專利名稱：：一種泡桐4-香豆酸輔酶a連接酶基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種泡桐4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate:coenzymeAligase，4CL)基因及其應(yīng)用，屬于生物工程領(lǐng)域，特別涉及到泡桐科(Paulowniaceae)泡桐屬(Paulownia)白花泡桐〔Paulowniafortunei(Seem.)Hemsl)編碼4CL基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：1、關(guān)于泡桐及其泡桐木材的材質(zhì)改良泡桐(Paulownia)為泡桐科(Paulowniaceae)泡桐屬(Paulownia)落葉喬木，原產(chǎn)我國，除個(gè)別種分布到越南、老撾外，其他各種均為我國所特有。泡桐是世界三大優(yōu)質(zhì)、速生用材樹種之一，分布范圍很廣，二十三個(gè)省、市、自治區(qū)都有。不少地區(qū)作為四旁植樹、農(nóng)桐間作、林網(wǎng)建設(shè)的主要樹種；有些地方還逐漸向山地造林發(fā)展，栽培量很大，僅河南省栽植的泡桐就達(dá)二億株左右。泡桐生長快，如果管理得好，泡桐五六年即可成材。泡桐材質(zhì)輕，紋理鮮明美觀，具有易干燥、易加工、不翹、不裂、不易變形、不易燃燒、絕緣性好、耐酸耐腐、防濕隔熱、導(dǎo)音性能好等優(yōu)點(diǎn)，是單板與人造板生產(chǎn)的重要原料；特別適合制作航空、艦船模型、救生器械、樂器及家具制作等，不但用于工農(nóng)業(yè)及日常生活等各個(gè)方面，而且也是我國傳統(tǒng)的出口物資，在我國林業(yè)生產(chǎn)中占有特殊地位。但是應(yīng)該看到，泡桐材質(zhì)的另一面木材輕(容重低)，強(qiáng)度與硬度低，嚴(yán)重限制了它在建筑、交通、家裝、家具、造紙等方面的應(yīng)用。因此，改良泡桐的材質(zhì)，提高其強(qiáng)度與硬度，拓寬其應(yīng)用范圍，具有重大的應(yīng)用與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。泡桐的材質(zhì)改良有兩個(gè)方向一是提高其強(qiáng)度與硬度，拓寬其在木材建筑、交通、家裝與家具等方面的應(yīng)用；二是提高木材中纖維素的含量，降低其木質(zhì)素的比率，以提高紙漿的產(chǎn)量、降低對(duì)環(huán)境的污染，使之更適用于造紙。2、關(guān)于木材的材質(zhì)改良與4-香豆酸輔酶A連接酶基因的關(guān)系木材的材質(zhì)或特性主要是由木纖維的基本組分——木質(zhì)素、纖維素的單體種類、性質(zhì)及其比率與總量決定的。纖維素約占木材干重的4050%，木質(zhì)素約占1536%，二者總計(jì)占到木材總重的70%以上，且二者均直接或間接來源于光合作用產(chǎn)生的光合產(chǎn)物。纖維素是木材細(xì)胞中的骨架、韌性成分，是由葡萄糖組成的大分子多糖。木質(zhì)素是由對(duì)香豆醇、松柏醇、5-羥基松柏醇、芥子醇四種醇單體形成的一種復(fù)雜酚類聚合物。木質(zhì)素是木材細(xì)胞間的粘合劑、剛性原料和保持性物質(zhì)。木質(zhì)素生物合成是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，涉及苯丙氨酸裂解酶(PhenylalanineammonialyasePAL)、4-香豆酸CoA連接酶(4-coumarate:CoAligase4CL)、肉桂酸CoA還原酶(cinnamoyl-CoAreductaseCCR)等多個(gè)基因。這些基因的功能、作用不同，并分處在木質(zhì)素生物合成的源頭、中、下游的不同位置，其中PAL是位于源頭的第一個(gè)酶，處于最高端；4CL位于中游，而CCR則處于較下游的位置。這些酶中的任何一種酶，都不能缺失、不能替代；任一種酶的失常都將影響木質(zhì)素的合成，導(dǎo)致材質(zhì)的變化，且影響的范圍、形式與結(jié)果不同。木材材質(zhì)改良的實(shí)質(zhì)，就是通過改變木質(zhì)素、纖維素生物合成關(guān)鍵酶基因，調(diào)控木質(zhì)素、纖維素單體種類、性質(zhì)及其比率與總量。4CL是苯丙垸類代謝途徑的最后一個(gè)酶，其作用是催化不同羥基肉桂酸生成相應(yīng)的硫酯(CoA酯)，即4--香豆酰-CoA、阿魏酰-CoA、5-羥基阿魏酰-CoA和芥子酰-CoA—是木質(zhì)素合成的基本原料與前體。這些硫酯處于苯丙酸代謝途徑和木質(zhì)素特異代謝途徑的分支點(diǎn)。在此，4CL是木質(zhì)素單體合成途徑上的限速酶，決定著木質(zhì)素合成的方向與速度。增強(qiáng)4CL基因的表達(dá)，提高4CL酶的活性，可以提高木質(zhì)素在木材中的比率，增強(qiáng)其強(qiáng)度與硬度；反之，沉默或抑制4CL基因，可以降低其在木材中的比率，提高纖維素的比率，用于造紙則可提高紙漿的產(chǎn)量，降低木質(zhì)素對(duì)環(huán)境的污染。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種來源于泡桐科(Paulowniaceae)泡桐屬(Paulownia)白花泡桐〔Paulowniafortunei(Seem.)Hemsi〕的4_香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate:coenzymeAligase，4CL)基因序列及其相應(yīng)的氨基酸序列。提供了含有4CL的克隆載體PUC19/4CL，和含有這種載體的E.coli細(xì)胞JM109/pUC19/4CL。泡桐4CL基因的DNA序列或其片段通?？梢砸罁?jù)本發(fā)明提供的mRNA、氨基酸序列信息資料以PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。該基因全長2026bp，CDS1632(98-1729)bp，起始密碼子ATG位于98-lOObp處，終止密碼子TM位于1727-1729bp處；推測共編碼543個(gè)氨基酸，見SEQIDNo:l。通過GenBanKBLAST比對(duì)的結(jié)果，顯示泡桐與丹參(SalviamiltiorrhizaAY237164.1)、黃苳(ScutellariabaicalensisAB166768.1)、覆盆子(RubusidaeusAF239686.1)、毛果楊(PopulustrichocarpaEU603299.1)4_香豆酸CoA連接酶基因編碼序列的同源性分別為97。/c)、97%、96%、66%。泡桐與煙草4-香豆酸CoA連接酶氨基酸序列(GenBankAccessionNo:AAB18637.1)同源性為84%。對(duì)該基因及其氨基酸序列的進(jìn)化與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，泡桐的分類地位亦與現(xiàn)行植物分類一致。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測表明白花泡桐4CL基因全長cDNA編碼的4香豆酸CoA連接酶，含有預(yù)計(jì)的AMP—binding位點(diǎn)PYSSGTTGLPKG，催化活性反應(yīng)區(qū)GEICIRG和保守的Cys殘基(以方框標(biāo)示)，是典型的4CL蛋白。白花泡桐4CL基因全長cDNA序列已在GenBanK數(shù)據(jù)庫注冊(cè)，注冊(cè)號(hào)為FJ230968,見SEQIDNo:2。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的效果和益處在于該4CL是首次被克隆、測序和的白花泡桐(Paulowniafort匿i(Seem.)Hemsi〕4-香豆酸輔酶A連接酶基因，可用于構(gòu)建具有功能4-香豆酸輔酶A連接酶基因、基因的表達(dá)載體及其工程菌。該基因編碼的4-香豆酸輔酶A連接酶參與、影響植物木質(zhì)素合成代謝過程，可以改變陸生植物，特別是用材林樹種的木材結(jié)構(gòu)、組成與理化特性，及其應(yīng)用范圍、應(yīng)用價(jià)值?？梢詫⒈景l(fā)明提供的4C1基因編碼序列，或部分片段序列反向、或兩段完全相同部分序列分別以正、反方向插入(置于)來源于植物或病原微生物的、其特征為在植物中具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子、終止子之間，構(gòu)建成功能驚異的不同4CL基因或其構(gòu)建體。以目的或要求不同，可以構(gòu)建成在植物任何組織和任何發(fā)育時(shí)期表達(dá)的基因(選用在基因植物的組成型表達(dá)的啟動(dòng)子)、在植物組織器官或發(fā)育階段特異性表達(dá)的基因(選用組織器官或發(fā)育階段特異性表達(dá)的啟動(dòng)子)、或者是人為精確控制或特殊條件誘發(fā)基因(選用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)。這些基因或其構(gòu)建體的用途、應(yīng)用范圍，可以包括但不限于下列幾種類型。1、構(gòu)建功能的4CL基因，用于植物的種質(zhì)與材質(zhì)改良提高木材中木質(zhì)素的含量或比率，增加木材的硬度、強(qiáng)度，擴(kuò)大其應(yīng)用的范圍；提高農(nóng)作物或經(jīng)濟(jì)作物莖稈的抗倒伏能力，為高產(chǎn)奠定基礎(chǔ)等。2、以4CL基因的部分片段，構(gòu)建4CL基因的反義基因或RNA干擾基因，抑制植物內(nèi)源4CL基因的表達(dá)，木質(zhì)素合成受阻，導(dǎo)致木質(zhì)素含量減少。但是，木材另一主要成分是纖維素，二者之和約占到木材總量的7080%，切二者均直接或間接來源于植物的光合的碳代謝產(chǎn)物。在此，木質(zhì)素含量的大力減少，將嚴(yán)重影響植物碳化物流向與分配。由此，可以順理成章預(yù)見到這一基因的第三功能。3、以4CL基因的部分片段，構(gòu)建4CL基因的反義基因或RNA干擾基因，沉默植物內(nèi)源4CL基因，調(diào)控植物、特別是用材樹種木材中另一種主要成分一纖維素的代謝，育成高纖維素、低木質(zhì)素植物。本發(fā)明中4CL基因的克隆，采用的技術(shù)方案是基于基因的同源性，利用簡并寡核苷酸引物的RT-PCR法，以白花泡桐RNA為模板，首先用簡并引物，通過RT-PCR的方法，得到了4CL基因的部分cDNA片段。然后，據(jù)此片段提供的cDNA序列信息，設(shè)計(jì)了2條反向嵌套式引物與2條正向嵌套式引物，用RACE方法獲得了未知的5'和3'端基因片段。最后，將獲得的3條cDNA序列進(jìn)行拼接，獲得了白花泡桐4CL全長cDNA序列。將獲得的4CL基因片段與和專用的克隆載體pMD19-T連接，獲得pUC19-4CL質(zhì)粒。利用熱激法將這一質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)E.coli細(xì)胞JM109，成為攜帶pUC19-4CL的大腸桿菌細(xì)胞JM109/pUC19-4CL。圖1為4CL簡并引物擴(kuò)增片段電泳結(jié)果圖片。具體實(shí)施例方式一、本發(fā)明泡桐4-香豆酸輔酶A連接酶基因mRNA克隆的具體程序與方法、步驟這些步驟僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列步驟中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》、《實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例l:泡桐部分4CL編碼序列的克隆和測序1、簡并引物的設(shè)計(jì)通過GenBanKBLAST系統(tǒng)分析了植物4-香豆酸輔酶A連接酶蛋白氨基酸的同源性，選取其完全同源部分，優(yōu)選了2對(duì)簡并引物，下面列出了本發(fā)明所涉及的所有PCR引物。(1)簡并引物B4F75，-CACARCARGTHGAYGGHGAVAAYCC-3，B4R75，-CCWGCYTCDGTCATBCCRTADCCCTG_3，B4F85，-CACARCARGTHGAYGGHGAVAAYCC-3，B4R85'-CKRATGCARATYTCWCCRGSRTGRTT-3，(2)5，RACE引物OuterPrimer5，-catggctacatgctgacagccta-3，InnerPrimer5，-cgcggatccacagcctactgatgatcagtcgatg_3，4.5GSP15，CAAMCAATCGGCGGCACGAAGGGC3，4.5GSP25，AACGGAACAATATCGAATTTCTGCATGATCAGG3，(3)3，RACE引物3，RACE:OuterPrimer5，-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3'InnerPrimer5，-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3，4.3GSP15，CCCTTCGTGCCGCCGATTGTTTTG3，4.3GSP25'AAGAGCCCGGTGGTGGACAMTATGAC3'(4)反義的4CL基因片段4R414F5，-AGGATCCCATATGAGTGAGGGACTACGCATTGGAG-3'4R515R5，-GTCTAGAGCTCCGTCCGCACAGATGAMGGTC-3，(5)檢測引物4ceF5'GAAGGTGGCTCCTACAAATGC3'4ceR5'CAAGACCGGCAACAGGATT3，2、泡桐總認(rèn)A的提取取生長旺盛的幼嫩白花泡桐枝條，剝?nèi)ロg皮部，用清潔刀片刮取木質(zhì)部外周形成層部分的細(xì)胞，液氮研磨成粉，加入TaKaRa公司生產(chǎn)的總RNA提取試劑RNAisoReagent(D312)，提取RNA。3、反轉(zhuǎn)錄采用TAKARA公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄酶XL(ReverseTranscriptaseXLAMV)，以O(shè)ligodT為引物，以提取的總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液組成泡桐總RNA1ul5XRTBuffer4uldNTPMixture(各10mM)2ulRNaseInhibitor,/u1)0.5ulOligad(T)isPrimer(2.5uM)1ul旭V(5U/ul)2ulRNaseFreedH209.5ulTotal20ul反轉(zhuǎn)錄液加完后輕輕混勻，離心。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序室溫放置10分鐘；42'C恒溫槽中保溫1小時(shí)；冰水中急冷2分鐘。4、PCR反應(yīng):用TaKaRaLATaqHotStarVersion試劑盒進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)物組成如下(50u1):TaKaRaLATaqHS(5U/ul)0.5ul10XLAPCRBuffer5uldNTPMixture(各2.5mM)8ulB4F7(或B4F8)Primer(100mM)1ulB4R7(或B4R8)Primer(100mM)1ul反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2uldH2032.5ulTotal50ul反應(yīng)程序?yàn)?4°C30sec55°C30sec72°C40sec30Cycles72°C5min。反應(yīng)結(jié)束后，取8ul進(jìn)行電泳鑒定。結(jié)果顯示，擴(kuò)增出2條分別為0.38kb(3)、0.54(1)kb的片段，參見電泳圖片l。將此2個(gè)片段回收，插入pMD19-Tvector,轉(zhuǎn)化、挑單菌落鑒定、觀!l序。測序結(jié)果見SEQIDNo:3、SEQIDNo:4。以B4F7、B4R7簡并引物擴(kuò)增的片段385bp，以B4F8、B4R8簡并引物擴(kuò)增的片段541bp，與預(yù)期相符。以此2個(gè)DNA片段序列推測的氨基酸與煙草4CL的同源性均達(dá)到93%，可以確認(rèn)這兩個(gè)序列均為泡桐4CL基因的部分mRNA序列。實(shí)施例2:泡桐4CLmRNA5，上游未知序列的獲得一個(gè)優(yōu)選的方案是使用TaKaRa公司出品的5，-FULLRACEkit(CodeNo:D315)。這種技術(shù)系統(tǒng)第一步是磷酸化，第二步是去帽子，第三步才是加接頭，從理論上講其第一步就淘汰了所有丟失了"帽子"的、中間斷裂的、殘缺的、不完整的mRNA，致使所克隆的5'未知末端是完整的，所克隆的mRNA才有可能是全長的。同時(shí)采用了加特異性接頭與嵌套PCR等技術(shù)，使之可以高靈敏度、高特異性地?cái)U(kuò)增cDNA的5'末端的全長序列。依據(jù)獲得的簡并引物RT-PCR獲得泡桐4CL部分編碼序列，優(yōu)選了2條特異的嵌套式PCR引物，見實(shí)施例l中l(wèi)(簡并引物的設(shè)計(jì))。具體的克隆程序包括a.泡桐總RNA的提取同實(shí)施例1中2(泡桐總RNA的提取)；b.泡桐總RNA去磷酸化處理；c.去帽子反應(yīng)；d.5，RACE接頭的連接；e.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；f.以外測的特異性引物GSP1與5，RACEOuterPrimer見實(shí)施例1中1(簡并引物的設(shè)計(jì))進(jìn)行PCR反應(yīng)；g.以內(nèi)測的特異性引物GSP2與5'RACEInnerPrimer見實(shí)施例1中1(簡并引物的設(shè)計(jì))進(jìn)行PCR反應(yīng)。電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增的片段長0.93kb左右。電泳回收擴(kuò)增的片段，克隆于pMD20-T載體，轉(zhuǎn)化，菌落PCR鑒定、測序。測序結(jié)果見SEQIDNo:5。序列中顯示出InnerPrimer與4.5GSP2Primer的位置。序列中有效序列長897bp。實(shí)施例3:泡桐4CLmRNA3，下游未知序列的獲得一個(gè)優(yōu)選的方案是使用TaKaRa公司出品的3'-FULLRACECoreSetVer.20(CodeNo:D314)。這種技術(shù)系統(tǒng)使用加有特異性序列的Oligad(T)的接頭及其引物等技術(shù)，使得通過已知的部分cDNA序列，可以更靈敏、特異地?cái)U(kuò)增cDNA的3'末端序列。依據(jù)獲得的簡并引物RT-PCR獲得泡桐4CL部分編碼序列，優(yōu)選了2條特異的嵌套式PCR引物，見實(shí)施例l中l(wèi)(簡并引物的設(shè)計(jì))。具體的克隆程序包括a.泡桐總RNA的提取同實(shí)施例1中2(泡桐總RNA的提取)；b.套式PCR反應(yīng)先以外測的特異性引物GSP1與3'RACEOuterPrimer見實(shí)施例1中1(簡并引物的設(shè)計(jì))，進(jìn)行PCR反應(yīng)，再以內(nèi)測的特異性引物GSP2與3'RACEInnerer引物見見實(shí)施例1中1(簡并引物的設(shè)計(jì))進(jìn)行PCR反應(yīng)。電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增的片段長l.lkb左右。電泳回收擴(kuò)增的片段，克隆于pMD20-T載體，轉(zhuǎn)化，菌落PCR鑒定、測序。測序結(jié)果見SEQIDNo:6。序列中顯示出InnerPrimer與4.5GSP2Primer的位置。序列中有效序列長1091bp。實(shí)施例4:序列的拼接及其泡桐4CL全長niRNA的獲得將前述獲得的三個(gè)泡桐4CLmRNA部分序列，即以(1)5'RACE、(2)以簡并引物RT-PCR、(3)3'RACE分別獲得的泡桐4CLmRNA部分序列進(jìn)行拼接，獲得的了泡桐4CLmRNA全長序列，見SEQIDNo:2。一個(gè)優(yōu)選方案是，以3，RACERT-PCR反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(產(chǎn)物)為模板，4CLmRNA5，頂端部分序列作引物(5'—TGGATCCGAAMGGTTCAACTCTAGCA—3')與3，RACE的InnerprimerPCR獲得的片段，插入pMD-19Vector,經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑單克隆，菌落PCR鑒定、測序，獲得了攜帶泡桐4CLmRNA全長序列的cDNA的質(zhì)粒pUC19-4CL。二、關(guān)于克隆的泡桐4CL基因編碼序列的功能鑒定1、泡桐4CL反義基因及其表達(dá)載體的構(gòu)建為驗(yàn)證克隆的4CL基因的功能，構(gòu)建了4CL基因的反義基因。反義基因的啟動(dòng)子為CaMV35S;反義片段長502bp，位于泡桐編碼序列的414_915bp處，片段5'端酶切位點(diǎn)為Sacl，3'端酶切位點(diǎn)為BamHI。終止子為N0S-Ter。實(shí)際上這一反義基因是直接將這一4CL片段反向插入植物表達(dá)載體pBIl(GenBanK:AF502128)的相應(yīng)位點(diǎn)，即取代GUS編碼序列而完成的。該基因構(gòu)建完成后，以HindIII、EcoRI將其切出，插入植物表達(dá)載體pCAMBIA3301質(zhì)粒相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建成該基因的表達(dá)載體。2、4CL反義基因轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化材料，煙草(K326);轉(zhuǎn)化方法采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法3、4CL反義基因轉(zhuǎn)化泡桐株系的分子鑒定以轉(zhuǎn)化植株總DNA為模板，檢測引物正、反向引物分別設(shè)計(jì)在啟動(dòng)子CaMV35S、終止子Nos-Ter區(qū)(引物4ceF、4ceR序列見實(shí)施例l中l(wèi)(簡并引物的設(shè)計(jì)))，PCR。擴(kuò)增片段長871bp。4、4CL基因RNA干擾體轉(zhuǎn)化泡桐株系木質(zhì)素、纖維素的變化(l)材料及處理選取移栽后生長正常、株高20-30厘米的轉(zhuǎn)基因煙草5株及對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因煙草)，分別剪取3(第3-4)葉片，IO(TC、4小時(shí)烘至恒重。(2)纖維素含量分析精確稱取干燥后的樣品10mg，加入250uL72%H2S04，30°C1h，加水4.5mL，120。C第2次消化lh，然后取O.75mL上清，稀釋成3mL，加入2mL斐林試劑混合后，沸水浴煮沸15min后流水冷卻，1500r/min5min，取上清測0D590，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，讀取樣品溶液的濃度，從而算出樣品中的纖維素含量。(3)木質(zhì)素含量分析:精確稱取干燥后的樣品100rng,樣品處理同纖維素含量測定方法.第2次消化后，將熱溶液通過砂心漏斗過濾，并用熱水沖洗，殘?jiān)诟稍锏募埳?0。C烘干4h，作為木質(zhì)素含量值。分析結(jié)果見表l。表l轉(zhuǎn)基因煙草纖維素、木質(zhì)素分析結(jié)果(樣品量100mg)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>對(duì)轉(zhuǎn)泡桐4CL反義基因煙草纖維素、木質(zhì)素含量與比率的測定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化的泡桐4CL基因?qū)煵莸睦w維素的含量升高了3.57%，平均升高了5.26%;木質(zhì)素降低31.5mL41.8y。，平均降低了37.4%。纖維素與木質(zhì)素二者間差異不顯著。這些結(jié)果表明，克隆的泡桐4CL基因是有活性的，可以嚴(yán)重影響木質(zhì)素的合成，改變其在植物中的含量與比率，同時(shí)也會(huì)對(duì)纖維素的合成構(gòu)成影響。三、關(guān)于本基因的應(yīng)用說明1、關(guān)于相關(guān)基因的構(gòu)建由于本發(fā)明的公開，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以利用其公知的技術(shù)，構(gòu)建成多種不同的基因與具有特殊功能的構(gòu)建體，例如植物組織器官、發(fā)育階段特異或者非特異表達(dá)的4C1基因。植物組織器官、發(fā)育階段特異或者非特異表達(dá)的反義基因。植物組織器官、發(fā)育階段特異或者非特異表達(dá)的4C1基因的RNA干擾體。當(dāng)然，4CL基因可以構(gòu)建的功能基因(或功能體)包括，但不限于這些。2、表達(dá)載體的構(gòu)建及其應(yīng)用這些構(gòu)建好的功能基因到其功能的實(shí)現(xiàn)，即將功能基因轉(zhuǎn)入植物，到轉(zhuǎn)建立已是常規(guī)技術(shù)，其程序包括四個(gè)部分(1)表達(dá)載體的構(gòu)建以HindIII、EcoRI酶將構(gòu)建好的功能基因表達(dá)盒切出，插入植物表達(dá)載體pCAMBIA3301等質(zhì)粒相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建成這些功能基因的表達(dá)載體。(2)將攜帶功能基因的表達(dá)載體以液氮凍融法轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌LBA4404。(3)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將功能基因轉(zhuǎn)化植物材料。(4)轉(zhuǎn)化體選擇與鑒定包括抗性選擇；組織化學(xué)、DNA、RNA及蛋白質(zhì)水平的系統(tǒng)鑒定；生長特性、遺傳穩(wěn)定性、生物安全性及生產(chǎn)特性鑒定等，最終實(shí)現(xiàn)改良植物，建立具有目的性狀或特性的新型植物。這些規(guī)程與技術(shù)已是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，可以利用公知的技術(shù)完成、應(yīng)用。序列表<110>河南省綠士達(dá)林業(yè)新技術(shù)硏究所<120>4-香豆酸輔酶A連接酶基因及其應(yīng)用(160>4〈21()>1<211>543〈212>PRT<213>泡桐(Paulownia)〈221〉B勵(lì)I(lǐng)NG<222〉(188)…(199)<221>DOMAIN<222>(387)...(393)<400>1ThrThrMETGlu1LysLeuProAspTyrCysPheGlulieAsnGlyA丄aGlyTyrValPheLeulieGinGinAlaAspAlaThrMETAlaAsnAlaLysValGluAlsSerLysVa丄lie5lie20Asn35Thr50Lys65Thr80Phe95PronoAsn125Arg140ThrTyr工leLysGinlieProSerLysAsnGluValValAlaThrlieLeuLeuLeuGlyAlaPhePheThrAlaAsp!LysLeuTyrAlaGluAsp10LysHis25PheSer40TyrThr55GlyLeu70LeuLeu85SerTyr100ProAls115工lelie130LeuGlu145ThrTyrSerArgProGluGluLysLeulieliePheArgSer15ILeuPro!LeuHisSer30CysLeu45ValGlu60Glylie75ProAsnSerProGlu90lieGlyAlalieSer105GluVal工leLysGin120CysTyr135LysVal150ThrGinAlaLysGlyValMETCysI丄eAspAla155LeuThrSerAlaAsp170ProAspAspValVal186|LeuPro!LysGly|Val200ValAlaGinProSerAlaAspCysLeuGinPheSerGlu160165GluArgAspMETProAlaValLyslieHis175180AlaLeu|ProTyrSerSerGlyThrThrGlyGinSerGluAspValSerLeuAsnSer工leLeulieMET工leGinLysTyrLysValThr工丄eValLeuAlalieSerSerValArgGluLeuGluAspTyrGlyGinGlyCysLeuAlaCysGlyThrGluThrGly工leArgGlyPheValAlaAspSerThrGluGlyPheAsplieGlyArgLeuLysAlaGluLeuGluGluAlaAlaValValValAlaPheValVal215MET230Val245Gin260Eys275Val290Thr305Ala320Gly335Ala350Val365Ser380Gin395Thr410lie425工le440Ala455Pro470Val485190METLeuThrHisLys205AspGlyGluLeuCysValLeuLeuCysLysPheAspLysSerProValMETSerValArglieMETThrGluLysGluProArgAsnAlaLeuGlyArg工leMETLys工leAspLysAspThrAsplieLysTyrLeuLeuLeuMETLysAspArgSerAsnAsnPro220LeuPro235GlyLeu250lieVal265G丄yPro280ValVal295GlyAla310!LysPhe325A丄aGly340PheGlu355GluMET370AsnGin385GlyTyr400AspGly415AspGlu430!LysGly445AsnHis460GluGin475GlySer490GlyLeuValAsnLeuTyrLeuPheHisArgValGlyProPheljeuPheValProAspLysTyrAlaProLeuProAsnAlsProValLeulieLysPro!LeuLysSer工leValGlyGluAsnAspTipLeuHisLeuPhe工lePheGinValProAlaThrTyr工leGlyGlu工丄eThr195ThrSer210lieHis225lieTyr240AlaAla255GluLeu270Prolie285AspLeu300GlyLys315!LysLeu330AlaMET345GlyAla36CAsplie375工leCys390LeuGlu405ThrGly420ValAsp435Al3Pro450SerAsp465ValPro480GluAsp495<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>tgaaatgaaaeittgttgacatcgaaactggtgcttctctaggccgtaaccagcctggaga1260aatctgtattagaggtgaccagattatgaaaggttatttgaatgatttagagtcgacaga1320gggtacaatagacaaagatgggtggttacacaccggcgacatagggttcat"tgatactga1380cgacgagctcttcatcgttgatcgattgaaggaaataatcaagtacaaaggattccaagt1440tgcaccggctgaactcgaagccctcctcctcaaccacccctacatctctgatgcagcagt1500tgtacccatgaaagatgagcaagctggagaagtaccagttgcttttgttgtaagatc犯a1560tggttccaccatcactgaggatgaaatcaagcaatttatttccaagcaggtggtcttctacaagagaataaatcgtgtgtttttcattgatgccattcccaagtctccatcaggcaaaat1680attgagaaaggatttgagagcaagattagcagctggtgttccaaattaaaaatcta犯tc1740acatataatttctgtctagaattttttttttttttttaaattactcaatttggaaattca1800aggacaaatgttgcttgtaaattaattatatgtgtaaggttttaaattctggaagacaag1860tttggagcaatatcttggtaatcctacaatgttaggagcaatatatgtaatttttttttt1920ttatattttttggttttttcccctctttgtatcctaattttttactgcaaaattaaagac1980caaagtatttgttgtttatatgtactttctttttctcaaaaaaaaa202權(quán)利要求1、一種泡桐4-香豆酸輔酶A連接酶編碼蛋白，其氨基酸殘基序列如SEQIDNo1所示。2、一種泡桐4-香豆酸輔酶A連接酶編碼基因，其堿基序列如SEQIDNo:2所示。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種泡桐4-香豆酸輔酶A連接酶的編碼基因。4、含有權(quán)利要求3所述的一種泡桐4-香豆酸輔酶A連接酶的編碼基因的表達(dá)載體。5、含有權(quán)利要求3所述的一種泡桐4-香豆酸輔酶A連接酶的編碼基因的宿主菌。6、權(quán)利要求3所述的一種4-香豆酸輔酶A連接酶的編碼基因在泡桐及其他植物材質(zhì)改良中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種泡桐4-香豆酸輔酶A連接酶及其編碼基因與應(yīng)用。該4-香豆酸輔酶A連接酶氨基酸殘基序列如SEQIDNo1所示。利用這些信息可以構(gòu)建成4-香豆酸輔酶A連接酶基因、或該基因的反義基因、RNA干擾體，用于植物材質(zhì)改良，可以建立起木質(zhì)素含量高、或低的新種質(zhì)材料。文檔編號(hào)A01H1/00GK101434937SQ20081023147公開日2009年5月20日申請(qǐng)日期2008年12月23日優(yōu)先權(quán)日2008年12月23日發(fā)明者劉志剛,葉金山,楊艷坤,熊治國,牛靜勇,王軍軍,裴海朝,陳占寬,陳昌民申請(qǐng)人:河南省綠士達(dá)林業(yè)新技術(shù)研究所