專利名稱：去除甘蔗宿根矮化病菌、快速繁殖健康甘蔗種苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甘蔗種苗的繁殖生產(chǎn)，尤其是關(guān)于去除甘蔗宿根矮化病菌的技術(shù)
背景技術(shù)：
甘蔗(&"h/7/瓜是我國主要的糖料作物及具有良好發(fā)展前景的生物質(zhì)
能作物。甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease,簡稱RSD )是一種世界性的 重要甘蔗病害，也是我國蔗區(qū)的一種主要甘蔗病害，對甘蔗產(chǎn)量影響較大， 一般新 植蔗產(chǎn)量損失10%-15%,宿根蔗產(chǎn)量損失20%-25%,且影響宿根蔗年限，是甘蔗 品種退化的重要原因之一。甘蔗RSD病原細(xì)菌寄居于蔗莖維管東中，尚無有效的化 學(xué)防治方法；同時(shí)由于缺乏抗源材料，甘蔗RSD抗病育種成效不大，至今未育成抗 性較好的生產(chǎn)品種，其較有效的控制措施是種植健康種苗。 . 培育甘蔗健康種苗的主要目的是去除以甘蔗RSD為主的種苗傳播病害。早期比較 傳統(tǒng)的去除甘蔗RSD病菌的方法是5(TC熱水浸種2-3h或.54-58'C熱空氣處理蔗種 8h,可在一定程度上殺死感病蔗莖中的RSD病原菌，大大減輕RSD的發(fā)生程度，但 上述熱處理方法具有不能徹底去除RSD病菌、易傷害蔗芽、水溫難控制、去菌效果 不穩(wěn)定及種苗繁殖系數(shù)低等不足之處，不適合我國蔗區(qū)生產(chǎn)實(shí)際，難以在生產(chǎn)上大 面積推廣應(yīng)用。近年也有利用熱處理結(jié)合莖尖分生組織(lmm以下)培養(yǎng)去除甘蔗 RSD病菌的報(bào)道，但該種方法切取的外植體特別細(xì)小，需要在解剖鏡下切取，操作 難度較大，且由于外植體特別細(xì)小，導(dǎo)致培養(yǎng)過程中酴污染率極高，誘導(dǎo)成苗率極 低，生產(chǎn)成本較高，難以在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。因此，生產(chǎn)上迫切需要一種能高效去 除RSD病菌、繁種速度快，同時(shí)生產(chǎn)成本低、搡作容易的甘蔗健康種苗生產(chǎn)方法， 來滿足我國甘蔗健康種苗生產(chǎn)的實(shí)際需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種去除甘蔗宿根矮化病菌和快速繁殖甘蔗健康種苗的 方法，其具有去菌徹底、能規(guī)?；?、快速、經(jīng)濟(jì)的地繁殖甘蔗健康種苗的效果。 本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種去除甘蔗宿根矮化病菌、快速繁殖健康甘蔗種苗的方法，包括如下步驟
1. 原種處理和生產(chǎn)采集甘蔗品種主莖，砍成雙芽段，選取若干有效芽段，經(jīng)
49. 5 — 50. 5'C水浴處理2 ~ 3h,放在35°C ~ 38。C光照培養(yǎng)箱中催芽3d ~ 5d， 催芽后育苗于35'C以下溫室中，待蔗苗長成2~4片葉時(shí)，定植于網(wǎng)室苗圃 中，待甘蔗生長至10個(gè)芽左右，用經(jīng)75%酒清浸泡消毒的蔗刀砍取整條蔗莖， 并取汁采用斑點(diǎn)酶標(biāo)免疫試驗(yàn)法(Dot blot enzyme immunoassays,簡稱 DB-EIA)檢測RSD病菌；
2. 外植體選取與滅菌取步驟1)中經(jīng)DB-EIA檢測結(jié)果呈陰性且生長健壯的 蔗莖的頂芽，經(jīng)滅菌處理，作組織培養(yǎng)外植體；
3. 外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)將步驟2)滅菌處理后的頂芽在無菌條件下，切取其3~ 5mm的莖尖組織接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)產(chǎn)生叢芽；
4. 繼代增殖培養(yǎng)將步驟3)誘導(dǎo)分化的叢芽切成單株接種于增殖培養(yǎng)其上， 進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，在27 - 28。C散射光下培養(yǎng)，15 20d繼代一次，繼代數(shù) 以不超過10代為宜；
5. 促根培養(yǎng)將步驟4 )長至5 ~ 6cm高的小苗轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基上，進(jìn)行生根 培養(yǎng)；
6. 假植當(dāng)步驟5)生根小苗生長至6~8cm高，根系發(fā)育健壯后，將生根瓶 苗移到自然光下煉苗2~3d,取出洗去苗上的培養(yǎng)基，種植于苗圃(塘泥、 泥碳土和河沙混合的基質(zhì))上，按常規(guī)管理，苗高35 45cm且生長健壯的假 植苗可移栽于大田進(jìn)行擴(kuò)繁；
7. 苗圃擴(kuò)繁將步驟6)假植苗定植于大田建立一級健康種苗圃，再通過二級 或三級苗圃擴(kuò)繁，在從上級苗圃采苗進(jìn)入下級苗圃擴(kuò)繁時(shí)，采苗工具需用75% 的酒精浸泡消毒5min以上，方可用于采苗，以防交叉感染；
8. 種苗RSD檢測將步驟7)擴(kuò)繁的種苗，在種苗出圃用于大田生產(chǎn)用種前， 抽樣取蔗莖汁用DB-EIA檢測RSD病菌，當(dāng)蔗莖感染率為0時(shí)，種苗合格，可 供大田生產(chǎn)種植。
與現(xiàn)有技術(shù)對比，本發(fā)明有如下突出特點(diǎn)和顯著進(jìn)步 一、以高效徹底去除甘蔗種苗RSD病菌，確保種苗質(zhì)量
本發(fā)明采用兩次去除RSD病菌的方法(熱水處理及莖尖培養(yǎng))，確保種苗RSD
病菌去除率100%。
二、 以快速大量繁殖甘蔗健康種苗，其種苗無變異
本發(fā)明采用組織培養(yǎng)微體快繁及田間多級苗圃擴(kuò)繁技術(shù)，種苗年繁殖系數(shù)在 l萬倍以上，本發(fā)明釆用莖尖培養(yǎng)，未誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，不存在變異問題。
而現(xiàn)有技術(shù)中熱水處理種苗年繁殖系數(shù)約IOO倍；心葉愈傷組織培養(yǎng)雖然 也能高效去除RSD病菌且繁殖系較高，但愈傷組織培養(yǎng)易產(chǎn)生變異，種苗遺傳穩(wěn) 定性差。
三、 本發(fā)明培植的甘蔗健康種苗，具有明顯的增產(chǎn)、增糖、提高抗單性能效果 由于本發(fā)明生產(chǎn)的健康種苗，能徹底去除RSD病菌，保持蔗莖維管束暢通，
有利于水份和營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，從而具有顯著的增產(chǎn)、增糖效果。
具體實(shí)施例方式
下面用二個(gè)具體實(shí)施例來對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明 實(shí)施例一
一種高效去除甘蔗宿根矮化病菌、快速繁殖健康甘蔗種苗的方法，包括如下步
驟
1. 原種處理和生產(chǎn)于8月中甸采取甘蔗品種粵糖00-236主莖10條(株齡8個(gè) 月)，砍成雙芽段，選取蔗芽質(zhì)量較好的有效芽段40段，經(jīng)50±0. 3'C水洛處理 2h，放在35。C光照培養(yǎng)箱中催芽3d,蔗芽萌動(dòng)后在玻璃溫室(28~30°C)中， 用細(xì)沙育苗，待蔗苗長成3-4片葉、假莖高25cm時(shí)，移栽于試驗(yàn)基地網(wǎng)室中， 待甘蔗生長至12~13個(gè)芽，用經(jīng)75%酒清浸泡5min以上的蔗刀砍取20條生長 正常的蔑莖(保留蔗梢)，并給每條蔗莖編號，砍每條蔗莖基部1~4節(jié)中的1 個(gè)節(jié)，用氣泵取汁200 ~ 300 mL,保存于-2(TC。C冰箱中，3d內(nèi)用DB—EIA方法 檢測RSD病菌。
2. 外植體選取與滅菌取檢測結(jié)果為陰性的蔗莖的蔗梢，剝?nèi)ネ馊~，切取莖尖1~ 2cm,在超凈工作臺(tái)上，用75% (V/V)的酒精擦拭，然后用0.1%的升汞溶液浸泡 消毒12 15min,再用無菌水沖洗4遍，將莖尖組織浸泡在500mg/L PVP溶液中， 切取3 ~ 5mm的莖尖組織作外植體。
3. 外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)將步驟2 )的外植體在無菌條件下接種于液體莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基
(1/2MS + 0. 2mg/L 6-BA + 30§/1^蔗糖+ lg/L活性炭(AC )， PH=6. 2 ),在27 ~ 28'C光照靜置培養(yǎng)7 ~ 15d誘導(dǎo)出叢芽。
4. 繼代增殖培養(yǎng):將步驟3)誘導(dǎo)出的叢芽切成單株轉(zhuǎn)接于繼代增殖培養(yǎng)基(MS + 0. 5mg/L 6-BA + NAAO. 2mg/L +蔗糖30g/L,pH=6. 2)中，在28。C散射光下培養(yǎng)， 15 20d繼代一次，總繼代次數(shù)8次。
5. 促根培養(yǎng)將步驟4)長至5~6cm高的繼代小苗轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基(MS+IBA2 mg/L+蔗糖50g/L)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，經(jīng)充分光照培養(yǎng)30d左右。
6. 假植當(dāng)生根小苗長至6 8cm高，根系發(fā)育健壯后，將生根瓶苗移到自然光下 煉苗2 3d，取出洗去苗上的培養(yǎng)基，種植于由塘泥、泥碳土和河沙混合的基質(zhì) 苗圃上，種植后7d內(nèi)每天淋水1~2次，約7d小苗返青后薄施水肥，45d后苗 高35 45cm，生長健壯，即可移栽于大田進(jìn)行擴(kuò)繁。
7. 苗圃擴(kuò)繁將步驟6)假植苗定植于一級苗圃中，定植規(guī)格為行距1.0m,株距 25~30cm, 2200 ~ 2500株/畝，定植前種植溝施呋呷3 ~ 5kg/畝，并用小鋤使藥 與土混合，定植時(shí)用手壓實(shí)，邊植邊淋足定根水，定植時(shí)間以下午3點(diǎn)鐘后為宜， 植后5 ~ 7d每天淋水至少1次，7d左右蔗苗返青，成活率95%,定植后15 ~ 20d 薄施水肥，以5-8Kg尿素/畝為宜，并及時(shí)除草，定植后約30d,蔗苗生長健壯， 其后田間管理按常規(guī)。當(dāng)蔗株長至20個(gè)芽左右時(shí)，即可釆苗進(jìn)入二級苗圃擴(kuò)繁， 采苗前蔗刀需用75%酒精浸泡消毒5min以上，以防交叉感染。當(dāng)二級苗圃的蔗 株長至20個(gè)芽左右時(shí)，即可采苗進(jìn)入三級苗圃擴(kuò)繁，同樣釆苗前蔗刀需用75% 酒精浸泡消毒5min以上，以防交叉感染，當(dāng)三級苗圃的蔗株長至20個(gè)芽左右時(shí)， 即釆苗用作生產(chǎn)用種，采苗前蔗刀也需用75。/。酒精浸泡消毒5min以上，以防交 叉感染。
8. 種苗RSD檢測將步驟7)擴(kuò)繁的種苗，在種苗出圃用于大田生產(chǎn)用種前，隨機(jī) 采取20條蔗莖取汁檢測RSD病菌(DB-EIA檢測方法)，蔗莖感染率為0，種苗合 格。
至此，可將合格種苗用經(jīng)酒精浸泡消毒的砍刀砍收，貼上合格標(biāo)簽供大田 生產(chǎn)種植。 實(shí)施例二
一種高效去除甘蔗宿根矮化病菌、快速繁殖健康甘蔗種苗的方法，包括如下步
驟
1. 原種處理和生產(chǎn)于8月~9月釆取甘蔗品種新臺(tái)糖22號主莖10條(株齡8 個(gè)月)，砍成雙芽段，選取蔗芽質(zhì)量較好的有效芽32個(gè)雙芽段，經(jīng)50±0. 3'C水 浴處理2. 5h,放在37。C光照培養(yǎng)箱中催芽4d,蔗芽萌動(dòng)后在玻璃溫室(28~30 。C)中，用細(xì)沙育苗，待蔗苗長成3-4片葉、假莖高26cm時(shí)，移栽于網(wǎng)室苗圃 中，待甘蔗生長10個(gè)芽左右，用經(jīng)75%酒清浸泡5min以上的蔗刀砍取20條生 長正常的蔗莖(保留蔗梢)，并給每條蔗莖編號，砍每條蔗莖基部1~4節(jié)中的1 個(gè)節(jié)，用氣泵取汁200 300)iL，保存于-2(TCTC冰箱中，3d內(nèi)用DB—EIA方法 檢測RSD病菌。
2. 外植體選取與滅菌取步驟l)中檢測結(jié)果為陰性的蔗莖的蔗梢，剝?nèi)ネ馊~，切 取莖尖l-2cm，在超凈工作臺(tái)上，用75% (V/V)的酒精擦拭，然后用0. 1%的升 汞溶液浸泡消毒12 15min,再用無菌水沖洗4遍，將莖尖組織浸泡在500mg/L PVP溶液中，切取3 ~ 5mm的莖尖組織作外植體。
3. 外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)將步驟2)的外植體在無菌條件下接種于液體莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (MS + 1. Omg/L 6-BA +0. lmg/LNAA +30g/L蔗糖+ 0, 5g/L活性炭(AC ) PH = 5. 8 )
上，以濾紙為支持物，在27土rC的搖床中黑暗條件下振蕩培養(yǎng)5d，轉(zhuǎn)速為40 ±lr/min,第6d轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，15d ~ 20d誘導(dǎo)出叢芽。
4. 繼代增殖培養(yǎng)將步驟3)誘導(dǎo)出的叢芽切成單株轉(zhuǎn)接于繼代增殖培養(yǎng)基 (MS+6BAL Omg/L+KT0. 5mg/L+蔗糖30g/L)上培養(yǎng)，15-20d繼代一次,增殖系
數(shù)3 5倍，總繼代次數(shù)9代。
5. 促根培養(yǎng)將步驟4 )長至5 ~ 6cm高的繼代小苗轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基 (1/2MS+NAAlmg/L+蔗糖20g/L)上，經(jīng)充分光照培養(yǎng)25d。
6. 假植當(dāng)將步驟4)的生根小苗長至6-8cra高，根系發(fā)育健壯后，將生根瓶苗 移到自然光下煉苗2-3d,取出洗去苗上的培養(yǎng)基，種植于由塘泥、泥碳土和河 沙混合的基質(zhì)苗圃上，種植后7d內(nèi)每天淋水1 2次，約7d小苗返青后薄施水 月巴，45d后苗高35 — 45cm,生長健壯，即可移栽于大田。
7. 苗圃擴(kuò)繁將步驟6)假植苗定植于一級苗圃中，定植規(guī)格為行距l(xiāng).Om,株距
25~30cm, 2200 ~ 2500株/畝，定植前種植溝施呋呷3 ~ 5Kg/畝，并用小鋤使藥 與土混合，定植時(shí)用手壓實(shí)，邊植邊淋足定根水，定植時(shí)間以下午3點(diǎn)鐘后為宜， 植后5 7d每天淋水至少1次，7d左右蔗苗返青，成活率91°/。，定植后15~20d 薄施水肥，以5-8Kg尿素/畝為宜，并及時(shí)除草，定植后約30d,蔗苗生長健壯, 其后田間管理按常規(guī)。當(dāng)蔗株長到至20個(gè)芽左右時(shí)，即可采苗進(jìn)入二級苗圃擴(kuò) 繁，采苗前蔗刀需用75%酒精浸泡消毒5min以上，以防交叉感染。當(dāng)二級苗圃 的蔗株長至20個(gè)芽左右時(shí)，即可采苗進(jìn)入三級苗圃擴(kuò)繁，同樣釆苗前蔗刀需用 75%酒精浸泡消毒5min以上，以防交叉感染，當(dāng)三級苗圃的蔗株長至20個(gè)芽左 右時(shí)，即釆苗用作生產(chǎn)用種，釆苗前蔗刀也需用75%酒精浸泡消毒5min以上， 以防交叉感染。
8.種苗RSD檢測將步驟7)擴(kuò)繁的種苗，在種苗出圃用于大田生產(chǎn)用種前，隨機(jī) 采取20條蔗莖取汁檢測RSD病菌(DB-EIA檢測方法)，蔗莖感染率為0,種苗合 格。
至此，可將合格種苗用經(jīng)酒精浸泡消毒的砍刀砍收，貼上合格標(biāo)簽供大田生產(chǎn) 種植。
經(jīng)田間評價(jià)試驗(yàn)表明，本發(fā)明生產(chǎn)的健康種苗，具有明顯的增產(chǎn)效果， 一般新 植蔗增產(chǎn)10%~15%,宿根蔗增產(chǎn)20~30%，蔗糖份提高O. 5個(gè)百分點(diǎn)左右，延長宿 根年限1 2年。
附錄
DB-EIA檢測程序
壓板取10 15張吸水紙，剪成與硝化纖維膜一樣大小(硝化纖維膜的長度與 寬度略小于壓板的長寬度)，硝化纖維膜用蒸鎦水浸泡2-3min，將硝化纖維膜附到 一塊帶孔的壓板上(注意膜與板上的孔對齊)，然后與吸水紙一起用壓板壓好,上緊 螺絲。
上樣用微量移液器吸取100 - 130 nL蔗汁樣品點(diǎn)于板孔中，每孔點(diǎn)一個(gè)樣。 晾干將點(diǎn)好樣的板，置于室溫、通風(fēng)的地方，待孔中的樣液全部被硝化纖維 膜和吸水紙吸干(l 2h),用螺絲刀解開壓板，取出硝化纖維膜。
干燥將晾千后的硝化纖維膜，置于8(TC的恒溫鼓風(fēng)干燥箱中l(wèi)h。 封閉將硝化纖維膜置于3%的脫脂奶粉水溶液中，在搖床上搖動(dòng)30rain。 洗膜取出硝化纖維膜，用蒸鎦水沖洗3次。
加入RSD兔抗體(一抗)將RSD兔抗體溶于PBST中，將沖洗干凈的硝化纖維 膜置于加入RSD兔抗體的PBST溶液中，并在搖床上溫育1 ~ 2h。 洗膜取出硝化纖維膜，用蒸鎦水沖洗3次。
加入羊抗兔堿性磷酸酶標(biāo)記抗體(二抗)將堿性磷酸酶標(biāo)記抗體溶于PBST中， 將沖洗干凈的硝化纖維膜置于加入堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的PBST溶液中，并在搖床 上溫育1 ~ 2h。
洗膜取出硝化纖維膜，用蒸鎦水沖洗3次。
加入底物顯色將NBT/BCIP加入到底物工作液中，將硝化纖維膜在加入 NBT/BCIP的底物工作液中溫育(37°C),并在搖床上搖動(dòng)30min。 洗膜取出硝化纖維膜，用蒸鎦水沖洗3次。 漂白將沖洗后的硝化纖維膜在10%雙氧水中漂白20min。 晾干、拍照、記錄結(jié)果。
權(quán)利要求
1．一種去除甘蔗宿根矮化病菌、快速繁殖健康甘蔗種苗的方法，其特征在于包括如下步驟①.原種處理和生產(chǎn)采集甘蔗品種主莖，砍成雙芽段，選取若干有效芽段，經(jīng)49.5～50.5℃水浴處理2～3h，然后在35℃～38℃光照培養(yǎng)箱中催芽3d～5d，催芽后育苗于35℃以下的溫室中，待蔗苗長成2～4片葉時(shí)，定植于網(wǎng)室苗圃中，待甘蔗生長至10個(gè)芽左右，用經(jīng)75％酒清浸泡消毒的蔗刀砍取整條蔗莖，并取汁用斑點(diǎn)酶標(biāo)免疫試驗(yàn)法(DB-EIA)檢測RSD病菌；②. 外植體選取與滅菌取步驟①中經(jīng)DB-EIA檢測結(jié)果呈陰性且生長健壯的蔗莖頂芽進(jìn)行滅菌處理，作組織培養(yǎng)外植體；③. 外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)將步驟②滅菌處理后的蔗莖頂芽在無菌條件下，切取其3～5mm的莖尖組織接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)產(chǎn)生叢芽；④. 繼代增殖培養(yǎng)將步驟③誘導(dǎo)分化的叢芽切成單株接種于增殖培養(yǎng)基上，進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，在27～28℃散射光下培養(yǎng)，15～20d繼代一次，繼代數(shù)以不超過10代為宜；⑤.促根培養(yǎng)將步驟④長至5～6cm高的小苗轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基上，進(jìn)行生根培養(yǎng)；⑥.假植當(dāng)步驟⑤生根小苗生長至6～8cm高，根系發(fā)育健壯后，將生根瓶苗移到自然光下煉苗2～3d，取出洗去苗上的培養(yǎng)基，種植于苗圃上，按常規(guī)管理，苗高35～45cm且生長健壯的假植苗可移栽于大田進(jìn)行擴(kuò)繁；⑦.苗圃擴(kuò)繁將步驟⑥中的假植苗定植于大田建立一級健康種苗圃，再通過二級或三級苗圃擴(kuò)繁，在從上級苗圃采苗進(jìn)入下級苗圃擴(kuò)繁時(shí)，采苗工具需用75％的酒精浸泡消毒5min以上，方可用于采苗，以防交叉感染；⑧.種苗RSD檢測將步驟⑦擴(kuò)繁的種苗，在種苗出圃用于大田生產(chǎn)用種前，抽樣取蔗莖汁用DB-EIA檢測RSD病菌，當(dāng)蔗莖感染率為0時(shí)，種苗合格，可供大田生產(chǎn)種植。
全文摘要
本發(fā)明涉及甘蔗種苗的繁殖生產(chǎn)，提供一種去除甘蔗宿根矮化病菌、快速繁殖健康甘蔗種苗的方法，包括如下步驟熱水處理少量原種并生產(chǎn)、以其再生植株經(jīng)斑點(diǎn)酶標(biāo)免疫試驗(yàn)(DB-EIA)檢測為陰性的莖尖為外植體，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)、促根培養(yǎng)、假植及二級或三級苗圃擴(kuò)繁生產(chǎn)健康種苗，并在苗圃擴(kuò)繁中注意砍種工具(蔗刀)的消毒，在種苗出圃用于大田生產(chǎn)用種前，抽樣取蔗莖汁用DB-EIA檢測RSD病菌，確保提供合格種苗。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能徹底去除甘蔗種苗宿根矮病病原菌，年繁殖系數(shù)高達(dá)1萬倍以上，且種苗無變異，具有快速、高效、安全的優(yōu)點(diǎn)，適合工廠化、規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)甘蔗健康種苗。
文檔編號A01H4/00GK101361459SQ20081019863
公開日2009年2月11日 申請日期2008年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月19日
發(fā)明者何慧怡, 睿 劉, 楊湛端, 沈萬寬, 鄧海華, 陳仲華 申請人:廣州甘蔗糖業(yè)研究所