專利名稱：：一種來源于不結(jié)球白菜的抗逆nac轉(zhuǎn)錄因子基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及作物遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及一種來源于不結(jié)球白菜的抗逆NAC轉(zhuǎn)錄因子基因，在培育具有抗逆性轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：生物脅迫和非生物脅迫是影響植物生長發(fā)育，造成經(jīng)濟產(chǎn)量低質(zhì)量差的重要因素之一。要改善農(nóng)作物生產(chǎn)中的諸多問題，需要依靠多樣化的基因資源，只有發(fā)掘和利用優(yōu)異基因，才能實現(xiàn)作物育種的突破和進展。自然界中，植物生長在開放的系統(tǒng)中，經(jīng)常遇到惡劣環(huán)境的影響，主要有強光、高溫、干旱、水澇和高鹽等逆境的脅迫。為了適應(yīng)這些環(huán)境，植物在生理、生化水平以及分子細胞水平都有相應(yīng)的反應(yīng)(生物學(xué)通報，2003，38，3-4;CurrentScience,2001，80，206-215)。人們就逆境對植物影響的認識和研究，首先是從表觀生理指標一般性描述開始，其次研究植物在各種逆境下產(chǎn)生的生理生化、生態(tài)變化和生理調(diào)節(jié)機制，最后發(fā)展到分子水平，進一步探討植物對不同逆境的感應(yīng)、信號傳導(dǎo)、基因表達與調(diào)控、蛋白質(zhì)組裝和細胞膜功能獲得。為更深入了解植物對不同逆境響應(yīng)的分子機理和研究人工調(diào)控的生物技術(shù)等方面展示出良好前景。不結(jié)球白菜(Brassicac卿estrisLSSP.Chi體sisMakino)是罌粟目(Rhoeadales)十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica)作物，原產(chǎn)于我國，又名小白菜，俗稱青菜、菜心，北方也稱小油菜，是我國長江中下游及其以南地區(qū)的一種主要蔬菜，其種植面積占蔬菜總面積的30%以上，在我國"菜籃子工程"中占有重要地位。近年來，在我國北方省市也有較大面積的引種栽培和推廣。因而對不結(jié)球白菜的抗逆性的研究具有重要的意義。NAC轉(zhuǎn)錄因子是近十年來新發(fā)現(xiàn)的具有多種生物功能的植物特異轉(zhuǎn)錄因子(西北植物學(xué)報，2007，27，1915-1920)。Aida等首先報道了NAC結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)在矮牽牛，M基因、擬南芥ATAF1/2和￡UC2基因編碼蛋白的N端包含一段保守的氨基酸序列，取首字母命名為NAC(ThePlantCell,1997，9，841-857)。雖然與其它類型的轉(zhuǎn)錄因子相比，NAC類轉(zhuǎn)錄因子研究的較少，但是研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育、器官建成(Cell,1998,92，93-103;Development，2001，128，1127-1135;PlantCell,2003，15，1563-1577)和防御抵抗多種生物(PlantMol.Biol.，1999,39,647-656;PlantCell,2000，12，1917-1925)和非生物脅迫(PlantCell,2004，16,2481-2498;PlantJ.，2004，39，863-876)等方面發(fā)揮重要作用。而抗逆機理的研究最終可用于改善植物的抗逆性，具有重要的理論意義和現(xiàn)實意義。NAC類基因?qū)τ谂嘤参锟鼓嫫贩N，特別是培育抗病、抗鹽和抗低溫的植物品種非常重要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的在于提供一種來源于不結(jié)球白菜的抗逆NAC轉(zhuǎn)錄因子基因，該基因可用于提高植物的抗逆性。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種來源于不結(jié)球白菜的抗逆NAC轉(zhuǎn)錄因子基因的構(gòu)建方法。本發(fā)明的又一個目的在于提供一種來源于不結(jié)球白菜的抗逆NAC轉(zhuǎn)錄因子基因，在培育提高植物抗逆性中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的來源于不結(jié)球白菜的抗逆NAC轉(zhuǎn)錄因子基因序列為SEQIDNo1。所述的轉(zhuǎn)錄因子基因編碼的蛋白質(zhì)具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明所述的一種來源于不結(jié)球白菜的抗逆NAC轉(zhuǎn)錄因子基因的構(gòu)建方法包括如下步驟1)不結(jié)球白菜cDNARACE文庫的構(gòu)建取生長健壯的不結(jié)球白菜苗采用冷酚法(購買于上海國藥化學(xué)公司)抽提總RNA。使用Promega公司的磁珠分離系統(tǒng)進行mRNA的分離。利用SMART技術(shù)(Clontech公司)合成cDNA第一鏈，使用的引物是R11464和R11466(GAC，CAG，TGG，TAT，CAA，CGC，AGA，GTA，CGC，GGG和GCA，GGA，CTG，CAG，CTG，ACT,GAC，TAC，TTT，TTT，TTT，TTT，TTT，TTT，TTT，TTT，TTT，TTT，VN)，其中V表示"A、G或C"，T表示"A、T、C或G"，VN即為其所表示的脫氧核糖核酸的任意組合。SMART技術(shù)參照Clontech說明書進行操作。合成好的不結(jié)球白菜cDNA庫保存于-7(TC。2)不結(jié)球白菜NAC基因的保守片段的制備根據(jù)與不結(jié)球白菜親緣關(guān)系相近的擬南芥等物種的NAC基因的保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列特征設(shè)計一對兼并引物R16162和R16163(CCN，MGN，GAY，MGN，AAR，TAY，CCN，AAY，GG和TAR，NCK，RTA，YTC，RTG，CAT,DAT,CCA)，以合成的不結(jié)球白菜cDNARACE文庫為模板，進行PCR擴增(PCR反應(yīng)體系10XPCRbuffer5.0iiL;dNTPs(各2.5mM)4iiL;不結(jié)球白菜cDNA模板1iiL(20ng);引物R161620.5iiL;引物R161630.5iiL;Ex-Taq0.4iiL(預(yù)變性后加入)；加無菌水定容至50iiL。PCR反應(yīng)程序94。C預(yù)變性10分鐘；94。C變性30秒；52。C退火30秒；72。C延伸50秒；共35個循環(huán)；72。C延伸10分鐘)。獲得一條約200bp的片段(圖3)，將該擴增產(chǎn)物回收后克隆入T-載體(購買于大連寶生物工程公司)，測序得到保守片段的DNA序列，經(jīng)過Blast比對為NAC基因的保守片段。序列為TGGGAGCTTTCCCAGCGTAGAACACGAGCGCCTTCTTAATACCCAGCGTCTTCGGTTTACCGATCGGTTTATCAGCTCCGGTGGCTTTCCAATAACCGGTTCCCGCCGCCCGGTTAGGACGCGAACCGTTGGGATACTTTCGATCACGCGG3)RACE方法獲得不結(jié)球白菜NAC基因片段根據(jù)已經(jīng)克隆的不結(jié)球白菜NAC基因的保守片段序列分別合成5'和3'RACE擴增的內(nèi)側(cè)和外側(cè)巢式PCR(Nest-PCR)。引物分別為R19647,R19648和R19649，R19650。所述引物具體為，R19647:5，-GGA，AAG，CTC，CTA，AAG，GGA，TTA，AAA，CG-3'R19648:5'-CGA，ATT，GGA，TCA，TGC，ACG，AGT，ACA，GG-3'R19649:5'-GGA，GCT，TTC，CCA，GCG，TAA，AAG，ACT，AG-3'R19650:5'-CGG，TGG，CTT，TCC，AAT，AAC，CAG，TTC-3，。4)制得不結(jié)球白菜NAC全長序列通過對5'和3'RACE擴增片段的序列測定和分析，得到全長為1196bp的序列。根4據(jù)該序列設(shè)計具體引物為，R20215:ATG，AAT，GCA，GAG，CTG，AAC，TTA，CCT，GC;R20216:CCC，CTG，TGG，AGC，AAA,ACT,CCA，ATT，C將該對弓I物從不結(jié)球白菜cDNA文庫中擴增得到全長的不結(jié)球白菜NAC基因，進行序列測定分析。所述設(shè)計兩端引物具體為1GGGGGATTAC61TTTGAAGAGA121TTCCATCCAA181GAGATCTCAG241CCAGAGATGT301TACCCAAACG361GCTGATAAAC421GCTGGGAAAG481AATGTTGACA541TTATGTCGAG601CCGATGACCA661TTGCAAGAGG721GTTCAGAGCG781GGTGGCTCCA841TTTTATGATT901AGTTTTGCTC961GATGTGTTAGCCACGCACCGACGATGCTGAAGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTCACGCAATCTTCAGCAGACGAAAGGAGAAGGAAAAAAAAAAATTGAACGAAGAGAGAAAAGAGAAAAGAATGAATGCAGAGCTGAACTTACCTGCAGGATTCCGACGGACGAAGAGCTTGTGAAATTCTACTTGTGCCGGAAATGCGCATCGGAGCTCCGGTTATCGCCGAAATCGATCTTTACAAGTTCAATCCTTGGGAGCTTCTCTGTACGGAGAGAAAGAGTGGTATTTTTTCTCACATAGAGACCGGAAGGTTCGCGTCCAAACCGGGCAGCTGGAACTGGTTATTGGAAAGCCACCGGACGATCGGTAAACCGAAGACGTTGGGTATAAAGAAAGCGCTAGTCTTTTACCTCCTAAAGGGATTAAAACGAATTGGATCATGCACGAGTACAGTCTCGCTGATCAGCTTCTGTTAACAAAAAGAACAACCTTCGACTTGATGATTGGGTGTCTACAACAAGAAAGGGACCATGGAGAAGTACTACCCTGCTGATGAGAAATGACGGCGGCTTCATCGCCTTTCGATGCGTCGGACTCGACTTACCCGACGATGACTCGAGCAGCTCGGGGGGTCGCGTGGTGTCACCGGATGCGCGGGAGAGCCTAAATGGGGGGAGTTTGAGAATGCTTTTGATGCTTCCATGTTCGGTTGGACTTGCTGCAGAGTGAAGATTTTGTGCCTCAGTTCTTGTACCAGCCTTCAACTCCTGGCAGGAGGATCCGCCGGAGCAGAAACCGTTCTTGAATTGGCACAGGGGTGATAAAAAGGATAAGAGGGAAAGGTTTTTGGTCTGTGTTGT1021AGAGAAGTTTTCAATCATCTTTTGTTTTTTAGTAGTGAGAGAAAGATTGTAGAGTGTTGA1081TAGTTTTTTAGCATCTTCAATGTTTCATTGGTAGGTGAATTCTTGTTATTTCATCAGATA1141TTTATATGAAAAATTATACATTTTTCAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)錄因子基因BrNAC能用于植物轉(zhuǎn)化，在培育提高植物抗逆性中的應(yīng)用。本發(fā)明實現(xiàn)的有益效果本發(fā)明克隆了不結(jié)球白菜抗逆轉(zhuǎn)錄因子基因BrNAC。比較了轉(zhuǎn)BrNAC基因的擬南芥植株和野生型擬南芥植株對低溫脅迫的耐受性。結(jié)果表明，野生型和轉(zhuǎn)BrNAC基因擬南芥植株在存活率上有很大的差異，轉(zhuǎn)基因植株比野生型擬南芥有明顯的抗凍能力，這也表明BrNAC的轉(zhuǎn)入提高了擬南芥植株的抗低溫的能力。圖1鑒定總RNA產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2鑒定分離的mRNA產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖3檢測擴增保守片段的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖4檢測5'RACE擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5檢測3'RACE擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖6檢測擴增全長的DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖。具體實施例方式以下結(jié)合附圖詳細描述本發(fā)明的技術(shù)方案。應(yīng)當(dāng)說明的是，所述實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。本發(fā)明所用的試驗材料及其來源包括不結(jié)球白菜(BrassicacampestrisL.SSP.ChinensisMakino)實生苗，27。C人工氣候室培養(yǎng)，16h光照培養(yǎng)兩個星期。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5a由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所植物基因工程研究室保存?？寺≥d體pMD-18-SimpleT、各類限制性內(nèi)切酶、Taq聚合酶、連接酶、dNTP、10XPCRbuffer和DNAmarker購自寶生物工程大連有限公司。所有的化學(xué)試劑都從美國西格瑪化學(xué)公司和上海國藥化學(xué)試劑購買。ABIPRIAMBig-DyeTerminatorDNA測序試劑盒購自美國應(yīng)用系統(tǒng)公司。SMARTTMRACEcDNA擴增試劑盒購買于美國Clontech公司。本發(fā)明中常規(guī)的分子生物學(xué)操作具體參見《分子克隆》(MolecularCloning.2nded.ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)。本發(fā)明所用的試劑若未明確指明，則均購自西格瑪_奧德里奇(Sigma-Aldrich)。實施例1不結(jié)球白菜幼苗RNA的抽提和mRNA的分離(—)試驗方法RNA的抽提1、磨樣向250mL離心管中加入lOOmL抽提緩沖液。稱取50g材料，液氮速凍，研磨后轉(zhuǎn)移到提取液中，振蕩機上劇烈震蕩lOmin，靜置15min，分層。2、去除雜質(zhì)4°C，4000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移透明的上清勻漿至另一試管。3、RNA沉淀①加兩倍體積的無水乙醇與上述的上清液的離心管中，混勻，冰上靜置30min;②4°C，5000r/min離心10min，傾去液體；③加適量70X冰乙醇懸浮，4。C，5000r/min離心10min;倒掉上清，將離心管倒置在無酶的紙上干燥20min，溶解于30mL冰冷的水中。4、氯化鋰選擇性沉淀①將RNA水溶液短暫離心，去除不溶物；②加10mL8mol/L氯化鋰，搖勻，放置4"冰箱過夜；③次日，4°C，10，OOOg離心10min;④小心去除上清，RNA沉淀用70%乙醇洗一次，在相同條件下再次離心。5、酚氯仿抽提①將上述的已干燥的RNA用2mL水溶解，分裝于兩個1.5mL印pendorf管中，在4°C，5000r/min離心2min;②小心吸取上清，至另一管中，加等體積的酚氯仿混勻，4t:，12，OOOg離心10min;③小心吸取上清，至另一管中，加等體積的氯仿混勻，4t:，12，OOOg離心10min;④小心吸取上清，至另一管中，加1/10體積的3mol/LNaAc，2倍體積的無水乙醇混勻，-7(TC，放置lh。6、RNA的獲得①從冰箱中拿出RNA，在4°C，12000g離心15min;②小心倒掉上清，加適量70%乙醇使沉淀懸浮后，4°C，10，000g離心8min;③將離心管倒置無酶的紙上干燥；加100iiLDEPC處理過的水充分溶解，-7(TC保存。7、檢測測定濃度和純度取1iiL稀釋至100iiL紫外分光光度計測純度和濃度；電泳檢測RNA的完整性?；蚪MDNA的去除參照DNaseI(RNaseFree)說明書。①將20-50iigRNA溶于水中，力口入lOXDNasebuffer5iiL，5u/iiLRNAfreeDNase2iiL，40u/iiLRNaseInhibitor0.5iiL，力口謹free1120至50111。②37。C反應(yīng)20-30min。③加入50iiL的DEPC處理水。④加入100iiL(等量)的苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:l)，充分混勻。⑤離心，取上層(水層)移至另一微量離心管中。⑥加入100iiL(等量)的氯仿/異戊醇(24:l)，充分混勻。7⑦離心，取上層(水層)移至另一微量離心管中。⑧加入lOiiL(l/10量)的3MNaAC(pH5.2)。⑨加入250iiL(2.5倍量)預(yù)冷的無水乙醇，-20°。放置3060min。⑩離心回收沉淀，用70%的冷無水乙醇洗沉淀，真空干燥。用適量的DEPC水處理水溶解后，進行瓊脂糖電泳確認是否除去基因組DNA。mRNA的分離利用promega公司生產(chǎn)的polyATtractmRNAIsolationSystems純4tmRNA。1、探針的退火①將0.1-1.0mg的總RNA加入1.5mL的離心管中，用無RNA酶的水定容至500yL;②65。C水浴10min;③在RNA中加入3iiLBiotinylated-01igo(dT)探針和13iiL20XSSC，緩慢搖勻，置于室溫下直到完全冷卻下來。期間準備0.5XSSC和0.1XSSC(即，氯化鈉/擰檬酸納，由promega公司提供)。2、母液的準備①準備1.2mL0.5XSSC(30iiL20XSSC力卩1.170mL水);②準備1.4mL0.1XSSC(7iiL20XSSC力Q1.393mL水)；3、鏈親和素標記的磁珠(SA-PMPS)清洗磁珠一定要用相同量的0.5XSSC溶液清洗3次且在30min內(nèi)使用。①輕輕地指彈裝著SA-PMPS的0.6mL離心管底部使之重新懸浮直到完全分散，然后放到磁力架上將磁珠收集于離心管管壁上(約需30s);②小心去除上清，切忌使用離心；③0.5XSSC溶液清洗3次，每次使用300iiL0.5XSSC，每次都用磁力架來收集磁珠并小心去除上清；最后用100iiL0.5XSSC溶液重新懸浮磁珠。4、收集并清洗退火的01igo(dT)/mRNA雜交分子①將雜交好的總RNA516iiL全部加入100yL處理過的SA-PMPs中；②置于室溫下10min，并每1-2min輕輕地顛倒混合1次；③用磁力架收集磁珠并小心去除上清，不要觸及和晃動SA-PMPs小球；用300iiL0.1XSSC溶液清洗磁珠4次(每次輕輕地指彈離心管底部)使所有的磁珠懸浮起來，最后一次清洗盡量多地去除上清且不觸及磁珠。5、mRNA的洗脫①加入100iiL無RNase的水，輕彈離心管底部使SA-PMPs磁珠重新懸浮；②磁力架收集SA-PMPs，收集洗脫mRNA于新的離心管中；③加入150iiL無RNase的水，重復(fù)①和②，合并洗脫液共計250iiL。6、mRNA的獲得①在洗脫液的離心管中加1/10體積的3mol/LNaAc，葡聚糖10yL，2倍體積無水乙醇；②放在-70。C2h;③4°C，12，OOOg離心18min，倒掉上清，加70%乙醇400iiL混勻，4。C，12，OOOg離心8min;倒掉上清，干燥，用10iiL水溶解。(二)試驗結(jié)果1、采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA產(chǎn)物的結(jié)果見圖1，圖中可見明顯的RNA條帶。2、采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定mRNA產(chǎn)物的結(jié)果見圖2，圖中可見明顯的mRNA條帶。實施例2PCR的方法獲不結(jié)球白菜NAC基因的保守片段(—)試驗方法根據(jù)與不結(jié)球白菜親緣關(guān)系相近的擬南芥等物種的NAC基因的保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列特征設(shè)計一對兼并引物R16162和R16163(5'-CCN，MGN，GAY，MGN，AAR，TAY，CCN，AAY，GG-3'禾口5'TAR，NCK，RTA，YTC，RTG，CAT，DAT，CCA-3')，以合成的不結(jié)球白菜cDNARACE文庫為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系10XPCRbuffer5.0iiL;dNTPs(各2.5mM)4iiL;不結(jié)球白菜cDNA模板IPL(20ng);引物R161620.5iiL;引物R161630.L;Ex-Taq0.L(預(yù)變性后加入)；加無菌水定容至50iiL。PCR反應(yīng)程序94。C預(yù)變性10分鐘；94。C變性30秒；52。C退火30秒；72t:延伸50秒；共35個循環(huán)；72。C延伸10分鐘。(二)試驗結(jié)果采用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物為一條約200bp的片段(圖3)，將該擴增產(chǎn)物回收后克隆入T-載體，測序得到保守片段的DNA序列TGGGAGCTTTCCCAGCGTAGAACACGAGCGCCCCGGTTAGGACGCGAACCGTTGGGATACTTTCGATCACGCGG。實施例3RACE方法獲得不結(jié)球白菜NAC基因的全長片段(—)試驗方法根據(jù)已經(jīng)克隆的不結(jié)球白菜的NAC基因的保守片段序列分別合成5'和3'RACE擴增的內(nèi)側(cè)和外側(cè)巢式PCR引物R19647,R19648和R19649,R19650。具體序列為R19647:5'-GGA，AAG，CTC，CTA，AAG，GGA，TTA，AAA，CG-3';R19648:5'-CGA，ATT，GGA，TCA，TGC，ACG，AGT，ACA，GG-3';R19649:5'-GGA，GCT，TTC，CCA，GCG，TAA，AAG，ACT，AG-3';R19650:5'-CGG，TGG，CTT，TCC，AAT，AAC，CAG，TTC-3'。1)第一輪PCR(5'RACE)。PCR反應(yīng)體系10XPCRbuffer5.0iiL;dNTPs(各2.5mM)4iiL;不結(jié)球白菜cDNA模板1iiL(20ng);引物R16325(GGT，GGT，AGG，ATC，CGA，CCA，GTG，GTA，TCA，ACG，CAG)O.5iiL;引物R196490.5iiL;Ex-Taq0.4iiL(預(yù)變性后加入);加無菌水定容至50iiL。PCR反應(yīng)程序94t:預(yù)變性10分鐘；94t:變性30秒；55。C退火45秒；72t:延伸90秒；共35個循環(huán)；72t:延伸10分鐘。2)第二輪巢式PCR擴增(5'RACE)。PCR反應(yīng)體系10XPCRbuffer5.0iiL;dNTPs4iiL(各2.5mM);第一輪PCR產(chǎn)物(稀釋10倍)1iiL;引物R16323(AGG，ATC，CGA，CCA，GTG，GTA，TCA，ACG，CAG，AGT，AC)O.5iiL;引物R196500.5iiL;Ex-Taq0.4iiL;加無菌水定容至50iiL。PCR反應(yīng)程序94。C變性30秒；52。C退火45秒；72。C延伸90秒；共35個循環(huán)；72。C延伸10分鐘。按照下列程序進行3'RACE巢式PCR擴增1)第一輪PCR(3'RACE)。PCR反應(yīng)體系10XPCRbuffer5.0iiL;dNTPs(各2.5mM)4iiL;不結(jié)球白菜cDNA模板1iiL(20ng);引物R16326(GGT，GGT，AGA，GCT，CGC，AGG，ACT，GCA，GCT，GAC，TG)O.5iiL;引物R196470.5iiL;Ex-Taq0.4iiL(預(yù)變性后加入)；加無菌水定容至50iiL。PCR反應(yīng)程序94t:預(yù)變性10分鐘；94t:變性30秒；55。C退火45秒；72t:延伸90秒；共35個循環(huán)；72t:延伸10分鐘。2)第二輪巢式PCR擴增(3，RACE)。PCR反應(yīng)體系10XPCRbuffer5.0iiL;dNTPs4iiL(各2.5mM);第一輪PCR產(chǎn)物(稀釋IO倍)1iiL;引物R16324(AGA，GCT，CGC，AGG，ACT，GCA，GCT，GAC，TGA，CTA，C)O.5iiL;引物R196480.5iiL;Ex-Taq0.4iiL;加無菌水定容至50iiL。PCR反應(yīng)程序94。C變性30秒；52。C退火45秒；72。C延伸90秒；共35個循環(huán)；72。C延伸10分鐘。(二)試驗結(jié)果采用瓊脂糖凝膠電泳檢測5'RACE擴增得到一個約750bp條帶(圖4)。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測3'RACE擴增也得到一個約700bp條帶(圖5)。實施例4不結(jié)球白菜NAC基因全長序列獲得和分析(—)試驗方法將上述擴增產(chǎn)物分別回收后克隆入T-載體，測序后進行拼接。根據(jù)拼接的不結(jié)球白菜NAC基因序列，設(shè)計兩端引物R20215和R20216(序列分別為ATG，AAT，GCA，GAG，CTG，AAC，TTA，CCT，GC禾口CCC，CTG，TGG，AGC，AAA，ACT，CCA，ATT，C)，并進行PCR擴增得至lj全長的不結(jié)球白菜NAC基因片段。將上述擴增產(chǎn)物分別回收后克隆入T-載體，進行測序分析。(二)試驗結(jié)果采用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增得到全長的DNA片段約1200bp(圖6)。測序分析結(jié)果顯示不結(jié)球白菜NAC基因編碼閱讀框由837bp組成，編碼一個278個氨基酸的蛋白質(zhì)。具體的基因序列和氨基酸序列如下不結(jié)球白菜來源的NAC基因序列1GGGGGATTAC61TTTGAAGAGA121TTCCATCCAA181GAGATCTCAG241CCAGAGATGT301TACCCAAACG361GCTGATAAAC421GCTGGGAAAGCCACGCACCGACGATGCTGAAGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTCACGCAATCTTCAGCAGACGAAAGGAGAAGGAAAAAAAAAAATTGAACGAAGAGAGAAAAGAGAAAAGAATGAATGCAGAGCTGAACTTACCTGCAGGATTCCGACGGACGAAGAGCTTGTGAAATTCTACTTGTGCCGGAAATGCGCATCGGAGCTCCGGTTATCGCCGAAATCGATCTTTACAAGTTCAATCCTTGGGAGCTTCTCTGTACGGAGAGAAAGAGTGGTATTTTTTCTCACATAGAGACCGGAAGGTTCGCGTCCAAACCGGGCAGCTGGAACTGGTTATTGGAAAGCCACCGGACGATCGGTAAACCGAAGACGTTGGGTATAAAGAAAGCGCTAGTCTTTTACCTCCTAAAGGGATTAAAACGAATTGGATCATGCACGAGTACAGTCTCGCT481AATGTTGACA541TTATGTCGAG601CCGATGACCA661TTGCAAGAGG721GTTCAGAGCG781GGTGGCTCCA841TTTTATGATT901AGTTTTGCTC961GATGTGTTAG1021AGAGTGTTGA1081TCATCAGATA1141TTTATATGAAAAATTATACATTTTTCAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA不結(jié)球白菜來源的NAC基因的編碼的氨基酸序列，以單字母表示MNAELNLPAGFRFHPTDEELVKFYLCRKCASEEISAPVIAEIDLYKFNPWELPEMSLYGEKEWYFFSHRDRKYPNGSRPNRAAGTGYWKATGADKPIGKPKTLGIKKALVFYAGKAPKGIKT麗頂HEYSLANVDRSASVNKKNNLRLDDWVLCRVYNKKGTMEKYYPADEKPMTMTAASSPFDASDSTYPTLQEDDSSSSGGRVVSPDAREVQSEPKWGEFENAFDASMFGGGSMDLLQSEDFVPQFLYQPFYDFNSWQEDPPEQKPFL麗SFAPQG實施例5:擬南芥轉(zhuǎn)化(—)試驗方法1.電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌1)制備農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)，方法參照MicroPulserElectroporationApparatusOperatingInstructionsandApplicationGuide(BIO-RAD公司)(Rainerietal.，Bio.Tech.，1990，8:33—38)。2)取50iiLGV3101感受態(tài)細胞，加入1PLDNA，轉(zhuǎn)入O.2cm電擊杯轉(zhuǎn)化(400Q，2.5KV，25iif)。加入lmL含有1%甘露醇的LB培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng)2小時(28°C，250rpm)。分別取10iiL、100iiL涂LB平板(利福平50yg/mL，慶大霉素50yg/mL，氯霉素100yg/mL)。2.植物材料GATCAGCTTCTGTTAACAAAAAGAACAACCTTCGACTTGATGATTGGGTGTCTACAACAAGAAAGGGACCATGGAGAAGTACTACCCTGCTGATGAGAAATGACGGCGGCTTCATCGCCTTTCGATGCGTCGGACTCGACTTACCCGACGATGACTCGAGCAGCTCGGGGGGTCGCGTGGTGTCACCGGATGCGCGGGAGAGCCTAAATGGGGGGAGTTTGAGAATGCTTTTGATGCTTCCATGTTCGGTTGGACTTGCTGCAGAGTGAAGATTTTGTGCCTCAGTTCTTGTACCAGCCTTCAACTCCTGGCAGGAGGATCCGCCGGAGCAGAAACCGTTCTTGAATTGGCACAGGGGTGATAAAAAGGATAAGAGGGAAAGGTTTTTGGTCTGTGTTGTAGAGAAGTTTTCAATCATCTTTTGTTTTTTAGTAGTGAGAGAAAGATTGTTAGTTTTTTAGCATCTTCAATGTTTCATTGGTAGGTGAATTCTTGTTATT野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)生態(tài)型擬南芥Columbia。3.擬南芥的培養(yǎng)1)擬南芥種子在fC進行2-3天的春化處理，目的是有利于種子的一致萌發(fā)和花期的提前。2)將蛭石、黑土、珍珠巖按9:3:0.5的比例拌勻，經(jīng)高溫滅菌后裝于10cm的塑料小盆，以營養(yǎng)液PNS浸濕待用。3)以牙簽將擬南芥種子點播于濕潤的基質(zhì)上，保鮮膜封口。放置于22t:暗培養(yǎng)2-3天，待種子萌發(fā)后，揭開保鮮膜，置于22t:培養(yǎng)室中進行16小時光照培養(yǎng)。4)擬南芥抽苔后及抽苔后兩周以及轉(zhuǎn)化后需再以PNS營養(yǎng)液浸濕一次。中途可視情況適當(dāng)澆水。首次抽苔后需剪去初生苔，利于次生苔的生長，當(dāng)次生苔長至2-10cm(少數(shù)已經(jīng)開花)可用于轉(zhuǎn)化(細跑生物學(xué)雜志，1991，13,97-101)。4.擬南芥蘸花法轉(zhuǎn)化1)將擬南芥的花苔浸入滲透液中，輕輕攪動約5IO秒后取出，全部轉(zhuǎn)化完畢后，托盤中加入PNS營養(yǎng)液，以黑色塑料袋套盆封口，保持濕潤環(huán)境，置于22t:培養(yǎng)室低光強度下生長24小時，即可正常培養(yǎng)。2)初次轉(zhuǎn)化四天后，可再進行一次轉(zhuǎn)化，重復(fù)兩次，總共轉(zhuǎn)化三次，這樣可以在花發(fā)育的不同時期進行轉(zhuǎn)化，提高轉(zhuǎn)化效率。3)生長約兩個月后，收集種子，4t:冰箱貯存待用。5.擬南芥轉(zhuǎn)化植株種子的篩選1)稱25-30mg種子放入1.5mL離心管。2)lmL75%乙醇消毒lmin(不停搖晃振蕩)，8000rpm離心5秒，去上清。3)加入lmL過濾后的漂白粉消毒15min(不停搖晃振蕩，充分消毒)，8000rpm離心5秒，去上清。4)無菌水洗滌3-4次。5)將種子均勻的播撒到1/2MS平板(Hyg50iig/mL)上，Parafilm膜封口，4。C冰箱放置兩天，22°C，16小時光照培養(yǎng)6天。6)將抗性植株移栽到盆中培養(yǎng)，苗稍大后，進行GUS活性檢測，選出陽性植株(T》繼續(xù)培養(yǎng)，并收集種子進行T2代和T3代篩選。6.轉(zhuǎn)錄因子基因BrNAC轉(zhuǎn)化植物后的抗逆分析在22t:生長三個星期的野生型和轉(zhuǎn)基因植株用于低溫抗性實驗，將野生型和轉(zhuǎn)基因植株在4t:冰箱下培養(yǎng)48小時，然后放到_201:冷凍20min，然后再放回4。C冰箱放置過夜恢復(fù)，第二天再放回培養(yǎng)室恢復(fù)培養(yǎng)。結(jié)果表明，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的存活率有很大的差異。(二)試驗結(jié)果擬南芥經(jīng)過蘸花法轉(zhuǎn)化后生長約兩個月后，可以正常開花結(jié)子。經(jīng)過抗凍處理的轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥的存活率如表1所示。表1轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥的抗凍后存活率12<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>序列表〈110〉上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院〈120〉一種來源于不結(jié)球白菜的抗逆NAC轉(zhuǎn)錄因子基因〈130>0811542〈160>2〈170>PatentInversion3.3〈210>SEQIDNo1〈211>1196〈212>DNA〈213〉源于不結(jié)球白菜BrNAC抗逆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因〈400>11GGGGGATTAC61TTTGAAGAGA121TTCCATCCAA181GAGATCTCAG241CCAGAGATGT301TACCCAAACG361GCTGATAAAC421GCTGGGAAAG481AATGTTGACA541TTATGTCGAG601CCGATGACCACCACGCACCGACGATGCTGAAGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTCACGCAATCTTCAGCAGACGAAAGGAGAAGGAAAAAAAAAAATTGAACGAAGAGAGAAAAGAGAAAAGAATGAATGCAGAGCTGAACTTACCTGCAGGATTCCGACGGACGAAGAGCTTGTGAAATTCTACTTGTGCCGGAAATGCGCATCGGAGCTCCGGTTATCGCCGAAATCGATCTTTACAAGTTCAATCCTTGGGAGCTTCTCTGTACGGAGAGAAAGAGTGGTATTTTTTCTCACATAGAGACCGGAAGGTTCGCGTCCAAACCGGGCAGCTGGAACTGGTTATTGGAAAGCCACCGGACGATCGGTAAACCGAAGACGTTGGGTATAAAGAAAGCGCTAGTCTTTTACCTCCTAAAGGGATTAAAACGAATTGGATCATGCACGAGTACAGTCTCGCTGATCAGCTTCTGTTAACAAAAAGAACAACCTTCGACTTGATGATTGGGTGTCTACAACAAGAAAGGGACCATGGAGAAGTACTACCCTGCTGATGAGAAA661TGACGGCGGCTTCATCGCCTTTCGATGCGTCGGACTCGACTTACCCGACGTTGCAAGAGG721ATGACTCGAGCAGCTCGGGGGGTCGCGTGGTGTCACCGGATGCGCGGGAGGTTCAGAGCG781AGCCTAAATGGGGGGAGTTTGAGAATGCTTTTGATGCTTCCATGTTCGGTGGTGGCTCCA841TGGACTTGCTGCAGAGTGAAGATTTTGTGCCTCAGTTCTTGTACCAGCCTTTTTATGATT901TCAACTCCTGGCAGGAGGATCCGCCGGAGCAGAAACCGTTCTTGAATTGGAGTTTTGCTC961CACAGGGGTGATAAAAAGGATAAGAGGGAAAGGTTTTTGGTCTGTGTTGTGATGTGTTAG1021AGAGAAGTTTTCAATCATCTTTTGTTTTTTAGTAGTGAGAGAAAGATTGTAGAGTGTTGA1081TAGTTTTTTAGCATCTTCAATGTTTCATTGGTAGGTGAATTCTTGTTATTTCATCAGATA1141TTTATATGAAAAATTATACATTTTTCAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA〈210>SEQIDNo2〈211>278〈212>PRT〈213〉不結(jié)球白菜BrNAC轉(zhuǎn)錄因子基因編碼的蛋白質(zhì)〈400>2MetAsnAlaGluLeuAsnLeuProAlaGlyPheArgPheHisProThrAspGluGluLeuValLys15101520PheTyrLeuCysArgLysCysAlaSerPhePhelieSerAlaProVallieAlaGlulieAspLeuTyr2530354045LysPheAsnProTrpGluLeuProGluMetSerLeuTyrGlyGluLysGluTrpTyrPhePheSer50556065HisArgAspArgLysTyrProAsnGlySerArgProAsnArgAlaAlaGlyThrGlyTyrTrpLysAla7075808590ThrGlyAlaAspLysProlieGlyArgProArgThrLeuGlylieLysLysAlaLeuValPheTyr95100105110AlaGlyAlaProLysGlylieLysThrAsnTrplieMetHisGluTyrSerLeuAlaAsnValAsp115120125130135ArgSerAlaSerValAsnLysLysAsnAsnLeuArgLeuAspAspTrpValLeuCysArgValTyr140145150155AsnLysGlyThrMetGluLysTyrTyrProAlaAspGluLysProMetThrMetThrAlaAlaSer160165170175180SerProPheAspAlaSerAspSerThrTyrProThrLeuGinPheAspAspSerSerSerSerGly185190195200GlyArgValValSerPheAspAlaArgGluValGinSerGluProTyrTrpGlyGluPheGluAsnAla205210215220225PheAspAlaSerMetPheGlyGlyGlySerMetAspLeuLeuAspSerGluAspPheValProGin230235240245PheGlyTyrGinProPheTyrAspPheAsnSerTrpGinGluAspProProGluGinLysProPheGly250255260265270AsnTrpSerPheAlaProGinGly2751權(quán)利要求一種來源于不結(jié)球白菜的抗逆NAC轉(zhuǎn)錄因子基因，其具體序列如SEQIDNo1。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的來源于不結(jié)球白菜的抗逆NAC轉(zhuǎn)錄因子基因所對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列為SEQIDNo2。3.—種制備如權(quán)利要求1所述來源于不結(jié)球白菜的抗逆NAC轉(zhuǎn)錄因子基因的制備方法，包括如下步驟1)不結(jié)球白菜cDNARACE文庫的構(gòu)建，取生長健壯的不結(jié)球白菜苗采用冷酚法抽提總RNA。使用磁珠分離系統(tǒng)進行mRNA的分離。利用SMART技術(shù)合成cDNA第一鏈；2)不結(jié)球白菜NAC基因的保守片段的制備，以合成的不結(jié)球白菜cDNARACE文庫為模板，使用氨基酸序列特征設(shè)計的一對兼并引物對R16162:5'-CCNMGNGAYMGNAARTAYCCNAAYGG-3'和R16163:5，-TARNCKRTAYTCRTGCATDATCCA_3，，進行PCR擴增，該擴增產(chǎn)物回收后克隆入T-載體，經(jīng)過Blast比對為NAC基因的保守片段；3)RACE方法獲得不結(jié)球白菜NAC基因片段，使用兩對引物對不結(jié)球白菜NAC基因的保守片段序列分別合成5'和3'RACE擴增的內(nèi)側(cè)和外側(cè)巢式PCR，得到全長為1196bp的序列；4)制得不結(jié)球白菜NAC全長序列，以5'和3'RACE擴增得到全長為1196bp的序列涉及一對引物從不結(jié)球白菜cDNA文庫中PCR擴增得到全長的不結(jié)球白菜NAC基因。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的源于不結(jié)球白菜抗逆轉(zhuǎn)錄基因的制備方法，其特征在于所述步驟3)中的兩對引物分別為5'-GGAAAGCTCCTAAAGGGATTAAAACG-3';5'-CGAATTGGATCATGCACGAGTACAGG—3，禾P5，-GGAGCTTTCCCAGCGTAAAAGACTAG_3，；5，-CGGTGGCTTTCCAATAACCAGTTC_3，。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的來源于不結(jié)球白菜的抗逆NAC轉(zhuǎn)錄因子基因的制備方法，其特征在于所述步驟4)中的引物對為5'-ATGAATGCAGAGCTGAACTTACCTGC-3'和5'-CCCCTGTGGAGCAAAACTCCAATTC-3，。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的序列SEQIDNo1和SEQIDNo2在培育具有抗逆性植物中的用。全文摘要本發(fā)明公開了一種來源于不結(jié)球白菜的抗逆NAC轉(zhuǎn)錄因子基因，其在培育轉(zhuǎn)基因植物中具有增強植物抗逆性的作用。將轉(zhuǎn)BrNAC基因的擬南芥植株和野生型擬南芥植株對低溫脅迫的耐受性進行了比較，轉(zhuǎn)基因植株比野生型擬南芥有明顯的抗凍能力，這表明BrNAC的轉(zhuǎn)入提高了擬南芥植株的抗低溫的能力。文檔編號A01H1/00GK101736010SQ200810203368公開日2010年6月16日申請日期2008年11月25日優(yōu)先權(quán)日2008年11月25日發(fā)明者付曉燕,姚泉洪,莊靜,彭日荷,朱波,李賢,熊愛生,田永生,薛永,趙偉,金曉芬,高峰申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院