHA105)介導的水稻(粳稻亞種)遺傳轉化體系主要應用Hiei等人凈艮道的方法(參見Efficienttransformationofrice,flr/zasadraL.，mediatedbyy^ro力scz^"》/andsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-腿，1994，PlantJournal6:271-282)基礎上進行優(yōu)化。本發(fā)明的遺傳轉化的主要步驟、培養(yǎng)基及其配制的方法如下所述(1)試劑和溶液縮寫本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表示如下6-BA(6-BcnzylaminoPurine'6-節(jié)基腺嘌呤);CN(Carbenicillin，羧節(jié)青霉素);KT(Kinetin，激動素)；NAA(Napthaleneaceticacid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-aceticacid，口引哚乙酸)；2，4-D(2,4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(CaseinEnzymaticHydrolysate,水解酪蛋白);HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(DimethylSulfoxide,二甲基亞砜);N6,(N6大量元素成分溶液);N6mix(N6微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)(2)溶液配方1)N6培養(yǎng)基大量元素母液(按照10倍濃縮液(10X)配制)硝酸鉀(KNO.,)28.3克磷酸二氫鉀(KH2P04)4.0克硫酸銨((NH4)2S04)4.63克硫酸鎂(MgS(X7H20)1.85克氯化鈣(CaCl22H20)L66克將上述試劑逐一溶解，然后用蒸餾水定容至1000毫升。2)N6培養(yǎng)基微量元素母液(按照100倍濃縮液(100X)配制碘化鉀(KI)0.08克硼酸(H..,BO:,)0.16克硫酸錳(MnS044H20)0.44克硫酸鋅(ZnS047H20)0.15克將上述試劑在20-25攝氏度下溶解并用蒸餾水定容至1000毫升。3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(按照100X濃縮液配制)將3.73克乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA2H20)和2.78克FeS(V7H20分別溶解，混合并用蒸餾水定容至1000毫升，至7(TC溫浴2小時，4T:保存?zhèn)溆谩?)維生素貯存液(按照100X濃縮液配制)煙酸(Nicotinicacid)0.l克維生素B1(ThiamineHC1)0.l克維生素B6(PyridoxineHC1)0.l克甘氨酸(Glycine)0.2克肌醇(Inositol)10克加蒸餾水定容至1000毫升，4'C保存?zhèn)溆谩?)MS培養(yǎng)基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X濃縮液配制)硝酸銨(NH^0:,)16.5克硝酸鉀19.0克磷酸二氫鉀1.7克硫酸鎂3.7克氯化鈣4.4克將上述試劑在20-25。C溫度下溶解，并用蒸餾水定容至1000毫升。6)MS培養(yǎng)基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X濃縮液配制)硫酸錳(MnS044H20)2.23克硫酸鋅(ZnS04'7^0)0.86克硼酸(H:!B03)0.62克碘化鉀(KI)0.083克鉬酸鈉(Na2Mo042H20)0.025克硫酸銅(CuS045H20)0.0025克氯化鈷(CoCl2'6H20)0.0025克將上述試劑在20-25'C溫度下溶解，并用蒸餾水定容至1000毫升。7)2,4-D貯存液(l毫克/毫升)的配制秤取2，4-D100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解完全后定容至100毫升，于20-25'C溫度下保存。8)6-BA貯存液(l毫克/毫升)的配制秤取6-BA100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解完全后定容至100毫升，20-25'C溫度保存。9)萘乙酸(NAA)貯存液(l亳克/毫升)的配制秤取NAA100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解完全后定容至100毫升，4'C保存?zhèn)溆谩?0)吲哚乙酸(IM)貯存液(l毫克/毫升)的配制秤取IAA100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解完全后定容至100毫升，4'C保存?zhèn)溆谩?1)葡萄糖貯存液(0.5克/毫升)的配制秤取葡萄糖125克，然后用蒸餾水溶解定容至250毫升，滅菌后4'C保存?zhèn)溆谩?2)AS貯存液的配制秤取ASO.392克，加入函SOIO毫升溶解，分裝至1.5毫升離心管內，4'C保存?zhèn)溆谩?3)1N氫氧化鉀貯存液秤取氫氧化鉀5.6克，用蒸餾水溶解定容至100毫升，20-25。C溫度保存?zhèn)溆谩?3)用于水稻遺傳轉化的培養(yǎng)基配方1)誘導培養(yǎng)基N6max母液(取已經制備好的10X濃縮液，下同)IOO毫升N6mix母液(取已經制備好的100X濃縮液，下同)IO毫升Fe2+EDTA貯存液(取已經制備好的100X濃縮液，下同)IO毫升維生素貯存液(取已經制備好的100X濃縮液，下同)IO毫升2，4-D貯存液(取上述制備好的)2.5毫升脯氨酸(Proline)0.3克CH0.6克蔗糖30克Phytagel3克加蒸餾水至900毫升，1N氫氧化鉀調節(jié)pH值到5.9,煮沸并定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常規(guī)方法滅菌(12rC下滅菌25分鐘，下述的培養(yǎng)基滅菌方法與本培養(yǎng)基的滅菌方法相同)。2)繼代培養(yǎng)基N6raax母液(10X)IOO毫升N6mix母液(100X)IO毫升Fe2+EDTAli存液(100X)IO毫升維生素貯存液(100X)IO毫升2，4-D貯存液2.O毫升CH蔗糖Phytagel0.5克0.6克30克3克加蒸餾水至900毫升，1N氫氧化鉀調節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法滅菌。3)預培養(yǎng)基N6max母液(10X)N6mix母液(100X)Fe"+EDTA貝亡存液(100X)維生素貯存液(100X)2,4-D貯存液CH蔗糖瓊脂粉12.5毫升1.25毫升2.5毫升2.5毫升0.75毫升0,15克5克1.75克加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調節(jié)pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25毫升/皿)。4)共培養(yǎng)基N6max母液(10X)12.5毫升N6raix母液(100X)1.25毫升Fe2+EDTAfc存液(100X)2.5毫升維生素貯存液(100X)2.5毫升2，4-D貯存液0.75毫升CH0.2克蔗糖5克瓊脂粉1.75克加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調節(jié)pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25毫升/每皿)。5)懸浮培養(yǎng)基N6max母液(10X)5毫升N6mix母液(100X)0.5毫升Fc"EDTAC存液(100X)0.5毫升維生素貯存液(100X)l毫升2，4-D貯存液0.2毫升CH0.08克庶糖2克加蒸餾水至100毫升，調節(jié)pH值到5.4，分裝到兩個100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法滅菌。使用前加入l毫升無菌葡萄糖貯存液和100微升AS貯存液。6)選擇培養(yǎng)基N6max母液(10X)25毫升N6mix母液(100X)2.5毫升Fe"EDTA貯存液(100X)2.5亳升維生素貯存液UOOX)2.5毫升2，4-D貯存液0.625毫升CH0.15克蔗糖7.5克瓊脂粉1.75克加蒸餾水至250毫升，調節(jié)pH值到6.0,封口，按上述方法滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(250毫克/毫升)分裝倒入培養(yǎng)皿屮(25毫升/皿)。(注第一次選擇培養(yǎng)基羧芐青霉素濃度為400毫克/升，第二次及以后選擇培養(yǎng)基羧芐青霉素濃度為250毫克/升)。7)預分化培養(yǎng)基N6腿,x母液(10X)25毫升N6raix母液(100X)2.5毫升Fe"EDTA貯存液(100X)2.5毫升維生素貯存液(100X)2.5毫升6-M貯存液0.5毫升KT貯存液0.5毫升NAA貯存液50微升丄AA貯存液50微升CH0.15克蔗糖7.5克瓊脂粉1.75克加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調節(jié)pH值到5.9，封口，按上述方法滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克/毫升)，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25毫升/皿)。8)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X)IOO毫升N6mix母液(100X)IO毫升Fe2+EDTA貯存液(100X)IO毫升維生素貯存液(100X)IO毫升6-BA貯存液2毫升KT貯存液2毫升NAA貯存液0.2毫升IAA貯存液0.2毫升CHl克蔗糖30克Phytagel3克加蒸餾水至900毫升，1N氫氧化鉀調節(jié)pH值到6.0。煮沸并用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法滅菌。9)生根培養(yǎng)基MSmax母液(10X)50毫升MSmix母液(100X)5毫升Fe2+EDTAC存液(100X)5毫升維生素貯存液(100X)5毫升蔗糖20克Phytagel3克加蒸餾水至900毫升，用1N氫氧化鉀調節(jié)pH值到5.8。煮沸并用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法滅菌。(4)農桿菌介導的遺傳轉化步驟(EHA105由澳大利亞CAMBIA實驗室提供)3.l愈傷誘導1)將成熟的合江19水稻種子去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分鐘，O.15%氯化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；2)用滅菌水洗種子4-5次；3)將種子放在誘導培養(yǎng)基上；4)將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25士rC。3.2愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25士rc。3.3預培養(yǎng)挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25士rc。3.4農桿菌培養(yǎng)1)在帶有對應抗性選擇的LA培養(yǎng)基(LA培養(yǎng)基的配制參照J.薩姆布魯克等，分子克隆實驗指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學出版社，2002,北京)上預培養(yǎng)農桿菌^〃Am5(該菌株來自CAMBIA公司公開使用的農桿菌菌株)兩天，溫度28。C;2)將農桿菌轉移至懸浮培養(yǎng)基里，28'C搖床上培養(yǎng)2-3小時。3.5農桿菌侵染1)將預培養(yǎng)的愈傷轉移至滅好菌的瓶子內；2)調節(jié)農桿菌的懸浮液至0D6。。0.8-1.0;3)將愈傷在農桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；4)轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20。C。3.6愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)1)滅菌水洗滌愈傷至看不見農桿菌；2)浸泡在含400毫克/L羧節(jié)青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；3)轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；4)轉移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)2-3次，每次2周。3.7分化1)將抗性愈傷轉移至預分化培養(yǎng)基上于黑暗處培養(yǎng)5-7天；2)轉移預分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26'C。3.8生根1)剪掉分化時產生的根；然后將其轉移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26°C。3.9移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉入溫室，同時在最初的幾天保持水分濕潤。轉化粳稻品種合江19，得到轉基因單株T。代植株。用southern檢測拷貝數，用northern檢測基因在植物體內的表達量。得到單拷貝、超表達的植株，并且進行繁殖，得到T,和T,代轉基因植株。實施例4:超表達式OsPT2的轉基因植株的功能鑒定測定T,代轉基因植株里有效磷濃度和全磷濃度，發(fā)現Tl代轉基因植株和野生型植株相比，表現出期望的表型變化，即轉基因植株里有效磷濃度和全磷濃度顯著高于對照。同時測定了T2代轉基因植株里有效磷濃度和全磷濃度，發(fā)現T2代轉基因陽性植株和其對應的陰性植株相比，也表現出期望的表型變化。這同時也證明了這個基因可以通過遺傳轉化來大大提高對磷酸鹽的吸收。另外，通過吸收動力學試驗測定，表明陽性植株對磷酸鹽的吸收最大吸收速率相對于陰性植株提高了4.05倍。1.磷吸收試驗測定方法準備一些容積一升左右的小缽(不透光)配套的蓋子.每缽四棵苗(發(fā)芽后40天左右，根據自己的實驗材料，要達到一定的根量.通過調節(jié)根生物量，開始時的磷濃度，溶液體積這些因素使得植株能在4-5個小時將小缽溶液中的磷耗盡)苗子開始可以先在大的面包盒中培養(yǎng)，每星期換一次營養(yǎng)液.實驗開始的前一周轉到小缽中，每天換一次營養(yǎng)液.實驗的前一天換成無磷的營養(yǎng)培養(yǎng)一天.實驗時準備好一批小缽(容積為1升)，每個小缽用量筒量取等體積的營養(yǎng)液，然后同時把需要測試的植株移到這些小缽中(相同的缽子,所以只需把蓋子連同苗移到另一缽子中)，每隔半小時取l.O毫升營養(yǎng)液，測試其中的磷濃度.每次取營養(yǎng)液后補充等體積的水。營養(yǎng)液中磷濃度的測試方法用鉬銻抗法(方法詳見后面有效磷測定).表2本發(fā)明克隆的a尸"轉基因材料磷吸收試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注釋**表示T2代陽性和陰性植株性狀間差異t測驗的概率值，在1%水平極顯著差升。該實驗結果表明0sPT2超表達轉基因陽性植株在7小時的時間段內每克干重的根吸收磷14.705毫克，極顯著高于陰陰性對照的4.682毫克。動力學測定結果表明0sPT2超表達轉基因陽性植株對磷的吸收速率為94nmol/g/min，極顯著高于陰陰性對照的23.2nmol/g/min。2、有效磷濃度的測定方法樣品處理方法歩驟如下1.將新鮮植株先用自來水洗滌，在用蒸餾水沖洗，然后用吸水紙擦干。2.取0.5克鮮樣用液氮研磨成粉末，在4'C放置(冰上或者冰箱)至樣品凍融，加入lml10《(w/v)的高氯酸(PCA)研磨均勻。3.勻漿液用5%(w/v)的高氯酸(PCA)稀釋10倍，于冰上放置30分鐘。4.于4'C，10000g離心10分鐘，上清液用于有效磷含量的測定(鉬銻抗法，詳見全磷測定方法)。5.取2ml工作溶液與lml樣品上清液混合，于4(TC溫育20分鐘。6.反應液在冰上冷卻后，于820nm可見光波長下測定吸收值。如樣品濃度過高，應適當稀釋，使其0D值落在標線的線性范圍內。磷標準曲線的制作1.磷標準溶液配制(60卯mP):溶解0.230g磷酸二氫銨(NH4H2P04)于100ml蒸餾水中，即得600ppmP的磷標準溶液，再將600卯mP的磷標準溶液用提取劑稀釋10倍，得60ppraP的磷標準溶液。2.標準曲線繪制將60卯mP的標準磷溶液用提取劑稀釋，分別制成0.6、1.2、2.4、3.6、4.8和6ppmP的標準系列溶液。提取劑用10%(w/v)的高氯酸和5%(w/v)的高氯酸按體積比l:9混合配制。用提取劑與工作溶液的反應液作空白。3.所得標準曲線如下表所示(2.5ml石英比色皿，光程lcm，BACKMANDU460分光光度計)表4植物有效磷測定標準曲線<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>Y=0.8634X-0.0151R2=0.9999(Y=0D820,X=PPMPi)植物有效磷(Pi)含量(mgPi/gFW)OD值承(V/m)承(V2/V1)*COD值一換算后待測液中磷的質量濃度(PPM:mg/L)V—樣品制備溶液的ml數，即樣品所加提取劑的體積(此為0.OIL)m—樣品鮮重(g)(根據實際稱得的質量計算)VI—吸取反應所用體積(lral)V2—反應液總體積數(3ml)C一樣品的稀釋倍數(如果樣品濃度過高，需稀釋至lml后再反應)3、全磷濃度的測定方法1.H2S04-H202消煮稱取植物樣品0.30.5g(準至0.0002g)放入100ral消煮管中，加入lml蒸餾水濕潤，加入4ml濃，分兩次各加入2ml，每次加入后搖勻，待反應結束后，置于消煮爐上加熱消煮，待H2S04發(fā)白煙，溶液成褐色時，停止加熱，(一般180°C，30min，270°C，30min，360°C，30min)，冷卻至瓶壁不燙手，加入H2022ml，繼續(xù)加熱消煮約510min，冷卻，再加入H2022ml消煮，如此反復至溶液呈無色或清亮后(一般加H202總量約810ml)，再繼續(xù)加熱510rain，以除盡剩余的H202。冷卻，定容。樣品做空白試驗。2.吸取0.501.00ml消煮液于10離心管中，加少量水稀釋，力n1滴二硝基酚指示劑，滴加6mol/LNaOH溶液中和至剛呈黃色，再加入0.5mol/L稀硫酸溶液調節(jié)至黃色剛剛褪去，然后加入鉬銻抗顯色劑l.OOrnl，加水定容，加蓋搖勻。室溫下放置30mim，700ran比色。(大量樣品可用酶標儀測定)做空白，以空白溶液為參比調節(jié)儀器零點。3.標準曲線準確吸取5rag/LP標準工作溶液0、0.5、1、2、3、4、5、6、8ml，分別放入50ml容量瓶中，加水至30ml，同上步驟顯色并定容，即得0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8mg/LP標準系列溶液，與待測液同時測定，讀取吸光度。繪制標準曲線和直線回歸方程。全P%=c(P)XVl/mX(V3/V2)X10-4式中c(P)——從回歸方程求得的顯色液中磷濃度，mg/LV3——顯色液體積，mlV2——吸取測定的消煮液體積，mlVI——消煮液定容體積，nilm-稱樣量，g表5本發(fā)明克隆的fe/Ti"基因轉基因T2單株的表現<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注釋**表示T2代陽性和陰性植株性狀間差異t測驗的概率值，在1%水平極顯著差權利要求1、一種基因OsPT2在控制水稻磷酸鹽吸收轉運中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種基因OsPT2在控制水稻磷酸鹽吸收轉運中的用途。利用OsPT2基因，構建超量表達載體，將載體轉入水稻品種中，得到超量表達OsPT2的轉基因水稻品種。通過PCR方法，擴增出OsPT2基因的全長編碼區(qū)，連接到超量表達載體pCAMBIA1301s上。再將構建好的載體進行遺傳轉化，在水稻品種中超量表達。正常營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下，轉基因陽性植株對磷的最大吸收速率是陰性對照的4.05倍，地上部有效磷濃度是陰性植株濃度的5.5倍，地下部有效磷濃度是陰性植株濃度的2倍。轉基因陽性植株地上部全磷濃度為是陰性對照的4倍；地下部全磷濃度為是陰性對照的1.5倍。文檔編號A01H5/00GK101381730SQ20081019738公開日2009年3月11日申請日期2008年10月24日優(yōu)先權日2008年10月24日發(fā)明者芳劉,張啟發(fā),練興明申請人:華中農業(yè)大學