專利名稱：一種利用植物油體蛋白表達系統(tǒng)生產人胰島素樣生長因子-i的方法
技術領域：
本發(fā)明屬基因工程技術領域，涉及一種轉基因植物中表達外源蛋白的方法。具體
地，本發(fā)明涉及一種利用植物油體表達系統(tǒng)在植物種子中高效表達人胰島素樣生長因子-I 的方法。
背景技術：
胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor, IGF)，又稱類胰島素生長因 子，是一種多功能細胞增殖調控因子。1978年Humbel等首次純化到兩種形式的IGF， IGF-I 和IGF-II，因其化學結構與胰島素原(proinsulin)類似而得名。其中IGF-I對細胞正常生 長、胚胎發(fā)育、神經生長、腫瘤免疫、能量代謝等方面起著十分重要而廣泛的作用，IGF-I生 物學作用廣泛，其生物學效應主要有促有絲分裂作用(如促進細胞分化，剌激RNA、DNA的合 成和細胞增殖)和類胰島素原作用(如抑制肝糖釋放，增加葡萄糖攝取和轉化，抑制脂肪分 解，減少游離脂肪酸和氨基酸的血液濃度，促進脂質和糖元以及蛋白質的合成)。IGF在臨 床治療上的應用價值正在被廣泛的認識和研究，目前臨床研究表明IGF在侏儒癥、骨質疏 松、抗胰島素糖尿病、出血性潰瘍癥及燒傷和末梢神經損傷等許多疾病治療中都具有重要 的應用價值。用大腸桿菌生產的重組人IGF-I已經被批準應用于兒童IGF-I不足和生長激 素(GH)基因缺失的治療。 隨著對IGF-I、 IGF-I受體和IGF-I結合蛋白(IGFBP)研究的深入，IGF-I在臨床 疾病治療方面的潛在應用價值將被進一步開發(fā)，社會對IGF-I的需求也越來越大。但天然 IGF-I的純化存在很多困難，因此利用基因工程的方法獲得IGF-I有著廣闊的研究及生產 前景。隨著基因工程技術的發(fā)展，人們已經嘗試在多個表達系統(tǒng)中生產IGF-I，這些系統(tǒng)包 括大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞等。這些方法都存在一定的局限性，如大腸桿菌中表達的 IGF-I難以形成正確的二硫鍵，往往以包涵體的形式進行表達，需要經過繁瑣的復性和純化 過程才能得到有活性的產品。而用哺乳動物細胞生產則因為需要昂貴的設備和培養(yǎng)基而導 致過高的生產成本。 植物轉基因技術的出現(xiàn)給重組蛋白表達系統(tǒng)提供了一個新的選擇，從1983年首 次獲得轉基因植物至今，植物基因工程的研究和應用取得了飛速發(fā)展。近年來，人們發(fā)現(xiàn)利 用植物作為重組蛋白的表達宿主具有很多優(yōu)勢，用植物生產藥用蛋白越來越受到了人們的 重視，成為國際上植物基因工程發(fā)展的一個新趨勢。目前已經有多個重要藥用蛋白在植物 中表達成功，如水蛭素、胰島素、干擾素、人血清白蛋白、人表皮生長因子等以及多種抗體和 疫苗，為利用植物作為生物反應器生產藥用蛋白打下了基礎。 在眾多的利用植物表達外源藥用蛋白的策略中，油體蛋白表達系統(tǒng)在外源蛋白的 表達和純化上有巨大的應用潛力，近年來備受關注。油體蛋白是油菜、玉米、擬南芥等植物 種子中的一類豐富的存在于儲存細胞器油體表面的結構蛋白，含量達到種子總蛋白的2 4%。從結構來看，油體蛋白可以分為三個部分，物種間保守性較高的中間疏水域和N-端、
3c-端的兩親性結構域，疏水域對油體蛋白正確定位至油體的功能非常重要，而油體蛋白
N-端或C-端氨基酸序列的改變不會影響油體蛋白在油體上的定位。1994年人們在油菜 中表達油體蛋白和e-葡糖醛酸糖苷酶(13-glucuronidase, GUS)的融合蛋白獲得成功， 融合蛋白正確定位至油體上，且蛋白能在種子中長期儲存或提取后放置3-4周仍然能保持 活性，證實了油體蛋白作為載體表達外源蛋白的可行性。有關水蛭素(hirudin)、胰島素 (insulin)等均在該系統(tǒng)中表達取得成功。 在重組蛋白表達系統(tǒng)中，重組表達的蛋白通常需要從表達的宿主中提取出來并進 行純化后才能得到應用，特別是對于藥用蛋白，蛋白的純化在整個生產過程中要占到80 % 以上的成本，因此純化策略的選取在植物作為生物反應器的過程中是一個非常重要的因 素。在植物油體蛋白表達系統(tǒng)中，利用油體親脂疏水并且密度比水小的性質，可以通過"懸 浮_離心"(flotation-centrifugation)的方法方便地將油體與其他多數(shù)細胞組分分離開 來。經過多次洗滌后，油體蛋白及與其融合的目標蛋白也在油體中得到富集和純化?？傊?， 與其他植物表達系統(tǒng)相比，油體蛋白表達系統(tǒng)具有重組蛋白表達量高、目標蛋白穩(wěn)定性好、 蛋白提取純化方便等優(yōu)勢，同時，油體蛋白表達系統(tǒng)的宿主植物主要是油菜、大豆、玉米等 農作物，這些作物種植和種子加工技術都在傳統(tǒng)的食品工業(yè)中得到發(fā)展，而且分離目標蛋 白種子中的油等其他部分仍然可以利用，在這些作物的種子中表達外源蛋白大大增加了農 產品的附加值。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用植物油體表達系統(tǒng)生產人胰島素樣生長因 子-I (human insulin-like growth factor I， hIGF-1)的方法，利用這種方法得到的胰島 素樣生長因子-I可以應用于兒童IGF-I不足和生長激素(GH)基因缺失的治療以及其他臨 床和實驗室的研究。 本發(fā)明首先按植物密碼子的偏愛性設計、通過基于PCR的基因合成方法 (PCR-based gene synthesis)人工合成了 hIGF-1基因的全序列，該序列如SEQ IDNO. 1所 示； 進一步，本發(fā)明構建了含有油體蛋白基因與上述hIGF-I基因的融合蛋白基因的
表達載體，所述的油體蛋白基因為擬南芥18. 5kDa油體蛋白基因，兩個基因之間設計的編
碼煙草蝕刻病毒蛋白水解酶(Tobacco etch virus protease, TEVP)的識別序列的核苷酸
序列，表達載體所選用的啟動子為擬南芥18. 5kDa油體蛋白的啟動子； 然后，將上述表達載體轉入根癌農桿菌中，通過農桿菌介導法轉化植株，將帶有油
體蛋白啟動子、油體蛋白-胰島素樣生長因子融合基因及rbsS polyA終止子的表達盒整合
到植物基因組中，篩選和培養(yǎng)出帶有上述融合基因的轉基因植株，進一步育種得到后代不
發(fā)生分離的純合植株，該植株所產生的種子中含所述hIGF-I蛋白；并且，該植株的性狀能
長期穩(wěn)定遺傳到下一代，所述的hIGF-I具有正確的生物學活性。 具體地，本發(fā)明包括如下的步驟 (1)按照植物密碼子偏愛性設計和合成hIGF-I基因； (2)從擬南芥基因組中分離得到擬南芥18. 5kDa油體蛋白基因及其啟動子；
(3)將hlGF-I基因核苷酸序列連接到油體蛋白基因核苷酸序列的3'端，將整個融合蛋白基因置于油體蛋白啟動子下游，以植物表達載體pHB為骨架構建hIGF-I的油體蛋白 表達載體； (4)將步驟(3)所得到的植物表達載體轉化至根癌農桿菌菌株GV3101中；
(5)用步驟(4)中所得到的含有hIGF-I的油體蛋白表達載體的農桿菌轉化適當?shù)?宿主植物(如擬南芥、油菜)； (6)通過抗性和PCR的方法篩選轉基因陽性植株； (7)篩選hIGF-I表達量高的植株，培育數(shù)代直至性狀不發(fā)生分離； (8)將步驟(7)所得到的轉基因植株種子經過粉碎、懸浮-離心法純化得到油體蛋
白_人胰島素樣生長因子-I的融合蛋白； (9)用人神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y檢驗步驟(8)中所得到的蛋白的活性。
所述人hIGF-I基因是指，人工合成的經過植物偏愛密碼子優(yōu)化的hIGF-I基因序 列； 所述油體蛋白啟動子是指，為了提高基因的表達效率，本發(fā)明采用了擬南芥 18. 5kDa油體蛋白基因啟動子，該啟動子驅動的油體蛋白基因是擬南芥種子中表達量最高 的油體蛋白基因。本發(fā)明所指油體蛋白基因的啟動子還包括其他的植物種子特異性啟動 子，如菜豆球蛋白啟動子，油菜油體蛋白啟動子等。 所述的通過PCR檢測獲得轉基因陽性植株是指，分別設計合成油體蛋白基因和 hIGF-I基因的檢測引物，進行DNA擴增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性株系即為轉基因 陽性植株。 所述融合蛋白的純化是指，通過"懸浮_離心"的方法將油體蛋白_人胰島素樣生 長因子-I融合蛋白從種子中分離出來。 所述hIGF-I的生物學活性檢驗是指，利用hIGF-I能促進SH-SY5Y細胞進行分化
的性質，將表達的hIGF-I蛋白添加至SH-SY5Y細胞培養(yǎng)基中，觀察發(fā)現(xiàn)該細胞發(fā)生了分化。 采用本發(fā)明的方法生產人胰島素樣生長因子-I具有如下優(yōu)點 1、高等植物表達蛋白質的修飾加工機制和哺乳動物類似，植物中表達的外源蛋
白，能進行正確的折疊和組裝，這對于具有生物學活性的藥用蛋白的生產十分重要。 2、利用植物生產外源蛋白可以避免動物病原體的感染及大腸桿菌中內毒素的污染。 3、采用油體蛋白表達系統(tǒng)生產hlGF-I，可以大大簡化目的蛋白的分離純化過程， 降低生產成本，同時有利于hIGF-I的產業(yè)化。 4、采用擬南芥中含量最高的油體蛋白及其啟動子作為表達hlGF-I載體的元件， 提高了人胰島素樣生長因子-I的表達量。 5、在油體蛋白和hIGF-I之間設計了煙草蝕刻病毒蛋白水解酶(TEVP)的識別序 列，為hIGF-I的純化進一步降低了成本。


圖1是基于PCR方法的人胰島素樣生長因子-I基因的合成。 圖2是油體蛋白和hIGF-I融合基因載體pBS-SK-AtOle-hIGF構建過程示意圖。 圖3是植物油體表達載體pHB-myc-AtOP-AtOle-hIGF構建過程示意圖。
5
圖4是表達載體pHB-myc-At0P-At01e-hlGF中融合基因結構詳細示意圖。 圖5是hIGF-I在擬南芥種子中表達的Western檢測圖。 圖6是表達hIGF-I的擬南芥種子油體蛋白純化結果 圖7是擬南芥種子中表達的hIGF-I活性實驗檢測結果。
具體實施例方式
下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，旨在進一步舉例說明本發(fā)明，但不用來限 制本發(fā)明所要保護的范圍。 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 分子克隆實驗室手冊(New York :Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的
條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1 人胰島素樣生長因子-I基因的制備及序列測定 根據(jù)Genbak中已報道的hIGF-I蛋白序列，在其N_端設計煙草蝕刻病毒蛋白酶 (TEVP)的識別位點，按照植物密碼子使用偏愛，設計出經植物密碼子優(yōu)化的hIGF-I基因核 苷酸序列。為了構建載體的方便，在其兩端分別設計限制性酶切位點Bgl II和Pst I。根 據(jù)該核苷酸序列，利用軟件Primer Premier設計合成了 5條引物，每條引物長度40 80bp 不等，相鄰兩條引物之間重疊18 20bp，通過基于PCR合成的方法合成全長hlGF-I基因。
上述引物是hIGF-Ia :5' -AGATCTGAAAACCTTTACTTCCAGGGACCTGAGACCCTCTGTGGAGCA-3'
TTTCTACTTCAACAAGCCAACTG-3'
G-3'
CGATTCCGGTTTGAGGTGCTC-3' -3, hIGF-I全長基因的合成使用高保真酶KOD (TaKaRa公司)按照如下體系和程序進 行反應 反應體系 10XK0D bufffer 5 ii L 25mM MgS04 3 ii L 2mM d證mix(2. 5mM) 2 ii L Primer hIGF-la (10 iimol/L) 2 ii L
Primer hIGF-Ib (lu mol/L) 2uL
Primer hIGF-Ic (lu mol/L) 2uL
Primer hIGF—Id (1 ii mol/U 2 ii L
Primer hIGF-Ie (10 iimol/L) 2 ii L ddH20 29 ii L KOD liiL _ Total volume 50u L 反應程序94 °C for 2min， (94 °C for 15sec，61 °C ramp to 56 °C for 15sec，72 °C for 25sec) X lOcycles， (89 °C for 15sec，58 °C for 15sec，72 °C for 25sec) X25cycles，72。C for 8min。 待上述PCR過程反應完成后，加入1 y L Taq plus酶于72"繼續(xù)反應20min以在 PCR產物的3'端添加A堿基用于T vector連接。 反應產物經過1.5X瓊脂糖凝膠電泳分離，回收約250bp的片段(見附圖l)，連 接到pMD18-T vector中，經過測序序列正確后得到含有經大腸桿菌密碼子優(yōu)化的hIGF-I 基因序列的載體，該載體命名為pMD18-T-hIGF。經DNA序列測定表明，本發(fā)明設計合成的 hIGF-I核苷酸序列與設計一致。
實施例2 人胰島素樣生長因子-I油體表達載體的構建
1.擬南芥18. 5kDa油體蛋白基因的克隆 按照已發(fā)表的擬南芥18. 5kDa油體蛋白基因序列(Genbak登錄號X62353)設計 引物At01eFl (5' -GGATCCATGGCGGATACAGCTAGAG-3 '，加下劃線為Nco I酶切位點)和A t01eRl (5' -AGATCTTTAAGTAGTGTGCTGGCCA-3'，加下劃線為Bgl II酶切位點)，以擬南芥 (Arabidopsis thaliana) cDNA為模板通過PCR的方法獲得擬南芥油體蛋白基因編碼區(qū)。反 應條件94。C for 5min， (94°C for 40sec， 59°C for 40sec，72。C for lmin) X 33cycles， 72°C for 8min。反應產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分離得到約530bp的片段，回收后連接到 pMD18-T vector中，得到載體pMD18-T-At01e，測序結果表明所得到的片段與報道序列一 致。 2.擬南芥18. 5kDa油體蛋白基因啟動子的克隆 設計引物At0PFl(5' -GAATTCCCTCGGTCTTGGTCAC-3'，加下劃線為EcoR I酶切位 點)和At0PRl (5' -GGATCCTTTTTTGTTCTTGTTTACTA-3'，加下劃線為BamH I酶切位點)以 同上的方法獲得擬南芥油體蛋白基因啟動子。反應產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離得到約 860bp的片段，回收后連接到pMD18-Tvector中，得到載體pMD18-T-At0P，經測序表明所得 序列正確。 3.人胰島素樣生長因子-I植物油體表達載體的構建 用Nco I和Bgl II雙酶切上述含有擬南芥18. 5kDa油體蛋白的質粒 pMD18-T-At01e，將得到的約530bp片段連接到同樣酶切的中間載體pBS-SK中，得到載體 pBS-SK-At01e ;用Bgl II和Pst I雙酶切含有hIGF-I基因的質粒pMD18-T-hlGF，將得到的 約250bp片段連接到同樣酶切的載體pBS-SK-At01e中，得到載體pBS-SK-At01e-hlGF (見 附圖2)。用EcoR I和BamH I分別雙酶切帶有擬南芥油體蛋白啟動子的載體pMD18-T-At0P 和植物表達載體pHB，連接構建成載體pHB-AtOP ;用BamH I和Pst I雙酶切質粒 pBS-SK-At01e-hlGF，將得到的片段連接到同樣酶切的載體pHB-At0P中，得到hIGF-I基因的植物表達載體pHB-myc-At0P-At01e-hlGF(見附圖3)。該載體在At01e的上游插入了一 段編碼myc標簽的序列，用于檢測目標蛋白的表達。
實施例3 農桿菌介導的擬南芥轉化與篩選
1.農桿菌轉化 利用凍融法將上述載體pHB-myc-AtOP-AtOle-hIGF轉入根癌農桿菌菌株GV3101 中。將5 ii L質粒加入200 ii L農桿菌GV3101感受態(tài)細胞中混合均勻，冰浴30分鐘；置液氮 中速凍5分鐘后，迅速取出轉至37t:水浴鍋中溫育5分鐘。加入800ii L無抗生素LB，在低 于200rpm的28t:搖床上復蘇培養(yǎng)3小時；復蘇后取200 y L菌液均勻涂布于含利福平25mg/ L、慶大霉素25mg/L和卡那霉素50mg/L的LB平板上，2『C倒置培養(yǎng)2天。挑取分離良好的 單克隆菌落接種于含利福平25mg/L、慶大霉素25mg/L和卡那霉素50mg/L的LB液體培養(yǎng)基 中于28t:搖床培養(yǎng)過夜；取2iiL菌液用于PCR檢測，反應條件94。C for 3min， (94°C for 40sec，58。C
for 40sec，72。C for lmin) X 33cycles， 72°C for 8min。反應結束后取10 ii L產物用1 %
瓊脂糖凝膠電泳檢測。 2.擬南芥轉化與篩選 采用浸花(floral-dip)法轉化擬南芥。 將上述含有目標基因載體的農桿菌于28t:培養(yǎng)過夜，至0De。。" 2.0，4500rpm離 心10分鐘收集菌體；菌體沉淀懸浮于新鮮配制的轉化緩沖液中(MS 4.41g/L，蔗糖50g/L， 6-BA 10 ii g/L， SILWET-77400 y L/L， pH 5. 8)，至終濃度為0D6。。 "0.8。取生長一個月左右、
生長狀況良好的植株，將擬南芥地上部分全部花苞被浸沒于上述懸浮好的菌液中約5秒；
用吸水紙吸去多余的液體，將植物平放于一個密封的小盒內以保持濕度，避光過夜；第二天 將植物取出，豎直，轉移到正常條件下生長，直至種子成熟。 T。代種子完全成熟后將其收獲，種子消毒后均勻播種于含潮霉素50mg/L的MS固
體培養(yǎng)基上，于fC春化2天后移到培養(yǎng)室中，在22°C， 16h光/8h暗的條件下生長一周；然
后選取抗性幼苗將其移栽至土中繼續(xù)培養(yǎng)。待植株長大后提取葉片DNA進行PCR檢測確認
陽性植株，待種子成熟后收獲種子進行蛋白表達分析。 實施例4 轉基因擬南芥的PCR檢測 以上述不同獨立轉化植株的基因組DNA為模板，分別用擬南芥油體蛋白基因兩 端引物和人胰島素樣生長因子-I基因兩端引物進行PCR檢測，反應條件94°C for 3min， (94°C for 40sec，59。C for 40sec，72。C for lmin) X 33cycles， 72°C for 8min。反應產 物用1. 2X瓊脂糖凝膠電泳進行分離檢測，分別得到與預期大小一致的530bp和250bp的條帶。 實施例5 擬南芥種子中油體蛋白的提取 40mg擬南芥種子用250 ii L油體提取buffer 1 (0. 4M蔗糖，O. 5M NaCl， 50mMTris-HCl， pH 8. 0)研磨，于lOOOOg離心lOmin ;取出頂層油相，用100 ii L buffer 2(50mM Tris-HCl， pH 8.0，0.5M NaCl)重懸，lOOOOg離心10min，重復三次；頂層油相
8用buffer 3(50mM Tris-HCl， pH 8.0)重懸，10000g離心lOmin后重懸在磷酸buffer 3 中，稀釋后用于Bradford法測定蛋白濃度。用于蛋白電泳的樣品加入1/10體積的50mM Tris-HCl， pH 8.0， 2% SDS溶液中，煮沸后離心，取水相加入蛋白樣品緩沖液后進行電泳。 結果見附圖6，第一道為蛋白質分子量標準，第二道為非轉基因擬南芥種子油體蛋白，第三
道為轉基因種子油體蛋白，箭頭所示為融合蛋白。
實施例6 擬南芥種子中融合蛋白的Western Blot檢測
1.蛋白SDS-PAGE電泳及轉膜種子油體蛋白按照Schagger的方法用10%不連續(xù)Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝膠 在Bio-red公司的垂直電泳裝置中進行電泳分離，條件為30V電泳1小時后改為80V電泳 至溴酚藍條帶跑出凝膠。電泳結束后用Bio-red公司的蛋白電泳轉移裝置，將蛋白轉移至 0. 45 ii m PVDF膜上，條件為30mA恒流過夜。
2.膜的雜交 膜的雜交操作按照QIAGEN公司的操作手冊The QIAexpressionist進行， 一抗使 用兔抗人胰島素樣生長因子-I多克隆抗體，二抗使用堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG，使用 Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline Phosphatase (Promega公司)進行顯 色。Western blot結果表明，在轉基因擬南芥種子油體蛋白中有hIGF-I的表達，產物大小 約為34kDa，與融合蛋白預期大小一致。 Western blot分析結果見圖5，第1道為陽性對照，第2道為預染蛋白質分子量標 準，第3道為非轉基因擬南芥種子蛋白，第4 10道為獨立轉化植株種子蛋白。
實施例7 擬南芥中表達的人胰島素樣生長因子-I的生物學活性檢測 將液氮中凍存的人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y迅速放入37。C水浴中，輕輕搖勻 使細胞快速溶解，轉到15mL離心管中，加入預先37t:溫熱的9mL添加10%胎牛血清的 RPMI1640細胞培養(yǎng)基中。800g，室溫離心3分鐘后吸去上清，加入5mL培養(yǎng)液重懸，轉移到 25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，于37t:，5X 0)2條件下培養(yǎng)。24小時后換液，去除死細胞。待細胞生 長至互相接觸，將細胞傳代，先吸去原有培養(yǎng)液，用PBS洗去殘留血清。加入0. 5mL胰酶于 37t:消化2分鐘，輕輕拍打瓶壁使細胞脫落。加入2. 5mL培養(yǎng)液中和胰酶，用移液管吹打成 單細胞。 800g，室溫離心3分鐘，棄上清，加入lmL培養(yǎng)液，重懸細胞。取10 y L細胞懸液和 30 ii L臺酚藍溶液混勻，轉移到血小板計數(shù)器上計數(shù)。以每培養(yǎng)瓶約5X 104個細胞接種平 行的4瓶。培養(yǎng)12小時待細胞貼壁后加入蛋白樣品，繼續(xù)培養(yǎng)36小時觀察結果。
人胰島素樣生長因子-I對人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y的促分化結果見附圖7， A為不加蛋白樣品的培養(yǎng)基作為空白對照；B為50ng/mL hIGF-I作為陽性對照；C為非轉基 因擬南芥種子油體蛋白樣品作為陰性對照；D為含hIGF-I 50ng/mL的轉基因擬南芥種子油 體蛋白。結果表明擬南芥種子中表達的hIGF-I能夠促進SH-SY5Y細胞進行分化，具有生物 學活性。
序列表 〈110>復旦大學
〈120〉 一種利用植物油體蛋白表達系統(tǒng)生產人胰島素樣生長因子-I的方法
〈160>4〈170>PatentIn version 3. 4〈210>1〈211>249〈212>DNA〈213〉ArtificialSequence〈220〉〈223>Designed DNA coding for humaninsulin-likegrowth factor Ibasedoncodon usagein plants〈400>1agatctgaa aac ctt tac ttc cag gga3ct gag acc etc tgt gga gca48Glu Asn Leu Tyr Phe Gin Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala1510gaa cttgttgatgetetcttcgtgtgtgg￡l g￡lC3gaggtttc tac96Glu LeuValAspAlaLeu GinPheValCysGly AspArgGlyPhe Tyr15202530ttc aac朋gCC3actgga tecgg￡itctteatct agg3gagCElcct144Phe AsnLysProThrGly TyrGlySerSerSer ArgArgAlaPro Gin3540453CC ggaategttgatgag tgctgtttc3gatea tgcgatctt3gg卿192Thr GlylieValAspGlu CysCysPheArgSer CysAspLeuArg Arg505560ctt gagEltgtactgcget cctctt朋gCC3get朋gtctgettaactgc241Leu GluMetTyrCysAla ProLeuLysProAla LysSerAla657075aggttacc249〈210>2〈211>7〈212>PRT〈213〉ArtificialSequence〈220〉〈223>Designed peptide of Tobacco etch virus protease cleavage site
〈400>2Glu Asn Leu Tyr Phe Gin Gly15〈210>3〈211>70〈212>PRT
10:0143] 〈213>Homo sapiens
:0144] 〈400>3
:0145] Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gin Phe
:0146] 15 10 15
:0147] Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
:0148] 20 25 30
:0149] Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gin Thr Gly lie Val Asp Glu Cys Cys
:0150] 35 40 45
:0151] Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
:0152] 50 55 60
:0153] Lys Pro Ala Lys Ser Ala
:0154] 65 70
:0155] 〈210>4
:0156] 〈400>4
:0157] 000
權利要求
一種在植物種子中高效表達融合基因的載體，其特征在于，該載體上的表達盒自5′至3′依次包含以下元件油體蛋白啟動子或種子特異表達啟動子、外源目標蛋白基因和油體蛋白基因的融合基因、終止子序列rbsS polyA。
2. 如權利要求1所述的表達載體，所述外源目標蛋白為人胰島素樣生長因子-I。
3. 如權利要求2所述的表達載體，其特征在于，所述人胰島素樣生長因子-I基因具有 SEQ ID NO. l所示的核苷酸序列，該基因所用的密碼子為植物偏愛性密碼子，其5'端具有 編碼煙草蝕刻病毒蛋白水解酶識別位點序列的核苷酸序列，該基因所編碼的蛋白質經TEVP 酶切后具有與人體內成熟的人胰島素樣生長因子-I蛋白完全一致的氨基酸序列。
4. 如權利要求1所述的表達載體，其特征在于所述的表達載體的啟動子為擬南芥油體 蛋白啟動子。
5. 如權利要求1所述的表達載體，其特征在于，所述的融合基因的油體蛋白基因為擬 南芥18.5kDa油體蛋白基因，該基因5'端添加了一段編碼Myc tag序列的核苷酸序列。
6. 如權利要求1 5所述的表達載體，其為pHB-myc-At0P-At01e-hlGF。
7. 權利要求1 6所述的表達載體在制備人胰島素樣生長因子-I中的應用。
8. —種利用植物種子油體生產人胰島素樣生長因子-I的方法，其包括如下步驟(1) 用權利要求1 5所述的表達載體轉化受體植物，篩選得到含有目的基因的轉化植株；(2) 篩選獲得種子中目的基因表達量高的植株；(3) 通過遺傳育種的方法獲得純系；(4) 從上述植株種子中分離純化得到人胰島素樣生長因子-I ;
9. 如權利要求8所述的方法，其中受體植物為油菜、擬南芥、紅花、向日葵、或棉花。
10. 如權利要求8所述的方法，其中所述(1)中轉化受體植物的方法是農桿菌介導法。
11. 權利要求8所述的方法得到的轉基因植物組織、植株和種子。
全文摘要
本發(fā)明屬基因工程技術領域，提供了一種利用植物油體表達系統(tǒng)表達和純化人胰島素樣生長因子-I(human insulin-like growth factor I，hIGF-I)的方法。本發(fā)明方法按照植物密碼子的偏愛性設計合成了人胰島素樣生長因子-I基因，將所述人胰島素樣生長因子-I基因與油體蛋白基因融合，構建成用種子特異性表達啟動子驅動的植物表達載體，將該載體轉化受體植物，在轉化植株種子中高效表達具有生物學活性的人胰島素樣生長因子-I。本方法得到的胰島素樣生長因子-I可應用于兒童IGF-I不足和生長激素(GH)基因缺失的治療以及其他臨床和實驗室的研究。
文檔編號A01H5/10GK101736029SQ20081020321
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月21日 優(yōu)先權日2008年11月21日
發(fā)明者唐克軒, 孫小芬, 李維, 游曉慧 申請人:復旦大學