專利名稱：：R基因作為選擇標(biāo)記在植物轉(zhuǎn)化中的用途和同種源基因在植物轉(zhuǎn)化中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，特別是茄科植物(5Wa"flceae)優(yōu)選馬鈴薯的植物轉(zhuǎn)化。
背景技術(shù)：
：自/人上世紀(jì)70年代末和80年代初發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌(JgroZ^"er/wwspp.)的Ti質(zhì)粒(胂瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒)可以用作植物遺傳工程中的載體后，人們就已經(jīng)知曉使用轉(zhuǎn)化細(xì)菌如農(nóng)桿菌進(jìn)行植物的轉(zhuǎn)化以獲得表達(dá)目的異源基因或基因片段的轉(zhuǎn)基因植物。野生型的質(zhì)粒誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞，但是可以將其修飾使得其可以攜帶外源基因構(gòu)建體進(jìn)入細(xì)胞而不必使受體細(xì)胞腫瘤化。在肺瘤誘導(dǎo)期間，被稱為T-DNA(轉(zhuǎn)移DNA)的Ti質(zhì)粒的特異性片段整合到宿主植物核DNA中。在植物的遺傳工程中，所述T-DNA被修飾并攜帶待整合到植物DNA上的外源基因構(gòu)建體，由此可以獲得轉(zhuǎn)基因植物。用于獲得轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)化過程通常包括用轉(zhuǎn)化細(xì)菌感染植物細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)化細(xì)菌通常包括基本無致瘤性的農(nóng)桿菌林，所述細(xì)菌帶有包含T-DNA載體構(gòu)建體并允許所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物細(xì)胞基因組的重組核酸，所述構(gòu)建體主要包含希望在最終的轉(zhuǎn)化植物中表達(dá)的所需核酸、基因或基因片段，和選擇性標(biāo)記核酸或選擇基因。此所需的外源基因和標(biāo)記通常位于質(zhì)?；蜉d體的T-DNA片段中，其是與至少一個同向重復(fù)側(cè)面相接，或位于兩個不完全相同(imperfect)的同向重復(fù)(最通常長度為24個堿基對，稱為T-DNA邊界)之間的DNA。外源基因/選擇基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物細(xì)胞發(fā)生在細(xì)菌vir基因(位于相同或不同的質(zhì)粒上)參與調(diào)節(jié)T-DNA/基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)移重復(fù)的缺口，由此在T-DNA邊界^^質(zhì)粒中切下T-DNA構(gòu)建體并將其插入到植物基因組中。通過使由此處理的植物細(xì)胞在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中生長，可以再生出完整的植物，其中部分植物帶有所需的基因。為了在未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的背景中選擇所需轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，將編碼所述選4奪基因的DNA和使其表達(dá)的工具與T-DNA上的目的基因物理連接，從而可以回收轉(zhuǎn)化體。T-DNA中存在所述選擇或標(biāo)記序列通常被視為有效回收的絕對條件；否則需要篩選數(shù)萬乃至數(shù)十萬的假定轉(zhuǎn)化體以確定所需異源基因的存在和功能性插入。與之相反，假定轉(zhuǎn)化體通常在選擇性培養(yǎng)基或選擇性壓力下生長，這適合所選擇的選擇性標(biāo)記賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇性優(yōu)點(diǎn)，從而使其超過最初過剩存在的未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。歷史上，植物選擇標(biāo)記是在表達(dá)后對加入到再生培養(yǎng)基中的選擇性試劑產(chǎn)生抗性的顯性基因，但其本身不是細(xì)胞生長所必需的。將此選擇性試劑(如抗生素、除草劑、氨基酸或氨基酸類似物)以毒性濃度加入到植物或植物培養(yǎng)基中。在植物轉(zhuǎn)化中最廣泛使用的選擇性標(biāo)記或選擇基因是，EP131623中所述的提供對選擇性試劑卡那霉素抗性的細(xì)菌新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptl、nptll和nptIII基因)和EP186425中所述的提供潮霉素抗性的細(xì)菌aphIV基因。EP275957公開了來自綠色產(chǎn)色鏈霉菌(S化e;tom;;c^vzW^c/7/'owoge"es)提供對除草劑草銨磷(phosphinotricin)抗性的乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的用途。EP218571中提到了提供對除草劑草甘膦相對抗性的植物基因。所述抗性是基于編碼對N-磷酸曱基甘氨酸相對耐受的5-烯醇丙酮莽草酉吏-3-石舞酸酉旨合醇(5-enolshikimate-3隱phosphatesynthase(EPSPS))的基因的表達(dá)。某些氨基酸如賴氨酸、蘇氨酸、或賴氨酸衍生物氨基乙基胱氨酸(ACE)和色氨酸類似物如5-甲基色氨酸，由于其在高濃度應(yīng)用時具有抑制細(xì)胞生長的能力，也可以被用作選擇性試劑。在此選擇體系中，可選擇的標(biāo)記基因的表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因細(xì)胞過量產(chǎn)生氨基酸，從而允許轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在選擇條件下生長。的條件下生長和增殖的標(biāo)記，如缺乏植物生長激素的條件。選擇標(biāo)記基因能夠編碼一種酶，在其中碳源被換成非轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能直接利用的加密(encryptic)碳源或潛在碳源的條件下，這種酶表達(dá)后將加密碳源轉(zhuǎn)化為支持轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞在包含最低營養(yǎng)物的條件下生長和增殖的碳源。此正選擇標(biāo)記的實(shí)例為將不可利用的甘露糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為可以用作植物細(xì)胞碳源的果糖-6-磷酸的磷酸甘露糖異構(gòu)酶(參見US6143562),或來自銹棕色鏈霉菌d一畫戸sn^/一o愿)的木糖異構(gòu)酶(HaldrupA.等，1998,PlantCellReport18:76-81)。另一類選擇標(biāo)記基因允許對可能的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞進(jìn)行篩選，而非對抵抗毒性物質(zhì)如抗生素的轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行直接遺傳選擇。因此，它們通常也被稱為篩選性標(biāo)記。這些基因被稱為報(bào)告基因并包括如|3-葡萄糖醛酸酶(GUS)、P-半乳糖苷酶、熒光素酶和綠色熒光蛋白(GFP)?；蛘撸Y選性標(biāo)記可以提供一些其它可視性反應(yīng)應(yīng)答。例如，在某物質(zhì)外觀或生長模式，所述物質(zhì)可以直接應(yīng)用于植物或植物細(xì)胞中，或存在于植物或植物細(xì)胞生長培養(yǎng)基中。通常，包含此篩選性標(biāo)記基因的植物或植物細(xì)胞具有可用于鑒定的獨(dú)特表型，即它們可以與未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞相區(qū)別。這些特征表型允許鑒定包含構(gòu)建體的細(xì)胞、細(xì)胞群、組織、器官、植物部分或整個植物。形態(tài)異常誘導(dǎo)(MAI)標(biāo)記基因的實(shí)例是來自農(nóng)桿菌的異戊烯轉(zhuǎn)移酶基因(Keller等，WO00/37060)。異戊烯轉(zhuǎn)移酶是植物生長激素細(xì)胞分裂素生物合成中的限速酶。引入—基因的植物細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞分裂素，結(jié)果是包含^基因的細(xì)胞的增殖和分化被打亂，引起了各種形態(tài)異常。在最終獲得的轉(zhuǎn)基因植物中，非內(nèi)源序列如農(nóng)桿菌T-邊界和抗生素抗性基因和其它選擇性標(biāo)記序列的存在在大多數(shù)情況下被認(rèn)為是不需要的。雖然這些序列被認(rèn)為是轉(zhuǎn)化過程所必需的，但其通常對最終幹化植物的確沒有積極作用，且事實(shí)上出于多種原因消費(fèi)者想要減少它。根據(jù)轉(zhuǎn)基因選擇基因橫向轉(zhuǎn)移進(jìn)入腸道細(xì)菌的理論風(fēng)險(xiǎn)，消費(fèi)者組織對食物產(chǎn)品中抗性標(biāo)記的廣泛分布表示關(guān)注。環(huán)境組織關(guān)注轉(zhuǎn)基因植物和相關(guān)物種間交叉授粉的風(fēng)險(xiǎn)，這會導(dǎo)致抗性性狀轉(zhuǎn)移到雜草中，危害轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的長期使用并引起潛在的生態(tài)學(xué)問題。到目前為止已經(jīng)開發(fā)了許多系統(tǒng)來幫助去除選擇性標(biāo)記基因。兩種不同構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化可以導(dǎo)致整合有兩個轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因系，且在遺傳交叉后選才奪性標(biāo)記可以與目的基因隔離開來。如WO95/16031、US6265638和WO00/18939中提出了通過共轉(zhuǎn)化去除選擇性標(biāo)記基因。然而，共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)需要標(biāo)記基因定位于非連鎖的位置，意味著篩選許多更獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件。然而，許多交叉授粉且特別是無性繁殖的農(nóng)作物(如蘋果或草莓)，和特別是塊莖狀的農(nóng)作物如馬鈴薯和木薯是高度雜合的，因此通過遺傳分離去除標(biāo)記序列有可能需要很多年才能發(fā)現(xiàn)具有適合的田間作業(yè)性能的克隆?，F(xiàn)已采用多個轉(zhuǎn)座性元件系統(tǒng)和位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)以去除標(biāo)記(SugitaK等，2000PlantJ22:461-469;Zuo等，2001NatureBiotech19:157-161)。EP716147描述了用于將所需基因引入植物的載體，其包含目的基因和位于可除去的DNA元件(即轉(zhuǎn)座性元件或位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng))上的至少一個形態(tài)異常誘導(dǎo)(MAI)標(biāo)記基因。通過肉眼觀察其異常的枝形態(tài)可以很容易地檢測到由包含MAI的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物。同樣，在轉(zhuǎn)座性元件轉(zhuǎn)座后或重組系統(tǒng)位點(diǎn)特異性去除后MAI基因功能的缺失可以很容易地通過正常形態(tài)的枝來檢測。無需進(jìn)行雜交步驟即可使此類轉(zhuǎn)基因植物不含標(biāo)記基因。這些系統(tǒng)需要表達(dá)轉(zhuǎn)座酶或重組酶，其介導(dǎo)插入到重組或轉(zhuǎn)座酶靶序列間的區(qū)域刪除，隨后通過遺傳分離去除標(biāo)記基因。此外，這些系統(tǒng)比較耗時，且對于主要為無性繁殖的物種也不切實(shí)際。此外，刪除的片段可以再插入到基因組的其它位置。另一個誘導(dǎo)DNA刪除的方法是基于兩個同源序列間的染色體內(nèi)的同源重組。染色體內(nèi)的同源重組頻率通常很低，從而不能使此系統(tǒng)有效應(yīng)用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因區(qū)域的刪除。使用噬菌體入的attP區(qū)可以增加此重組頻率(ZubkoE等，2000NatureBiotech18:442-445)。然而，此過程仍舊不可預(yù)期且效率低至不能產(chǎn)生數(shù)百至數(shù)千個獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件以發(fā)現(xiàn)具有適合農(nóng)業(yè)性能的克隆。不使用選擇標(biāo)記來回收轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的系統(tǒng)已有描述。在WO98/51806中，公開了使用結(jié)節(jié)培養(yǎng)和非選擇性篩選分析通過富集轉(zhuǎn)基因部分而不使用選擇性標(biāo)記來回收轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法。此方法包括培養(yǎng)包含非選擇性的可分析的轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞或組織，直到發(fā)育出包含分生組織的節(jié)。隨后，使用非選擇性分析如酶分析或ELISA測定植物組織。通過此方法回收的陽性分析的植物是嵌合的且具有轉(zhuǎn)化的部分。為了從陽性分析的組織中富集這些轉(zhuǎn)化的部分，制備了節(jié)外植體并培養(yǎng)形成枝。再次用非選擇性分析來測定枝和葉，希望所回收富含轉(zhuǎn)化部分的植物，使得最終在幾輪分析后能夠獲得接近均一的轉(zhuǎn)基因植物。WO03/010319描述了獲得包含重組核酸的無標(biāo)記植物的方法，所述重組核酸包含T-DNA構(gòu)建體并允許所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物細(xì)胞基因組，所述構(gòu)建體具有的外源核酸不含編碼選擇標(biāo)記的核酸。此方法包括轉(zhuǎn)化不包含分生組織部分，即結(jié)間的莖段、葉、塊莖盤、花、花粉和/或根的植物組織，和用不含選擇性標(biāo)記或報(bào)告基因的T-DNA處理植物細(xì)胞或組織。隨后，植物細(xì)胞經(jīng)歷愈傷組織期，植物將由此發(fā)育。隨后，使用非選擇性分析如PCR、酶分析或ELISA測定植物組織。通過此方法回收的陽性分析的植物是非嵌合的且不必經(jīng)歷費(fèi)時的雜交步驟。已證明此方法非常有用。WO05/004585描述了獲得包含重組核酸的無標(biāo)記植物的方法，所述重組核酸包含沒有選4奪性標(biāo)記的所謂P-DNA構(gòu)建體以及具有選擇性抗生素標(biāo)記的構(gòu)建體。通過對暫時標(biāo)記基因表達(dá)的正選擇以及對標(biāo)記整合的負(fù)選擇，可以鑒定包含P-DNA插入但缺少任何標(biāo)記基因拷貝的植物細(xì)胞。然而，仍需要其它備選的轉(zhuǎn)化方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明進(jìn)一步提供了植物轉(zhuǎn)化過程中備選的選擇方法。除了在大多數(shù)情況下認(rèn)為在獲得的最終轉(zhuǎn)基因植物中不需要存在有抗生素抗性基因和其它選擇性標(biāo)記序列的事實(shí)外，通常更不愿在轉(zhuǎn)基因植物中存在非^4物序列(即異種源序列，transsequences)。許多可商購的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物包含外源調(diào)節(jié)元件，如花椰菜花葉病毒的35S啟動子和農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因的終止子。Rommens等(2004)說明了獲準(zhǔn)用于商業(yè)的轉(zhuǎn)基因植物平均包含8個源自病毒、細(xì)菌或植物的遺傳元件，所述植物與耙農(nóng)作物是兩性間不相容的，即不可能通過傳統(tǒng)的植物培育而發(fā)生基因滲入。因此本發(fā)明提供了具有附加的核酸序列的植物，但是此遺傳修飾的植物基本上由同種源植物序列(cisplantsequences)組成，例如遺傳修飾的馬鈴薯植物，其具有來自另一馬鈴薯品種、培育克隆或可雜交物種的附加的(基本是)馬鈴薯植物(編碼的)序列。此同種源植物序列處于其天然的遺傳背景中，即受其自身啟動子的控制，具有內(nèi)含子和其自身的轉(zhuǎn)錄終止信號。在下文中此類轉(zhuǎn)基因植物也被稱為同種源基因(cisgene)植物?；蛘?，實(shí)施方案描述了產(chǎn)生包含源自兩性相容組內(nèi)多種基因的遺傳元件的植物的方法。具有此遺傳元件的植物-波稱為基因內(nèi)植物(Rommens等，TIPS2007)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，商業(yè)上感興趣的馬鈴薯植物(如Desiree或Bintje)帶有分離自其它馬鈴薯品種(如來自野生種馬鈴薯如6w/6固"謹(jǐn)m)的核酸序列。優(yōu)選地，獲得的遺傳修飾的茄屬植物(So/am/m)包含茄屬植物5，和3，序列以指導(dǎo)cDNA序列或基因組序列的轉(zhuǎn)錄。相對于所用的5，和3'序列，所用的cDNA或基因組序列可以是正義或反義的方向。5，和3'序列最初可以連接所用的cDNA或基因組序列，或它們通常可以連接到茄屬植物中的另一編碼序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的編碼序列是基因組序列(正義或反義方向)，且所用的5，和3，序列是連接到在正常條件下的基因組序列的一類序列(即5，和3'序列可操作地連接其自然編碼序列)。本發(fā)明提供用于獲得具有目的核酸的植物的方法，包括提供包含所述目的核酸的重組核酸，將所述重組核酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，從所述細(xì)胞生產(chǎn)植物，和確定存在所述目的核酸且不存在載體骨架和/或邊界序列，其中所述目的核酸(或待轉(zhuǎn)移的DNA,如T-DNA)基本上為植物核酸。對于不含載體DNA序列的轉(zhuǎn)化體的生產(chǎn)，需要遞送DNA至細(xì)胞中，所述細(xì)胞不包含在細(xì)菌宿主如大腸桿菌(￡.co/0中維持質(zhì)粒載體所必需的DNA序列，如抗生素抗性基因，包括但不限于氨千青霉素、卡那霉素和四環(huán)素抗性，且不包含原核生物的DNA復(fù)制起點(diǎn)(在此情況中，可以在轉(zhuǎn)化前純化包含轉(zhuǎn)化DNA的DNA片段。可以通過如瓊脂糖凝膠電泳和隨后從瓊脂糖中回收DNA片段來實(shí)現(xiàn)純化)。通過測試是否存在載體或載體骨架或邊界序列，本發(fā)明提供了用于確定植物是否具有包含目的核酸的重組核酸的方法，包括任選地進(jìn)一步提供帶有功能性R基因的所述重組核酸，將所述重組核酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，從所述細(xì)胞生產(chǎn)植物，和使得到的植物接觸至少一種疫霉屬(/V^top/zAora)的激發(fā)子，并確定是否存在對所述至少一種激發(fā)子的反應(yīng)，還包括確定是否存在非茄屬植物核酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非茄屬植物核酸序列為非茄屬植物T-DNA邊界序列，即在優(yōu)選的實(shí)施方案中測試存在還是不存在T-DNA邊界序列，特別是在使用至少一種非茄屬植物T-DNA邊界序列的情況中。待轉(zhuǎn)移的核酸序列不含編碼選擇性標(biāo)記或報(bào)告基因的核酸序列，但是可以存在同種源基因標(biāo)記或報(bào)告子序列。然而，所述方法基本不需要通過選擇性試劑處理來進(jìn)行選擇。反之，例如使用如公知的核酸技術(shù)，如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測或在常規(guī)Southern雜交實(shí)驗(yàn)中與互補(bǔ)序列雜交檢測，從而通過測試目的核酸的存在來實(shí)現(xiàn)對所需轉(zhuǎn)化體的選擇。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是可以通過監(jiān)測基因表達(dá)產(chǎn)物存在與否或其量的變化來檢測所需外源基因或基因片段的存在。例如，對于可由ELISA(酶聯(lián)免疫吸附)檢測的表本文中的術(shù)語"所述目的核酸基本上為植物核酸"是指從植物(優(yōu)選茄屬植物)獲得/來源/分離的序列，即待轉(zhuǎn)移的核酸序列基本上為茄屬植物核酸序列。例如如果選擇農(nóng)桿菌/二元載體方法作為轉(zhuǎn)移方法，則存在于T-DNA上的序列(即待轉(zhuǎn)移的部分)基本上為茄科植物核酸序列。所用二元載體的邊界序列以及骨架可包含非茄科植物核酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的植物細(xì)胞屬于茄科植物。這導(dǎo)致產(chǎn)生所謂同種源(轉(zhuǎn)基因)植物，即使用本物種自身的序列或可雜交物種的序列通過遺傳修飾獲得的植物。例如，商業(yè)上的馬鈴薯品種，其具有分離自野生型馬鈴薯品種或可雜交物種的核酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，對T-DNA上所用序列進(jìn)行克隆，使得僅有茄屬植物序列存在于T-DNA上，例如使用源自茄屬植物的連接子分隔T-DNA上不同編碼序列。也可以使用(修飾的)多克隆位點(diǎn)，其在克隆后僅導(dǎo)致已經(jīng)存在于所用植物細(xì)胞的基因組背景中的核苷酸序列的存在。本文所用的術(shù)語"基本上"是指雖然全部序列位于天然存在的至少一種(優(yōu)選非遺傳修飾的)植物(優(yōu)選茄屬植物)中，但是遺傳環(huán)境或背景可能會略有不同。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于獲得具有目的核酸的植物的方法，包括提供包含所述目的核酸的重組核酸，將所述重組核酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，從所述細(xì)胞生產(chǎn)植物，和確定存在所述目的核酸且不存在載體骨架和/或邊界序列，其中所述目的核酸基本上為植物核酸，其中所述植物核酸為茄科植物核酸。更優(yōu)選所用的植物細(xì)胞為茄科植物細(xì)胞。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于獲得具有目的核酸的植物的ii方法，包4舌提供包含所述目的核酸的重組核酸，將所述重組核酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，從所述細(xì)胞生產(chǎn)植物，和確定存在所述目的核酸且不存在載體骨架和/或邊界序列，其中所述目的核酸基本上為植物核酸，其中所述目的核酸為cDNA序列，或其中所述目的核酸為反向(重復(fù))序列，或其中所述目的核酸為基因組序列。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述植物核酸是受自然的/天然的5，(啟動子)和3，(終止子)核酸序列控制的開放閱讀框，且在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸序列是基因組序列。此類序列與茄科植物細(xì)胞的結(jié)合使用導(dǎo)致產(chǎn)生所謂的同種源基因植物，即使用本物種自身的序列進(jìn)行遺傳修飾的植物。另一優(yōu)選的實(shí)施方案是其中所述目的核酸為R基因的方法。這樣，本發(fā)明提供了如至少部分抗病原菌(致病疫霉(i5z'"/wtow))的同種源基因馬鈴薯植物。這類植物被認(rèn)為很容易受到倫理委員會以及消費(fèi)者組織的反對，而同時這些植物減少如殺真菌劑的使用。通過確定是否存在非茄屬植物核酸序列來對本文所述的方法進(jìn)行進(jìn)一步的補(bǔ)充。這確認(rèn)不存在任何非植物核酸序列。優(yōu)選地，所述非茄屬植物核酸序列為非茄屬植物T-DNA邊界序列。目的核酸可以作為染色體外的(游離基因的)復(fù)制分子存在于植物細(xì)胞中，但更優(yōu)選地根據(jù)本發(fā)明的方法導(dǎo)致重組核酸(待轉(zhuǎn)移的核酸序列)整合進(jìn)入所述植物的基因組。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種植物，所述植物可以通過用于獲得具有目的核酸的植物的方法獲得，所述方法包括本發(fā)明提供用于獲得具有目的核酸的植物的方法，包括提供包含所述目的核酸的重組核酸，將所述重組核酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，從所述細(xì)胞生產(chǎn)植物，和確定存在所述目的核酸且不存在載體骨架和/或邊界序列，其中所述目的核酸基本上為植物核酸。本發(fā)明還提供了一種遺傳修飾的植物，所述植物具有同種源基因，即從相同物種但不同品種獲得/來源/分離的基因。優(yōu)選地，所述同種源基因受自身5，(啟動子)和3，(終止子)序列的控制，且更優(yōu)選地所述同種源基因?yàn)榛蚪M序列。所述基因組序列可以包含內(nèi)含子和外顯子序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所獲得的植物基本上僅包含從植物且更優(yōu)選從茄屬植物獲得的核酸序列。因此，本發(fā)明提供了用于確定植物是否具有包含目的核酸的重組核酸的方法，包括任選地進(jìn)一步提供帶有功能性R基因的所述重組核酸，將所述重組核酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，從所述細(xì)胞生產(chǎn)植物，和使得到的植物接觸至少一種疫霉屬的激發(fā)子，并確定是否存在對所述至少一種激發(fā)子的反應(yīng)，其中所述重組核酸基本上由茄屬植物核酸序列組成，即待轉(zhuǎn)移的核酸序列基本上為茄屬植物核酸序列。例如如果選沖奪農(nóng)桿菌/二元載體方法作為轉(zhuǎn)移方法，則存在于T-DNA上的序列(即待轉(zhuǎn)移的部分)基本上為茄科植物核酸序列。所用二元載體的邊界序列以及骨架包含非茄科植物核酸序列。將選擇不包含這些邊界序列和骨架序列的這類茄科植物轉(zhuǎn)化體。這導(dǎo)致產(chǎn)生所謂同種源基因植物，即使用本物種自身的序列或可雜交物種的序列通過遺傳修飾獲得的植物，例如，商業(yè)上的馬鈴薯品種，其具有分離自野生型馬鈴薯物種或不同馬鈴薯品種或可雜交物種的核酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，對T-DNA上所用序列進(jìn)行克隆，使得僅有茄屬植物序列存在于T-DNA上，例如使用源自或基于茄屬植物基因組設(shè)計(jì)的連接子分隔T-DNA上不同編碼序列。也可以使用(修飾的)多克隆位點(diǎn)，其在克隆后僅導(dǎo)致已經(jīng)存在于所用植物細(xì)胞的基因組背景中的核苷酸序列的存在。本文所用的術(shù)語"基本上"是指雖然全部序列位于天然存在的至少一種(優(yōu)選非遺傳修飾的)植物(優(yōu)選茄屬植物)中，但是遺傳環(huán)境或背景可能會略有不同。此外，本發(fā)明提供了用于確定是否植物具有包含目的核酸的重組核酸的13方法，包括進(jìn)一步提供帶有功能性同種源R基因的所述重組核酸，將所述重組核酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，從所述細(xì)胞生產(chǎn)植物，和使得到的植物接觸至少一種,疫霉屬的激發(fā)子，并確定是否存在對所述至少一種激發(fā)子的反應(yīng)。化是否已經(jīng)成功。術(shù)語"重組核酸"通常用于描述雙鏈或單鏈DNA或RNA分子，且包括核酸的環(huán)型和線型形式。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中所用的重組核酸至少包含(i)重組的目的核酸和(ii)功能性R基因。然而，目的核酸和功能性R基因也可以是同一個核酸，因此，在此實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中所用的重組核酸至少包含功能性R基因。在后一種情況中，所述功能性R基因被用作選擇工具以及被用于提供抵抗真菌感染/病原菌的(至少部分)保護(hù)。本發(fā)明的方法中所用的重組核酸除了包括功能性R基因或重組的目的核酸和功能性R基因的組合(如骨架/載體序列)，以及在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的情況中至少一個和優(yōu)選為兩個(任選地修飾的)T-DNA邊界序列之外，也可以包含其它序列。T-DNA邊界源自農(nóng)桿菌，因此包含這些邊界的植物不包括在同種源基因植物或基因內(nèi)植物的定義中。W005/004585的發(fā)明已經(jīng)搜索了功能性植物T-DNA邊界。在擬南齊屬(Jra&Wo;^;y)、水稻、馬鈴薯等中確定了這些類似物的存在(Rommens等，PlantPhysiol.2004)。本領(lǐng)域已知這些T-DNA邊界的刪除通常會發(fā)生在T-DNA整合進(jìn)入基因組期間。我們已經(jīng)詳細(xì)分析了使用構(gòu)建體pKGBA50mf-IR1.1(deVetten等，2003)獲得的五個轉(zhuǎn)化體，并觀察了從RB側(cè)39-237bp和從LB側(cè)79-1054bp的T-DNA序列的刪除。Zhu等(2006)報(bào)道了類似的結(jié)果。他們分析了來自獨(dú)立轉(zhuǎn)基因水稻植物的171個左邊界和134個右邊界，并觀察了在RB側(cè)多至35bp和在LB側(cè)多至340bp的T-DNA刪除。他們指出一些轉(zhuǎn)化體可能發(fā)生在LB側(cè)長度大于611bp的刪除。Windels等(2003)分析了來自擬南芥屬轉(zhuǎn)化體的67個T-DNA/植物DNA接合處。他們觀察到在RB側(cè)多至629bp和在LB側(cè)多至2309bp的T-DNA序列的刪除。Thomas和Jones(2007)表征了98個T-DNA/植物DNA接合處序列。所分析的42個接合處中有41個接合處未保留有源自LB重復(fù)的序列。所分析的56個接合處中有36個接合處未保留有源自RB重復(fù)的序列。基于這些觀察，希望能夠選擇出大量僅包含整合在基因組中的茄科植物序列的轉(zhuǎn)化體。為了獲得最大數(shù)量的具有(刪除的)未整合邊界的轉(zhuǎn)化體，所述邊界優(yōu)選較短，具有最少25bp的左側(cè)和右側(cè)邊界，然而使用較長邊界也是可行的。如本文在實(shí)驗(yàn)部分的公開，優(yōu)選的左邊界設(shè)置是在其中使用減弱區(qū)與雙左邊界的組合。這種設(shè)置防止更頻繁的骨架整合(左邊界的連讀)。EP-A-1009842例舉了防止連讀的類似方法。骨架載體(非T-DNA)序列向植物基因組的整合在才艮癌農(nóng)桿菌(爿gro6"cten'wm^we/a"'em)轉(zhuǎn)化期間頻繁發(fā)生(Kononov等，1997;Ramanathan和Veluthambi，1995;VanderGraaff等,1996;Wenck等，1997;Wolters等，1998)。Wang等(1987)報(bào)道了"邊界重復(fù)的側(cè)翼序列增強(qiáng)(在右側(cè))或減弱(在左側(cè))其活性，，。他們定義了"減弱區(qū)，，靠近質(zhì)粒pTiC58的LB的T-DNA的363bp富含AT的EcoRI/BclI片段。DeBuck等(2000)指出"有可能刪除內(nèi)部邊界區(qū)(存在于載體來源的最初Ti質(zhì)粒中的一段T-DNA)會引起LB重復(fù)的無效缺口，這導(dǎo)致連讀通過LB和位于下游的載體序列的轉(zhuǎn)移"。Kuraya等(2004)指出"來自對照載體的'載體骨架，的轉(zhuǎn)移主要因?yàn)門-DNA轉(zhuǎn)移中間產(chǎn)物形成的無效終止，且附加的LB序列有效地抑制此轉(zhuǎn)移"?；谶@些報(bào)道，我們已經(jīng)在我們的一個實(shí)施例中克隆了額外的胭脂堿型LB以及在二元載體的LB外的側(cè)翼減弱區(qū)，以防止骨架載體DNA向植物基因組中整合。如上所述，本發(fā)明的方法中所用的重組核酸還可以包含載體序列，條件是它們是同種源基因，即獲得自相同的植物或相同的兩性相容組。例如，載體序列可以包含用于在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中保持重組核酸的選擇標(biāo)記。本領(lǐng)域的技術(shù)人員很清楚如果想要引入多個目的核酸，本發(fā)明的方法中所用的重組核酸可以包含多個目的核酸。存在于本發(fā)明的方法中所用的重組核酸的其它序列為啟動子和/或終止子序列，優(yōu)選為與目的核酸和/或R基因功能性連鎖/偶聯(lián)。下文描述了這些啟動子和/或終止子序列的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域的技術(shù)人員明白可以想出大量全部包括在本文中的目的核酸。在一個實(shí)施方案中，所述目的核酸允許調(diào)節(jié)所述基因組中靶基因的表達(dá)。可以通過"正義"技術(shù)(sensetechnology)實(shí)現(xiàn)上調(diào)(或過表達(dá))和下調(diào)。如果將全長的靶基因拷貝插入到基因組中，則可以獲得一系列表型，其中一些過表達(dá)靶基因，一些低表達(dá)靶基因。隨后可以對由此方法生產(chǎn)的植物群體進(jìn)行篩選和個體表型分離。優(yōu)選的實(shí)施方案包括其中所述調(diào)節(jié)包括下調(diào)的方法。靶基因表達(dá)的抑制(通常稱為"基因沉默")可以通過"反義下調(diào)"和"正義下調(diào)"(也成為"共抑制")來實(shí)現(xiàn)。在反義下調(diào)中，將與全部或部分內(nèi)源靶基因互補(bǔ)的DNA片段以相反的方向插入到基因組中。雖然尚未完全闡明此機(jī)制，但有一種理論認(rèn)為此反義基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA與內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA產(chǎn)物在序列上互補(bǔ)。隨后反義mRNA結(jié)合天然產(chǎn)生的"正義"mRNA形成抑制天然mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的雙《逸體。反義下調(diào)技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知并在全世界的實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用。因此，可以通過將靶基因編碼序列的至少一個片段的拷貝插入到靶生物體的基因組來實(shí)現(xiàn)基因沉默，此拷貝可以包含全部或部分或截短的序列，并可以是正義或反義方向。此外，可從基因組基因序列獲得的內(nèi)含子序列可以被用于構(gòu)建抑制載體。也有在生物體中實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源基因的基因沉默的報(bào)道，其中僅在啟動子區(qū)域有序列同一性。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明使用重組核酸，其中所述目的核酸包含所述耙基因的至少部分多核苷酸區(qū)域的反向重復(fù)。雖然反義和正義下調(diào)可以導(dǎo)致耙基因的完全沉默，但效率通常不是很高。最多有25%的反義轉(zhuǎn)化體呈現(xiàn)完全的沉默，而從正義構(gòu)建體獲得的轉(zhuǎn)化體只有約10%顯示出一定水平的說明書第14/60頁沉默(Smith等，2000Nature407:319-320;Wolters和Visser，2000PlantMolBiol43:377-386)。最近，已經(jīng)觀察到當(dāng)基因沉默載體包含靶基因的全部或部分多核苷酸區(qū)域的反向重復(fù)時，增強(qiáng)了對生物體內(nèi)選擇的靶基因的抑制。反向重復(fù)序列可以由如T-DNA組成，所述T-DNA帶有驅(qū)動cDNA正義拷貝表達(dá)的一個啟動子以及在相同cDNA的反義拷貝前的另一啟動子(Chuang和Meye磨itz,2000ProcNatlAcadSciUSA97:4985-4990),或T-DNA可以包含兩個末端的側(cè)翼均為啟動子的cDNA序列(LaCount等，2000MolBiochemParasit111:67-76),或T-DNA可以包含驅(qū)動(部分)cDNA的反向重復(fù)轉(zhuǎn)錄的啟動子(Hamilton等，1998;Smith等，2000Nature407:319-320;Wang和Waterhouse,2000WangMB,WaterhousePM(2000)PlantMolBiol43:67-82),或待沉默的基因的啟動子(Mette等，2000EMBOJ19:5194-5201)。據(jù)報(bào)道在使用內(nèi)含子作為重復(fù)間的間隔子的情況中，一些反向重復(fù)構(gòu)建體導(dǎo)致100%的轉(zhuǎn)化體呈現(xiàn)出耙基因沉默(Smith等，2000Nature407:319-320)。間隔子片段有助于正確反向重復(fù)序列的穩(wěn)定性，但其對于沉默的特異性則不是必需的。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，目的核酸編碼顆粒結(jié)合型淀粉合酶(GBSSI)或包含反義序列。在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中包含的GBSSI的短重復(fù)區(qū)域?qū)е峦耆聊霓D(zhuǎn)化子的頻率有顯著增加。本發(fā)明還提供了一種目的核酸，所述目的核酸允許在植物細(xì)胞中表達(dá)異源的，同種源基因(cisgenic)多肽。適合的多肽是多樣的，轉(zhuǎn)入植物中的目的外源核酸或基因的典型實(shí)例是編碼修飾新陳代謝和分解代謝過程的蛋白質(zhì)和酶的那些。其它實(shí)例是可以編碼增加作為食物或農(nóng)作物的植物營養(yǎng)價值的蛋白質(zhì)的基因。典型的實(shí)例包括可以抑制抗?fàn)I養(yǎng)因子形成的植物蛋白和具有更多所需氨基酸成分(如比非轉(zhuǎn)基因植物具有更高的賴氨酸含量)的植物蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述目的核酸編碼包含酶的多肽。目的核酸也可以編碼在食物加工中使用的酶，如凝乳酶、竹芋蛋白和a-半乳糖苷酶。目的核酸也可以編碼引入或增加病原菌抗性的試劑。優(yōu)選地，目的基因是這樣的基因，其編碼具有高營養(yǎng)價值的蛋白質(zhì)或肽、反饋不敏感的氨基酸生物合成酶如二氫吡啶二羧酸合酶(EC4.2.1.52，DHPS)、提供疾病抗性的酶或肽、正義或反義轉(zhuǎn)錄物如馬鈴薯塊莖儲藏蛋白(patatin)、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、a-淀粉酶、分支酶、顆粒結(jié)合型淀粉合酶、可溶性淀粉合酶、蛋白酶或葡聚糖酶。在另一實(shí)施方案中，目的核酸是調(diào)整植物組織和器官質(zhì)構(gòu)性質(zhì)(特別是在熱處理如蒸煮后)的核酸序列。優(yōu)選地，可以改變馬鈴薯塊莖的蒸煮類型，如從"粉狀的"至"堅(jiān)實(shí)的，，或與此相反。此基因的實(shí)例為編碼所謂StTLRP蛋白質(zhì)(馬鈴薯富含酪氨酸和賴氨酸的蛋白質(zhì))的sttlrp核酸。圖3提供了此sttl卬核酸的核酸序列。StTLRP蛋白質(zhì)(和編碼其的W/r/核酸)適用于調(diào)整植物細(xì)胞壁的質(zhì)構(gòu)特性，特別是缺乏剛性的(木質(zhì)化的)次生細(xì)胞壁的細(xì)胞(和主要由其構(gòu)成的組織)。發(fā)現(xiàn)mRNA表達(dá)水平和馬鈴薯塊莖的堅(jiān)實(shí)度之間有顯著的關(guān)聯(lián)。包含W/^基因特定等位基因(W/vA7等位基因)的馬鈴薯基因型比缺乏此等位基因的基因型具有更高的W/r;mRNA水平(如上調(diào)64倍)。平均而言，在蒸煮后這些基因型具有更堅(jiān)實(shí)的組織。相反地，缺乏A7等位基因的基因型在蒸煮后為粉狀的。因此，特別高表達(dá)的等位基因能夠?yàn)轳R鈴薯塊莖提供"堅(jiān)實(shí)"，"非粉狀的"的表型，而低表達(dá)的等位基因(和因此缺少高表達(dá)的等位基因)能夠提供"粉狀的"的表型。圖3顯示了A7等位基因的基因組和cDNA核酸序列。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了其中目的核酸也為功能性R基因方法。術(shù)語R基因通常用于描述所編碼的基因產(chǎn)物能夠?yàn)橹参锾峁?至少部分)病原菌抗性的DNA序列。更優(yōu)選地，此選擇過程中所用的R基因也可以用于向所獲得的植物提供抗性。優(yōu)選地，對此選擇過程中所用的R基因和其它功能性R基因(作為目的核酸)進(jìn)行選擇，以便它們提供抗病原菌的互補(bǔ)的(和更優(yōu)選地部分重疊的)保護(hù)。使用至少兩個優(yōu)選不同的R基因?qū)е滤^的R基因堆疊。通過如ATTA(即根癌農(nóng)桿菌瞬時表達(dá)分析)來測試多種不同的R基因是否提供互補(bǔ)和/或重疊的作用。在此分析中，將編碼待測試的R基因的核苷酸序列引入到也用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法的農(nóng)桿菌菌抹。在用乙酰丁香酮或已知可以增強(qiáng)農(nóng)桿菌T-DNA轉(zhuǎn)移的任何其它酚類化合物孵育細(xì)菌后，通過注射可以使一定量的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物滲透進(jìn)入原位植物葉片(如煙草或馬鈴薯或番茄植物)，此后將植物置于溫室并用病原菌(如致病疫霉)感染。2-5天后，記下出現(xiàn)抗性癥狀的葉片。對多種不同的致病疫霉分離抹或?qū)Χ喾N不同的激發(fā)子，測試多種不同的R基因。測試多種不同的R基因是否提供互補(bǔ)和/或重疊的作用的另一種方法是使用分開的葉片分析，其中優(yōu)選使用充分表征的分離抹(如致病疫霉分離抹)或效應(yīng)物(如激發(fā)子)，其揭示了在茄屬植物和疫霉屬中搜尋重復(fù)的功能性等位基因是鑒定和表征R-avr組合的強(qiáng)有力工具，其比之前可能僅使用的分離抹篩選具有更高的識別分辨率。以前已經(jīng)對野生的茄屬植物物種進(jìn)行過抗致病疫霉的基因作圖。表1中給出了抗植物晚疫病的R基因的作圖的總結(jié)。目前，已經(jīng)克隆了4個抗晚疫病的R基因，且它們均屬于NB-LRR類的植物R基因；來自矮茄(S.dew/^ww)的i/和i3a(Ballvora等，2002;Huang等，2005)和來自51.Zw/6ocaWa"wm的i;^-WW和(vanderVossen等，2003，2005)。表1中給出了可以用作目的核酸的R基因的實(shí)例。然而，本發(fā)明的方法中也可以使用分離自除馬鈴薯之外的其它植物的R基因。優(yōu)選地，所用的功能性R基因和激發(fā)子相匹配。例如，如果要使用來自大豆植物的Rpslb，則所用的激發(fā)子優(yōu)選為大豆疫霉菌(/Vy^，/^/wraso力e)的激發(fā)子(優(yōu)選Avrlb-l)。下表中給出了其它實(shí)例。19宿主R基因Avr基因病原菌馬鈴薯腸致病疫霉(尸/^o/7似Aora/"/^a朋)卵菌)馬鈴薯致病疫霉卵菌大豆?fàn)?6大豆疫霉菌卵菌擬南芥)一*7Hyaloperonosporaparasitica卵菌番癡，爿w9黃枝孢菌真菌番茄尸to番茄細(xì)菌性葉斑病菌(i^ewi/o,W(zy，z'wgae，7b附她)纟田菌通常，本文所用的術(shù)語"功能性(R-)基因"是指能轉(zhuǎn)錄的基因，即基因產(chǎn)物被表達(dá)(并提供能夠與至少一種疫霉屬激發(fā)子相互作用的產(chǎn)物)。表1中給出了適合的基因。有多種方式可以將重組核酸轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。然而，希望實(shí)施本發(fā)明時，除了農(nóng)桿菌感染之外，還有其它方法可以有效地將DNA傳遞到受體植物細(xì)胞中。認(rèn)為適合將DNA傳遞到植物細(xì)胞的方法幾乎包括可以將DNA引入細(xì)胞的任何方法，如通過DNA的直接傳遞如通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Omirulleh等，1993),通過脫水/抑制介導(dǎo)的DNA攝取(Potrykus等，Mol,Gen.Genet.,199:183-188,1985),通過電穿孔(美國專利第5,384,253號)，通過碳化硅纖維的攪動(Kaeppler等，19卯；美國專利第5,302,523號；和美國專利第5,464,765號)和通過DNA包被顆粒的力口速(美國專利第5,550,318號；美國專利第5，538，877號；和美國專利第5,538,880號)。通過諸如這些技術(shù)的應(yīng)用，可以穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化來自幾乎任何植物物種的特定細(xì)胞，且這些細(xì)胞可以發(fā)育成轉(zhuǎn)基因植物。在使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移中，優(yōu)選使用有充分毒力的農(nóng)桿菌，如根癌農(nóng)桿菌，如菌抹A281或源自其的菌林或本領(lǐng)域中可獲得的其它有毒力的菌抹。這些農(nóng)桿菌菌抹攜帶源自包含WW、vz>C和基因的Ti質(zhì)粒pTiBo542毒力區(qū)的DNA區(qū)。根癌農(nóng)桿菌的毒力(vir)基因產(chǎn)物協(xié)調(diào)T-DNA的加工20和其向植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移。KV基因表達(dá)受控于WM和v/K，其中WM基于感受誘導(dǎo)信號通過磷酸化激活v/K7。F^G反而誘導(dǎo)WM，C，A五的表達(dá)。這些基因編碼參與DNA轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)。認(rèn)為pTiBo542毒力的增強(qiáng)是由此Ti質(zhì)粒上超毒力的vz'K7基因所引起(Chen等，Mol.Gen.Genet230:302-309,1991)。在微粒轟擊中，顆粒可以用核酸包被并借助推進(jìn)力被傳遞進(jìn)入細(xì)胞。示例性顆粒包括如鴒、金、鉑等那些顆粒。在一些情況中，可以預(yù)期DNA在金屬顆粒上的沉淀并非是使用微粒轟擊來將DNA傳遞至受體細(xì)胞所必需的。然而，可以想到的是，顆粒也可以包含DNA而非被DNA包被。對于根據(jù)本發(fā)明的微粒轟擊轉(zhuǎn)化，可以對物理和生物學(xué)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。物理因素是那些涉及操縱DNA/微粒沉淀的因素，或那些影響大顆粒或微粒射程和速度的因素。生物學(xué)因素包括涉及在轟擊前和緊隨轟擊后操縱細(xì)胞的所有步驟，如幫助減輕轟擊所帶來的損傷的靶細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)，把組織相對于顆粒軌道的定向，以及諸如線性化DNA或完整的超螺旋質(zhì)粒等轉(zhuǎn)化DNA的性質(zhì)。認(rèn)為轟擊前操作對成功的轉(zhuǎn)化特別重要。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將用不含骨架質(zhì)粒DNA序列的線性化DNA轉(zhuǎn)化靶組織。因此，可以預(yù)期的是，可期待在小規(guī)模研究中調(diào)節(jié)各種轟擊參數(shù)以充分地使條件優(yōu)化?？赡芴貏e希望調(diào)節(jié)物理參數(shù)如DNA濃度、縫隙距離、射程距離、組織距離和氦氣壓力。還可以預(yù)期氦氣的等級可能影響轉(zhuǎn)化效率。也可以通過改變影響受體細(xì)胞生理狀態(tài)和由此可能影響轉(zhuǎn)化和整合效率的條件來優(yōu)化降低損傷的因素。例如，可以調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的滲透狀態(tài)、組織水化和繼代培養(yǎng)時期或細(xì)胞周期來達(dá)到最佳轉(zhuǎn)化。用于微粒轟擊的轉(zhuǎn)化DNA可以包含表達(dá)盒，所述表達(dá)盒通常包含希望被引入到細(xì)胞中的cDNA和一個或多個基因，且還可以包含與外源基因可操作連接的啟動子和3，區(qū)。本發(fā)明中描述了優(yōu)化的基因構(gòu)建體。DNA區(qū)段還可以包含第二個、第三個、第四個、第五個、第六個或任何其它數(shù)量的，能夠被置于單個DNA分子上并被轉(zhuǎn)化進(jìn)入受體細(xì)胞的外源基因。根據(jù)本發(fā)明的方法，用于重組核酸轉(zhuǎn)化的受體植物細(xì)胞可以來自潛在地任何可轉(zhuǎn)化的單子葉或雙子葉植物。優(yōu)選用于本發(fā)明的單子葉植物細(xì)胞來自水稻、小麥、大麥、燕麥、黑麥、谷子、高粱、甘蔗、草沖草和玉米。優(yōu)選用于本發(fā)明的雙子葉植物細(xì)胞包括來自玉米、番茄、柑橘、煙草、大豆，和特別是馬鈴薯和木薯的細(xì)胞。在轉(zhuǎn)移重組核酸后，從所述遺傳修飾的植物細(xì)胞生產(chǎn)植物。這包括本領(lǐng)域熟知且無需進(jìn)一步說明的再生方法。如果得到的植物包含提供抗疫霉屬抗性的R基因，其可以在任何齡期經(jīng)受至少一抹疫霉屬菌林或疫霉屬激發(fā)子的處理。原則上僅僅具有一個葉片的所得植物可以已經(jīng)經(jīng)受至少一株疫霉屬菌抹或疫霉屬激發(fā)子的處理。此外，可在體外和體內(nèi)測試植物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，涉及在從體外培養(yǎng)到盆栽兩周后測試。除了標(biāo)記基因是同種源基因之外，根據(jù)本發(fā)明的方法的重要優(yōu)點(diǎn)是，獲得的植物無需生長在選擇性培養(yǎng)基上，如包含除草劑、抗生素、氨基酸類似物等的培養(yǎng)基。此外，本發(fā)明的方法不包括使用如在使用GFP或GUS標(biāo)記中所需的額外裝置。如上所述，在本發(fā)明的方法中可以使用除馬鈴薯外的植物的其它功能性R基因，例如當(dāng)轉(zhuǎn)化大豆時可以使用來自大豆的Rpslb基因，或當(dāng)轉(zhuǎn)化馬鈴薯時可以使用來自馬鈴薯的Cf基因。因此，本發(fā)明還提供了確定植物是否已經(jīng)具有包含目的核酸的重組核酸的方法，包括進(jìn)一步提供具有功能性R基因的所述重組核酸，將所述重組核酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，從所述細(xì)胞生產(chǎn)植物，和使得到的植物接觸如枝孢屬(C7^fo^on'wm)的至少一種激發(fā)子，并確定是否存在對所述至少一種激發(fā)子的反應(yīng)。在此特定實(shí)施例中所用的植物細(xì)胞為番茄屬(Z^co;e"/co")植物細(xì)胞。本發(fā)明的方法任選地還包括測試拷貝數(shù)。此分析優(yōu)選在DNA/RNA水平進(jìn)行。這包括根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法從植抹或植株庫中分離核酸(Sambrook等，1989)。核酸可以是基因組DNA、RNA或mRNA。也可以檢測重排。本發(fā)明提供使用mRNA檢測方法來確定在轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或其子代中的核酸構(gòu)建體是否充分地整合進(jìn)入將被轉(zhuǎn)錄為mRNA構(gòu)建體的植物基因組中。使用直接(DNA)或間接(RNA)擴(kuò)增在樣品中鑒定部分轉(zhuǎn)基因的目的特異性核酸。其次，檢測已鑒定的產(chǎn)物。在某些應(yīng)用中，可以通過可見方法(如凝膠的溴化乙錠染色)進(jìn)行檢測?；蛘撸瑱z測涉及通過化學(xué)發(fā)光、放射標(biāo)記或熒光標(biāo)記的放射性閃爍照相，或甚至使用電或熱脈沖信號的系統(tǒng)來間接鑒定產(chǎn)物?？梢韵氲綍卸喾N不同的分析方法來篩選使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。這些技術(shù)可以用于檢測特定基因的存在以及在基因構(gòu)建體中可能出現(xiàn)的重排。這些技術(shù)包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、熒光原位雜交(FISH)、直接DNA測序、PFGE分析、Southern或Northern印跡、單鏈構(gòu)象分析(SSCA)、RNAse保護(hù)分析、等位基因特異的寡核苷酸(ASO)、斑點(diǎn)印跡分析、變性梯度凝膠電泳、限制性片段長度多態(tài)性(RELP)和PCR-SSCP或基于芯片DNA技術(shù)。本發(fā)明提供了使用核酸檢測方法來確定是否轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或其子代被重組核酸所轉(zhuǎn)化，所述重組核酸包含允許整合進(jìn)入植物細(xì)胞基因組的T-DNA構(gòu)建體或功能性等價核酸構(gòu)建體。此外，本發(fā)明提供了核酸檢測方法在確定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或其子代是否被重組核酸所轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，包括測試所述細(xì)胞或所述子代中是否存在非所需的載體材料，如載體骨架序列。例如，根據(jù)本發(fā)明的方法可以用于檢測轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞是否基本上不含作為輔助的多余核酸。將隨后使由核酸檢測方法所鑒定的轉(zhuǎn)化植抹發(fā)育成植物。再生植物進(jìn)入莖和根發(fā)育的階段后，可以將它們移入溫室進(jìn)行繼續(xù)生長和測試。特別是在由基因槍轟擊的轉(zhuǎn)化中，控制所引入轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)和有效生產(chǎn)低拷貝轉(zhuǎn)化體可以通過去磷酸化或通過核酸區(qū)段末端的平端化對核酸區(qū)段末端進(jìn)行修飾來實(shí)現(xiàn)(W099/32642)。優(yōu)選地，從茄科植物獲得/分離所用的功能性R基因和/或所用的目的核酸，其包含其自身的5，(啟動子)和3，(終止子)序列，即所用的功能性R基因和/或所用的目的核酸優(yōu)選受控于其自然的/天然的啟動子和終止子區(qū)域。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供確定植物是否具有包含目的核酸的重組核酸的方法，包括進(jìn)一步提供具有功能性R基因的所述重組核酸，將所述重組核酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，從所述細(xì)胞生產(chǎn)植物，和使得到的植物接觸至少一種疫霉屬的激發(fā)子，并確定是否存在對所述至少一種激發(fā)子的反應(yīng)，其中所述目的核酸與所述功能性R基因相同。此方法不依賴于選擇性標(biāo)記，且因此不需要使用選擇性試劑處理進(jìn)行選擇。在此實(shí)施方案中，功能性R基因具有雙重功能，即所述R基因被用于確定哪個植物具有重組核酸且也被用于提供(至少部分)抗病原菌的抗性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供確定植物是否具有包含目的核酸的重組核酸的方法，包括進(jìn)一步提供具有功能性R基因的所述重組核酸，將所述重組核酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，從所述細(xì)胞生產(chǎn)植物，和使得到的植物接觸至少一種疫霉屬的激發(fā)子，并確定是否存在對所述至少一種激發(fā)子的反應(yīng)，其中所述目的核酸為功能性R基因。表1給出了適合的R基因的實(shí)例。此方法實(shí)際上是提供帶有至少部分抗病原菌抗性的植物的方法。在此實(shí)施方案中，也可以使用被用來確定重組核酸是否存在的功能性R基因來提供抗性。在后一種情況中，所生產(chǎn)的植物包含至少兩個功能性R基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白植物也可以具有三個或四個或五個或六個(優(yōu)選不同的)功能性R基因。優(yōu)選地，對所用的R基因進(jìn)行選擇，以便它們提供抗病原菌的互補(bǔ)的保護(hù)。更優(yōu)選地，所獲得的保護(hù)為導(dǎo)致(持久的)抗性表型的寬范圍保護(hù)。如上所述，可以使用多種反應(yīng)確定是否存在對激發(fā)子的反應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述反應(yīng)為超敏反應(yīng)(HR)。例如使用農(nóng)桿菌感染法或農(nóng)桿菌滲入法來測試是否誘導(dǎo)出HR。在本文的實(shí)驗(yàn)部分詳述了這兩個技術(shù)。如果使用代表性疫霉屬菌林代替(分離的)激發(fā)子，本領(lǐng)域技術(shù)人員優(yōu)選使用接種。轉(zhuǎn)移的核酸可以作為染色體外的(游離基因的)復(fù)制分子存在于植物細(xì)胞中，但根據(jù)本發(fā)明的方法更優(yōu)選地導(dǎo)致重組核酸整合進(jìn)入所述植物的基因組。優(yōu)選地，本發(fā)明提供確定植物是否具有包含目的核酸的重組核酸的方法，包括進(jìn)一步提供具有功能性R基因的所述重組核酸，將所述重組核酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，從所述細(xì)胞生產(chǎn)植物，和使得到的植物接觸至少一種疫霉屬的激發(fā)子，并確定是否存在對所述至少一種激發(fā)子的反應(yīng)，其中所述目的核酸和/或所述功能性R基因?yàn)閏DNA序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述目的核酸為反向(重復(fù))序列。反向重復(fù)序列的實(shí)例為GBSS的反向重復(fù)序列。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供確定植物是否具有包含目的核酸的重組核酸的方法，包括進(jìn)一步提供具有功能性R基因的所述重組核酸，將所述重組核酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，從所述細(xì)胞生產(chǎn)植物，和使得到的植物接觸至少一種疫霉屬的激發(fā)子，并確定是否存在對所述至少一種激發(fā)子的反應(yīng)，其中所述目的核酸和所述功能性R基因?yàn)榛蚪M序列，更優(yōu)選為茄科植物基因組序列。結(jié)果，這些基因存在于它們自然的/天然的外顯子/內(nèi)含子背景中。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述目的核酸和所述功能性R基因不但為基因組序列(更優(yōu)選為茄科植物基因組序列)，而且也受它們自然的/天然的5，和3，序列的控制，即受存在于最初/自然的/天然的背景中的啟動子和終止子序列的控制。如前所述，可以使用不同功能性R基因/激發(fā)子(或疫霉屬)的組合來進(jìn)行本發(fā)明的方法。在其中一個實(shí)施方案中，功能性R基因?yàn)镽pi-blb-l或Rpi-stol或Rpi-ptal,且所用的激發(fā)子為RD7(IPI-O)，因此本發(fā)明還提供確定植物是否具有包含目的核酸的重組核酸的方法，包括進(jìn)一步提供具有功能性R基因的所述重組核酸，將所述重組核酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，從所述細(xì)胞生產(chǎn)植物，和使得到的植物接觸至少一種疫霉屬的激發(fā)子，并確定是否存在對所述至少一種激發(fā)子的反應(yīng)，其中所述功能性R基因?yàn)榫幋aRpi-blb-l或Rpi-stol或Rpi-ptal的基因，或編碼其功能性片段的基因，或編碼其衍生物的基因。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述激發(fā)子為RD7(IPI-0)。如我們共同未25決的申請之一中詳細(xì)地公開，Rpi-stol和Rpi-ptal為Rpi-blb-l的同源物，且可以與RD7(IPI-O)相互作用。圖4顯示了Rpi-blb-l和Rpi-stol和Rpi-ptal間的比對。在另一實(shí)施方案中，所用功能性R基因?yàn)榫幋a如圖2所示的blb-3的基因，因此在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供確定植物是否具有包含目的核酸的重組核酸的方法，包括進(jìn)一步提供具有功能性R基因的所述重組核酸，將所述重組核酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，從所述細(xì)胞生產(chǎn)植物，和使得到的植物接觸至少一種疫霉屬的激發(fā)子，并確定是否存在對所述至少一種激發(fā)子的反應(yīng)，其中所述功能性R基因?yàn)榫幋ablb3的基因，或編碼其功能性片段的基因，或編碼其衍生物的基因。在另一實(shí)施方案中，所述功能性R基因?yàn)榫幋a如圖2所示的blb-3的基因。Blb3是LZ-NBS-LRR類的R基因并描述于共同未決申請中，提供對一系列致病疫霉分離抹的抗性。Blb-3核酸序列的功能性片段是完整blb-3核酸序列的截短的(N陽末端、C-末端、中間部分或其組合)序列。截短序列與全長序列相比具有可相比的功能和/或活性，即功能性片段能夠?yàn)榍芽萍易宄蓡T提供抗卵菌屬病原菌的物種非特異性(至少部分)抗性。例如，本文中已經(jīng)通過所述的ATTA方法學(xué)或匹配效應(yīng)物(激發(fā)子)的效應(yīng)物篩選測試了此截短序列。衍生物的實(shí)例為blb-3的等位基因變體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了可通過本發(fā)明方法獲得的植物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述植物是商業(yè)上感興趣的馬鈴薯品種，如Bintje、Desiree或Premiere、Spunta、Nicola、Favorit、RussetBurbank、Aveka或LadyRosetta。例^口通過進(jìn)行PCR確定本發(fā)明植物的特征，來確定是否存在功能性R基因和是否不存在選擇標(biāo)記如卡那霉素。R基因優(yōu)選存在于其非天然背景中，如Rpi-blbl或3在非<S.Zm/^costom^背景中，或R3在非矮茄背景中，或Rpi-stol在非&Wo/om/en^m背景中，或Rpi-ptal在非&背景中。對于所用目的核酸也是如此，例如如果目的基因分離自&m/crot/o"wm，優(yōu)選將所述目的基因引入到非&w/cro心Wwm背景中。也就是說，優(yōu)選待引入的性狀引入到與其克隆或分離的物種不同的品種中。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所用的R基因和/或目的核酸對植物細(xì)胞是外源的。本文中使用術(shù)語"外源的，，來描述這樣的情況，其中R基因和/或目的核酸相對于宿主細(xì)胞是異源的(即與用于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞相比，其源自基因組/遺傳背景不同的細(xì)胞或生物體)，或與所述R基因和/或目的核酸的天然形成的對應(yīng)物相比，R基因和/或目的核酸相對于所用宿主細(xì)胞是同源的，但位于不同的基因組環(huán)境中(例如與天然的基因排列相比，其被不同基因圍繞)。如上所述，所用R基因和/或所用目的核酸優(yōu)選受控于其自身的5，(啟動子)和3，(終止子)核酸序列。也可以通過如PCR或序列分析來確定存在此5，(啟動子)和3，(終止子)核酸序列。如上所述，所用R基因和所用目的核酸為基因組序列，即任選地存在內(nèi)含子和外顯子序列。另外，也可此外，本發(fā)明的植物優(yōu)選為非嵌合的和/或不含標(biāo)記，且不含骨架序列和不含邊界序列。本發(fā)明方法所獲得的植物不需要任何重組事件(例如，以除去選擇標(biāo)記)且不需要任何雜交事件(例如，以刪去選擇標(biāo)記)，即可由本發(fā)明方法獲得的植物不需要額外的重組事件或性周期。然而，獲得的植物可以被用作新品種的雜交親本。因此所獲得植物的基因組背景基本等同于轉(zhuǎn)化所用植物細(xì)胞的遺傳背景，且所述獲得的植物不包含任何重組事件的痕跡。所述方法可以用于多種類型的植物。優(yōu)選的單子葉植物(本發(fā)明使用細(xì)胞)來自水稻、小麥、大麥、燕麥、黑麥、谷子、高粱、甘蔗、草坪草和玉米。優(yōu)選的雙子葉植物(本發(fā)明使用細(xì)胞)包括玉米、番茄、柑橘、煙草、大豆，和特別是馬鈴薯和木薯。具體實(shí)施例方式將在以下非限制性實(shí)施例中對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地解釋。實(shí)施例實(shí)驗(yàn)部分材料和方法農(nóng)桿菌感染法使用攜帶在pGR106中的候選物效應(yīng)物(來自O(shè)SU)的重組根癌農(nóng)桿菌GV3101菌抹來篩選茄屬植物中的反應(yīng)。pGR106-CRN2和pGR106空載體(Jones等，1999;Takken等，2000;Torto等，2003)分別被用作陽性和陰性對照。培養(yǎng)物在添加有抗生素的固體瓊脂LB培養(yǎng)基上于28。C生長2天。通過刺破中間葉脈兩側(cè)的葉片來接種過量的菌體。每2-4天通過目測記錄局部和整體的癥狀。對于成熟的植物接種，通常使用來自三至四周植物的三片葉片，且交替使用不同葉齡的葉片用于各種處理的重復(fù)。農(nóng)桿菌感染法在茄屬植物中的應(yīng)用已知茄屬植物中產(chǎn)生PVX抗性，并干擾二元PVX載體的大規(guī)模篩選。為了確定可用于分析的不同茄屬植物種質(zhì)的范圍，我們使用攜帶pGR106和pGR106-CRN2的根癌農(nóng)桿菌(Vleeshouwers等，2006)來接種植物(來自31個種的80個茄屬植物克隆)。持續(xù)用pGR106-CRN2處理引起50個植物克隆上接種位點(diǎn)周圍的壞死(63%),然而空載體菌抹未引起癥狀。我們推斷這些植物適于PVX農(nóng)桿菌感染分析。所測試的其余茄屬植物克隆則不適于此分析。對陽性和陰性對照都有的反應(yīng)發(fā)生在20個克隆中，且被認(rèn)為是對PVX的非特異性反應(yīng)。十個其它克隆對pGR106-CRN2未顯示出壞死反應(yīng)，可能是因?yàn)榛虿迦胛镂窗l(fā)生原位表達(dá)(expressed?？傊?，似乎PVX分析適于約80%的被檢物種和60%的克隆。因此，在使用來自致病疫霉的大組候選物效應(yīng)物進(jìn)行每次篩選前，要進(jìn)行pGR106-CRN2和pGR106空載體的預(yù)篩選。農(nóng)桿菌滲入法在本生煙草(M6ew//^m/a"a)中進(jìn)行攜帶R基因和AVR基因的農(nóng)桿菌菌抹的共滲入。重組的根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)物在用于LBA4404構(gòu)建體的添加有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基(1升MQ水中加10克細(xì)菌蛋白胨、10克NaCl和5克酵母提取物)中生長。AGL-1中添加有5mg/L四環(huán)素和50mg/L卡那霉素(空AGL-1僅在四環(huán)素上生長)。在一天或兩天后，將計(jì)算量的培養(yǎng)物(根據(jù)600nm下OD0.5計(jì)算)轉(zhuǎn)移到用于所有菌抹的添加有卡那霉素的YEB培養(yǎng)基(1升MQ水中加5克牛肉提取物、5克細(xì)菌蛋白胨、5克蔗糖、1克酵母提取物、2ml1MMgS04)中，但對于AGL-1空載體使用四環(huán)素。在l天l夜后，將細(xì)胞在3500rpm下離心并重懸浮于添加有1ml200mM乙酰丁香酮的MMA培養(yǎng)基(20克蔗糖、5克MS鹽和1.95克MES)中，至最終OD為0.5。在通過3ml注射器滲入4-6周齡的植物前將兩種構(gòu)建體(R基因和PEX)以1:1混合。實(shí)施例1同種源基因R3a轉(zhuǎn)化體的選擇載體pBINmf::R3a的構(gòu)建用酶Pmel和Clal消化衍生自pBI121的二元載體pPGB-lS(Kuipers等，1995)以去除NptII基因。通過Klenow聚合酶處理使Clal粘末端變?yōu)槠侥┒?，隨后使用T4DNA連接酶通過平末端連接使載體DNA環(huán)化。這產(chǎn)生了載體pPGBmf(不含標(biāo)記)，其在T-DNA中包含馬鈴薯GBSSI啟動子和隨后的NOS終止子(為1140-bpHindlll/EcoRI片段)。用Hindlll和EcoRI消化構(gòu)建體pPGBmf,得到1140bp和9681bp的兩個片段。9681-bp片段包含內(nèi)部LB(左邊界)序列、LB、骨架載體DNA、RB和內(nèi)部RB序列，將其從瓊脂糖凝膠中分離。通過退火引物AWOl(5，-AGCTTGGCGCGCCCGGGTTAATTAAG-3，)和AW02(5'陽AATTCTTAATTAACCCGGGCGCGCCA-3，)制備雙鏈寡核苷酸。此序列包含HindIII和EcoRI粘末端和Ascl、Smal和Pacl的限制性位點(diǎn)。將此寡核苷酸與pPGBmf的9681-bpHindIII/EcoRI片段連接，得到載體pBINmf(9707bp)。通過將SH23-2的Pacl/Ascl基因組DNA片段克隆到Pacl/Ascl消化的pBINmf得到載體pBINmf::R3a。SH23-2是細(xì)菌人工染色體(BAC)SH23的亞克隆(Huang等，2005)。用Sau3AI部分消化此BAC,并將7-10kb部分連4矣到載體pBINPLUS的BamHI位點(diǎn)。載體pBINmf::R3a中的T-DNA包含9-kb的SH23-2pBINPLUS亞克隆的片段，基因R3a的編碼序列(CDS)位于其中。3849-bpCDS(在植物轉(zhuǎn)化后)受存在于SH23-2中R3a最初的啟動子和終止子的調(diào)控。從二倍體馬鈴薯克隆SH83-92-488中分離基因組片段SH23-2(Huang等，2005)。4吏用輔助質(zhì)粒pRK2013通過三親交配將二元載體pBINmf::R3a轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌菌抹AGLO或AGL-1中(Figurski和Helinski，1979)。馬鈴薯的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化體的選擇根據(jù)Visser等(1991a)描述的方法，將來自馬鈴薯栽培種'Desiree'的體外生長植物的節(jié)間插條(cuttings)通過根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。用根癌農(nóng)桿菌AGL-1中的pBINmf::R3a轉(zhuǎn)化馬鈴薯栽培種'Desiree'。沒有進(jìn)行選擇。在4周后，收獲第一個枝條并連續(xù)收獲枝條約3個月。每個莖外植體收獲了不超過兩個再生體，并使枝條生長于玻璃罐(直徑10cm)或塑料罐(直徑15cm)中的MS30培養(yǎng)基上。每個罐包含5個插條。在插條和罐的內(nèi)壁間留出2至3cm的空間。通過avr3進(jìn)行體外選擇使體外植林在24。C和16小時光/8小時黑暗下生長。將帶有3至4片完全發(fā)育葉片的植抹用于體外接種。根據(jù)馬鈴薯基因型，在2至4周后可以對植抹進(jìn)行接種。通過吸取10pl液滴的游動孢子懸液(2.5x104孢子/ml)在近軸側(cè)接種每個體外植抹的3個最大葉片(每葉片l個斑點(diǎn))。在無菌條件下進(jìn)行接種物制備和接種。排除接觸罐或培養(yǎng)基的內(nèi)壁或蓋的葉片，因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)這些葉片比相同植物的其它葉片的易感性更高。在與帶有被接種脫離葉片的盤相同的氣候室中孵育接種有體外植林的罐。將表現(xiàn)出易感性相互作用的非轉(zhuǎn)化植抹記為S(具有大量孢子形成的擴(kuò)展傷口)或類別SQ(沒有或很少孢子形成的擴(kuò)展傷口)。將表現(xiàn)出抗相互尾的HT壞死)。將推定轉(zhuǎn)化體移至新培養(yǎng)基中和/或移至溫室的盆栽土中。DNA分析根據(jù)Rogers和Bendich(1988)所述的CTABDNA分離方法從體外枝條中分離DNA。使用引物NPT1和NPT2、trfAl和trfA2、insBl和insB2(序列號1、2、5、6、7和8;Wolters等，1998a)進(jìn)行PCR,以研究轉(zhuǎn)化體中骨架載體DNA的存在。用HindIII消化4(ig的轉(zhuǎn)化體DNA,通過凝月交電泳分離片段，并進(jìn)行Southern印跡。使用R3a探針與印跡雜交，以檢驗(yàn)T-DNA插入物的數(shù)量。不含邊界的轉(zhuǎn)化體對邊界序列進(jìn)行PCRT-DNA的右邊界和左邊界序列并非源自茄屬植物，而是從pBIN19(pTiT37邊界)中獲得。進(jìn)行PCR以分析這些邊界序列是否存在于轉(zhuǎn)化體中。使用以下引物分析右邊界引物RBcheck2(5，-CCAATATATCCTGTCAAACA-3，)和引物SHcisl(5'誦CATCATCATCCCAAGTACAA-3')。當(dāng)用載體pBINmf::R3a的DNA作為模板時，預(yù)期由這些引物得到1221bp的片段。使用引物SHcis2(5'-AAGGGCAAACATAACCATTC-3，)和引物L(fēng)Beheckl(5'-GGATATATTGTGGTGTAAAC-3，)的組合分析左邊界。當(dāng)用載體pBINmf::R3a的DNA作為模板時，預(yù)期由這些引物得到1712bp的片段。使用UniversalGenomeWalkerKit(Clontech)以從轉(zhuǎn)化體獲得T-DNA側(cè)翼序列。用Dral、EcoRV、PvuII、Seal和Stul消化轉(zhuǎn)化體的DNA。基因組步移適配子(GenomeWalkerAdaptors)與獲得的片段連接來構(gòu)建酶特異性文庫。使用適配子引物API(5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3，)和引物SHGWl(5'-TAAGTTTAATCAGAAGTTGGGTAGGAA-3，)進(jìn)行第一PCR以獲得RB側(cè)翼DNA。使用適配子引物AP2(5，-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3，)和引物SHGW2(5，-GTTGGGTAGGAAGCCTGCTCTTGGAAA-3，)進(jìn)行巢式PCR。使用適配子引物API和引物SHGW3(5，-GTATGTATGTGTAGTTAATGGGGTAGT-3，)進(jìn)行第一PCR以獲得LB側(cè)翼DNA。使用適配子引物AP2和引物SHGW4(5，-ACGGTTTCTAAATTAACGTAGCCAATA-3，)進(jìn)行巢式PCR。實(shí)施例2同種源基因R3a轉(zhuǎn)化體的選擇帶有減少T-DNA邊界的載體pBINAW2b::R3a的構(gòu)建使用pBIN19作為起始物構(gòu)建包括RB和LB的新骨架載體。消化RB和LB的引物。使用引物URB(5'-GCGGTCCTGATCAATCGTCAC-3，)和RBK(5，-GGTACCTGACAGGATATATTGGCGGGTAAA-3，;具有Kpnl位點(diǎn))從1156bp的pBIN19擴(kuò)增RB上游DNA序歹'J。使用引物L(fēng)BKX(5'-GGTACCTCTAGAGTTTACACCACAATATATCC-3，；具有Kpnl和Xbal^f立點(diǎn))牙口DLB(5'-GCGGGTTTAACCTACTTCCTTT隱3，)乂人627bp的pBIN19擴(kuò)增LB下游DNA序列。將兩個PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T并測序。用Sacl和Kpnl消化從pGEM-T載體中釋i文RB上游序列。用Kpnl和Nsil消化從32/KpnlRB上游序列和Kpnl/NsilLB下游序列與Sacl/Nsil消化的pUC28載體連接(BeneS等，1993)，得到質(zhì)粒pUC28-LBRB。通過此連接將RB和LB彼此相連，僅通過KpnI和XbaI識別序列隔開。使644-bpBglII/Nsi片段從此載體中釋放，并與來自于pBIN19的6966-bpBcll/Nsil骨架載體序列連接，得到質(zhì)粒pBINAW2。通過此連接，刪除了側(cè)翼于RB的tetR基因。為獲得在RB和LB間具有多于兩個獨(dú)特限制性位點(diǎn)的載體，用Kpnl消化質(zhì)粒pUC28-LBRB并隨后自連接，得到質(zhì)粒pUC28-LBRBl。將來自質(zhì)粒pUC28-LBRB的562-bpXbal片段與Xbal消化的pUC28-LBRBl連接，得到質(zhì)粒pUC28-LBRB2。此質(zhì)粒包含通過KpnI、Smal、BamHI和XbaI的多克隆位點(diǎn)隔開的RB上游序列和LB下游序列。用Kpnl和Nsil消化質(zhì)粒pUC28-LBRB2。從瓊脂糖凝膠中分離526-bp片l殳并將其與Kpnl/Nsil消化的pBINAW2連接，得到載體pBINAW2a。由退火引物MN01(5，-CGGCGCGCCCGGGTTAATTAAG-3，)和畫02(5'-GATCCTTAATTAACCCGGGCGCGCCGGTAC-3，)制備雙鏈寡核苦酸。此序列包含Kpnl和BamHI粘末端和Ascl、Smal和Pacl的限制性位點(diǎn)。將此寡核香酸與Kpnl/BamHI消化的pBINAW2a連接，得到載體pBINAW2b。通過將SH23-2的Pacl/Ascl基因組DNA片段克隆到Pacl/Ascl消化的pBINAW2b得到載體pBINAW2b::R3a。SH23-2是細(xì)菌人工染色體(BAC)SH23的亞克隆(Huang等，2005)。用Sau3AI部分消化此BAC,并將7-10kb部分連接到載體pBINPLUS的BamHI位點(diǎn)。載體pBINAW2b::R3a中的T-DNA包含9-kb的SH23-2pBINPLUS亞克隆的片段，基因R3a的編碼序列(CDS)位于其中。3849-bpCDS(在植物轉(zhuǎn)化后)受存在于SH23-2中R3a最初的啟動子和終止子的調(diào)控(圖5)。從二倍體馬鈴薯克隆SH83-92-488中分離基因組片段SH23-2(Huang等，2005)。使用輔助質(zhì)粒pRK2013通過三親交配將二元載體pBINAW2b::R3a轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌菌抹AGL-1中(Figurski和Helinski,1979)。馬鈴薯的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化體的選擇根據(jù)Visser等(1991a)描述的方法，將來自馬鈴薯栽培種'Desiree'的體外生長植物的節(jié)間插條通過根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。用根癌農(nóng)桿菌COR308或AGL-1中的pBINAW2b::R3a轉(zhuǎn)化馬鈴薯栽培種'Desiree'。沒有進(jìn)行選擇。在4周后，收獲第一個枝條并連續(xù)收獲枝條約3個月。每個莖外植體收獲了不超過兩個再生體，并使枝條生長于玻璃罐(直徑10cm)或塑料罐(直徑15cm)中的MS30培養(yǎng)基上。每個罐包含8個插條。在插條和罐的內(nèi)壁間留出2至3cm的空間。DesireeR3a轉(zhuǎn)化體的PCR選擇1至2周后，收集8個或更多獨(dú)立枝條的葉或莖材料并建庫(庫的大小依據(jù)所期望轉(zhuǎn)化體的頻率)。根據(jù)Rogers和Bendich(1988)所述的CTABDNA分離方法在96孔微量滴定板中分離這些庫中枝條的DNA。4吏用引物AL79(5，-GAGAATGGAAGATTTGGGTGAAG-3，)和AL80(5'-CTAATCTCACCAGTTGGCTGTTC-3，)對分離自再生體庫的DNA進(jìn)行PCR分析，以一全測轉(zhuǎn)化體的存在。在PCR陽性庫中，在96孔孩吏量滴定板中收集單個枝條的葉片和/或莖材料，并使用CTAB基因組DNA分離步驟分離基因組DNA。使用引物AL79(5'-GAGAATGGAAGATTTGGGTGAAG-3，)和AL80(5'-CTAATCTCACCAGTTGGCTGTTC-3，)對分離自單個再生體的DNA進(jìn)行PCR分析，以檢測轉(zhuǎn)化體的存在。通過avr3進(jìn)行體外選擇使體外植抹在24。C和16小時光/8小時黑暗下生長。將帶有3至4片完全發(fā)育葉片的植抹用于體外接種。根據(jù)馬鈴薯基因型，在2至4周后可以對植抹進(jìn)行接種。34通過吸取10(il液滴的游動孢子懸液(2.5xio4孢子/ml)在近軸側(cè)接種每個體外植林的3個最大葉片(每葉片l個斑點(diǎn))。在無菌條件下進(jìn)行接種物制備和接種。排除接觸罐或培養(yǎng)基的內(nèi)壁或蓋的葉片，因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)這些葉片比相同植物的其它葉片的易感性更高。在與帶有被接種脫離葉片的盤相同的氣候室中孵育接種有體外植林的罐。將表現(xiàn)出易感性相互作用的非轉(zhuǎn)化植抹記為S(具有大量孢子形成的擴(kuò)展傷口)或類別SQ(沒有或很少孢子形成的擴(kuò)展傷口)。將表現(xiàn)出抗相互作用的推定轉(zhuǎn)化體記為類別R(無癥狀或局部的HR樣壞死)或類別RQ(拖尾的HR壞死)。將推定轉(zhuǎn)化體移至新培養(yǎng)基中和/或移至溫室的盆栽土中。馬鈴薯栽培種Desiree的無標(biāo)記R3a轉(zhuǎn)化效率用根癌農(nóng)桿菌COR308或才艮癌農(nóng)桿菌Agl-l中的pBINAW2b::R3a接種約5,000個馬鈴薯栽培種Desiree的莖節(jié)間或葉外植體。表2中顯示了收獲枝條的數(shù)量、獲得的PCR陽性枝條的頻率和顯示出表型的枝條的頻率。對于COR308,沒有收獲的枝條被記為PCR陽性，然而對于AGL-l,此百分比大于1.5。/。。在這些PCR陽性轉(zhuǎn)化體中，超過60%顯示出R3a抗性。因此，通過高毒力農(nóng)桿菌菌林AGL1的轉(zhuǎn)化可以產(chǎn)生大量PCR陽性枝條，其中有超過60%表現(xiàn)出表型。表2.通過高毒力AGL1農(nóng)桿菌菌抹使R3a基因高效的無標(biāo)記轉(zhuǎn)化到Desiree馬鈴薯<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>根據(jù)Rogers和Bendich(1988)所述的CTABDNA分離方法從體外枝條中分離DNA。使用引物NPT1和NPT2、trfAl和trfA2、insBl和insB2(序列號l、2、5、6、7和8;Wolters等，1998a)進(jìn)行PCR,以研究轉(zhuǎn)化體中骨架載體DNA的存在。用HindIII消化4pg的轉(zhuǎn)化體DNA，通過凝膠電泳分離片段，并進(jìn)行Southern印跡。使用R3a探針與印跡雜交，以檢驗(yàn)T-DNA插入物的數(shù)量。單拷貝且不含載體DNA的轉(zhuǎn)化體的選擇對于基因內(nèi)或同種源基因轉(zhuǎn)化體的一個要求應(yīng)該是其不具有載體DNA或多個T-DNA的插入物。有報(bào)道在20至75%的轉(zhuǎn)化植物中發(fā)生有邊界遠(yuǎn)處的DNA整合到宿主植物的基因組中。使用針對pBIN19載體四個開放閱讀框的引物通過PCR分析所選不含標(biāo)記的R3a抗性馬鈴薯轉(zhuǎn)化體中骨架載體DNA的存在。在38個測試的R3a抗性馬鈴薯轉(zhuǎn)化體中，20個轉(zhuǎn)化體對全部5條DNA片段均為陰性。使用R3a作為探針通過Southern印跡雜交進(jìn)一步分析這20個不含載體DNA的轉(zhuǎn)化體。這些分析顯示大多數(shù)轉(zhuǎn)化體包含3個或更少拷貝的T-DNA插入。此外，在所分析的20個轉(zhuǎn)化體中，8個包含單個T-DNA插入。這表明不使用選擇標(biāo)記基因來獲得不含骨架載體DNA,僅包含一個T-DNA插入物的R3a轉(zhuǎn)化體是可行的。不含邊界的轉(zhuǎn)化體對邊界序列進(jìn)4亍PCRT-DNA的右邊界和左邊界序列并非源自茄屬植物，而是從pBIN19(pTiT37邊界)中獲得。進(jìn)行PCR以分析這些邊界序列是否存在于轉(zhuǎn)化體中。使用以下引物分析右邊界引物RBcheckl(5'-CCAATATATCCTGTCAGGTA陽3，)和引物SHcisl(5'畫CATCATCATCCCAAGTACAA-3，)。當(dāng)用載體pBINAW2b::R3a的DNA作為模板時，使用這些引物預(yù)期得到795bp的片段。使用引物SHcis2(5'-AAGGGCAAACATAACCATTC-3，)和引物L(fēng)Bcheckl(5，-GGATATATTGTGGTGTAAAC-3，)的組合分析左邊界。當(dāng)用載體pBINAW2b::R3a的DNA作為模板時，使用這些引物預(yù)期得到1084bp的片段。遞^7差西*#移使用UniversalGenomeWalkerKit(Clontech)以從轉(zhuǎn)化體獲得T-DNA側(cè)翼序列。用Dral、EcoRV、PvuII、Seal和Stul消化轉(zhuǎn)化體的DNA。基因組步移適配子與獲得的片段連接來構(gòu)建酶特異性文庫。使用適配子引物API(5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC隱3，)和引物SHGW1(5，-TAAGTTTAATCAGAAGTTGGGTAGGAA-3，)進(jìn)行第一PCR以獲得RB側(cè)翼DNA。使用適配子引物AP2(5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3，)和引物SHGW2(5'-GTTGGGTAGGAAGCCTGCTCTTGGAAA-3，)進(jìn)行巢式PCR。使用適配子引物API和引物SHGW3(5，-GTATGTATGTGTAGTTAATGGGGTAGT-3，)進(jìn)行第一PCR以獲得LB側(cè)翼DNA。使用適配子引物AP2和引物SHGW4(5，-ACGGTTTCTAAATTAACGTAGCCAATA-3，)進(jìn)行巢式PCR。同種源基因R3a轉(zhuǎn)化體的選擇使用上述Genomewalkingkit分析8個不含標(biāo)記和載體DNA的單拷貝R3a轉(zhuǎn)化體中不存在邊界序列。8個轉(zhuǎn)化體中有6個轉(zhuǎn)化體不含任何右邊界序列，然而8個轉(zhuǎn)化體中有5個轉(zhuǎn)化體不含任何左邊界序列。觀察到多達(dá)500bp的刪除。8個轉(zhuǎn)化體中有4個轉(zhuǎn)化體不含任何源自農(nóng)桿菌的T-DNA邊界序列。這些轉(zhuǎn)化體是同種源基因的，所依據(jù)的定義是它們不包含任何非馬鈴薯來源的序列，且這些轉(zhuǎn)化體具有在天然基因組背景中的插入，此插入與在發(fā)現(xiàn)此基因的最初馬鈴薯物種(即矮茄)中發(fā)現(xiàn)的插入相同。實(shí)施例3全部馬鈴薯GBSS-IRT-DNA載體的構(gòu)建T-DNA序列完全源于馬鈴薯GBSSI基因組序列。為了克隆延長的GBSSI啟動子，確定了通常所用啟動子的HindIII位點(diǎn)上游(Visser等，1991b;vanderLeij等，1991a;登錄號X58453)直到BglII位點(diǎn)0.6kb上游(vanderLeij等，1991a)的序列。使用質(zhì)粒pWAM101的DNA(vanderLeij等，1991b)作為模板，通過引物GBSS畫O(5'-TACCGCTACCACTTGACATTC-3，)和BINMCS(5'-GCACCCCAGGCTTTACACTTT-3，)進(jìn)行此PCR。在BglII和HindIII之間的738-bp序列與Dai等(1996)(登錄號X83220)公布的序列具有高度同源性(98%—致)。設(shè)計(jì)引物來擴(kuò)增GBSSI啟動子和上游區(qū)域引物UPGBX(5'-CTCTAGAAGTTCGAGACACTGGCTACG陽3，；具有Xbal位點(diǎn))和？I物PGBB(5，-GGATCCTGGAGGAGATGAGTAAAAGTTA-3，；具有BamHI位點(diǎn))。這些引物用在以pWAM200DNA為模板的PCR中。載體pWAM200包含與載體pWAMlOO(vanderLeij等，1991a)相同但克隆在pMTL24(Chambers等，1988)中的GBSSI基因組DNA的6.5-kbBglII片段。將1528-bpPCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T并測序。根據(jù)vanderLeij等(1993)(登錄號X66826)公布的序列設(shè)計(jì)GBBSI終止子和下游序列的引物。引物TGBB(5，-GGATCCAAACGTATTTACTAGCGAACT-3，；具有BamHI位點(diǎn))和DTGBK(5,-GGTACCAAAGAGACAGGTGCCGTTAT-3，；具有Kpnl位點(diǎn))擴(kuò)增出658-bpPCR產(chǎn)物，其包含來自質(zhì)粒pWAM200的GBSSI終止子和下游序列。將此產(chǎn)物克隆到pGEM-T并測序。用Xbal和BamHI消化從pGEM-T載體中釋方文延長的GBSSI啟動子。用BamHI和Kpnl消化從pGEM-T載體中釋放延長的GBSSI終止子。將這兩個片段與Xbal/Kpnl消化的pUC28連接(BeneS等，1993),得到質(zhì)粒pUC28-PTGB。隨后用Xbal和Kpnl消化質(zhì)粒pUC28-PTGB,并將釋力文的片段與Xbal/Kpnl消化的pBINAW2a載體連接(參見實(shí)施例1)。在得到的載體pBINAW3中，延長的GBSSI啟動子側(cè)翼于LB且GBSSI終止子側(cè)翼于RB。從載體pIRMAS中分離1390-bpBamHI片段，其包含GBSSIcDNA中部的反向重復(fù)，具有由馬鈴薯GBSSIcDNA組成的間隔子序列(Heilersig等，2006)。將此片段克隆到BamHI消化的pBINAW3。得到的二元載體pBINAW4包含GBSSI基因的反義-正義反向重復(fù)，其位于pBIN19LB和RB序列緊鄰側(cè)的延長的GBSSI啟動子和延長的GBSSI終止子之間。使用輔助質(zhì)粒pRK2013通過三親交配將二元載體pBINAW4轉(zhuǎn)化到才艮癌農(nóng)桿菌菌株AGL-1中(Figurski和Helinski，1979)。馬鈴薯的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化體的選擇才艮據(jù)Visser等(1991a)描述的方法，將來自馬鈴薯栽培種'Aventra'或'Aveka'的體外生長植物葉片的節(jié)間插條通過根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。沒有進(jìn)行選擇。在4周后，收獲第一個枝條并連續(xù)收獲枝條約3個月。每個莖外植體收獲了不超過兩個再生體，并使枝條生長于玻璃罐(直徑10cm)或塑料罐(直徑15cm)中的MS30培養(yǎng)基上。每個罐包含8個插條。在插條和罐的內(nèi)壁間留出2至3cm的空間。AvekaGBSS-IR轉(zhuǎn)化體的PCR選擇1至2周后，收集8個或更多獨(dú)立枝條的葉或莖材料并建庫(庫的大小依據(jù)所期望轉(zhuǎn)化體的頻率)。根據(jù)Rogers和Bendich(1988)所述的CTABDNA分離方法在96孔微量滴定板中分離這些庫中枝條的DNA。使用引物AMYMLF(5，-AGATAAGCTTTCTCATTCCTTGC-3，)和AMYMLR(5'-TCCTCCAGGATCCTTCTGG-3，)對分離自再生體庫的DNA進(jìn)行PCR分析，以檢測轉(zhuǎn)化體的存在。在PCR陽性庫中，在96孔微量滴定板中收集單個枝條的葉片和/或莖材料，并使用CTAB基因組DNA分離步驟分離基因組DNA。使用引物AMYMLF(5，-AGATAAGCTTTCTCATTCCTTGC-3，)和AMYMLR(5，-TCCTCCAGGATCCTTCTGG-3,)對分39離自單個再生體的DNA進(jìn)行PCR分析，以檢測轉(zhuǎn)化體的存在。體外塊莖形成向PCR陽性枝條中加入20ml液體培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基由加有325g/L蔗糖和1.75g/LCCC(氯化氯膽堿，或矮壯素)的KI培養(yǎng)基('knolinducerend，(=塊莖誘導(dǎo))培養(yǎng)基，Duchefa)組成。將盆置于18。C的黑暗生長室中。在2至4周后大多數(shù)枝條上發(fā)育出小塊莖。淀粉染色將小塊莖切下并用碘溶液染色以評估淀粉顆粒中直鏈淀粉的存在。使用顯微鏡檢查淀粉顆粒的染色。馬鈴薯栽培種Aveka的無標(biāo)記GBSS-IR轉(zhuǎn)化效率用根癌農(nóng)桿菌AGL-1中的pBINAW4接種約2,000個馬鈴薯栽培種Aveka的莖節(jié)間或葉外植體。總共收獲了3787個枝條，在其中獲得了28個PCR陽性枝條(0.74%)。在這28個枝條中，72%不含直鏈淀4分表型。DNA分析根據(jù)Rogers和Bendich(1988)所述的CTABDNA分離方法從體外枝條中分離DNA。使用引物NPT1和NPT2、trfAl和trfA2、insBl和insB2(序列號1、2、5、6、7和8;Wolters等，1998a)進(jìn)行PCR，以研究轉(zhuǎn)化體中骨架載體DNA的存在。用BamHI、HindIII和EcoRI消化4fig的轉(zhuǎn)化體DNA,通過凝月交電泳分離片段，并進(jìn)行Southern印跡。使用GBSS終止子探針與印跡雜交，以檢驗(yàn)T-DNA插入的數(shù)量。單拷貝且不含載體DNA的轉(zhuǎn)化體的選擇對于基因內(nèi)轉(zhuǎn)化體的一個要求應(yīng)該是其不具有載體DNA或多個T-DNA的插入物。使用針對pBIN19載體四個開放閱讀框的引物通過PCR分析18個所選不含標(biāo)記和直鏈淀粉的Aveka轉(zhuǎn)化體中骨架載體DNA的存在。在18個測試的R3a抗性馬鈴薯轉(zhuǎn)化體中，8個轉(zhuǎn)化體對全部5條DNA片段均為陰性。使用GBSS終止子序列作為探針通過Southern印跡雜交進(jìn)一步分析這8個不含載體DNA的轉(zhuǎn)化體。這些分析顯示全部轉(zhuǎn)化體包含1或2個拷貝的T-DNA插入。此外，在所分析的8個轉(zhuǎn)化體中，5個包含單個T-DNA插入。這表明不使用選擇標(biāo)記基因來獲得不含骨架載體DNA,僅包含一個T-DNA插入物的GBSS-IR轉(zhuǎn)化體是可行的。不含邊界的轉(zhuǎn)化體對邊界序列進(jìn)行PCRT-DNA的右邊界和左邊界序列并非源自茄屬植物，而是從pBIN19(pTiT37邊界)中獲得。進(jìn)行PCR以分析這些邊界序列是否存在于轉(zhuǎn)化體中。使用以下各套引物分析右邊界對于右邊界分析參AmyMLRB:5'-TCAGGTACCAAAGAGACAGG-3'和AmyMLsenseterm:5'-GGAGCAGAAGGATCCAAACG-3，作為一套引物聯(lián)合用于PCRAmyMLterml:5'-TGCCGTTATGTAAAGGAG-3，和AmyMLsenseterm:5，-GGAGCAGAAGGATCCAAACG-3，作為一套引物聯(lián)合用于PCR參AmyMLterm2:5'-AGCTTCTTTCATATGACCAACC-3，和AmyMLsenseterm:5'畫GGAGCAGAAGGATCCAAACG畫3，作為一套引物聯(lián)合用于PCR對于左邊界分析41參AmyMLLB:5，-CAGGATATATTGTGGTGTAAACTC-3，和GBSS23:5，-TCAATGTTTGTTACATTTCTTCC-3，作為一套引物聯(lián)合用于PCR參AmyMLp腿l:5'-TATCTTTGCTCAGGACCCTG-3，和AmyMLas-proml:5'-GCAGAAGGATCCTGGAGG-3，作為一套引物聯(lián)合用于PCR參AmyMLprom2:5，-AACTCGAAGTCAGCCTGCG-3，和AmyMLas-proml:5'-GCAGAAGGATCCTGGAGG畫3，作為一套引物聯(lián)合用于PCR參GBSS9:5'-CAAATGCAACAGTATCTTGTACC-3'和GBSSO:5'陽ACCGCTACCACTTGACATTCC-3作為一套引物聯(lián)合用于PCR遞^差^逸#移使用UniversalGenomeWalkerKit(Clontech)以從轉(zhuǎn)化體獲得T-DNA側(cè)翼序列。用Dral、EcoRV、PvuII、Seal和Stul消化轉(zhuǎn)化體的DNA?；蚪M步移適配子與獲得的片段連接來構(gòu)建酶特異性文庫。使用適配子引物API(5，-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3，)和引物SHGW1(5，-TAAGTTTAATCAGAAGTTGGGTAGGAA-3，)進(jìn)行第一PCR以獲得RB側(cè)翼DNA。使用適配子引物AP2(5，-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3，)和引物SHGW2(5'陽GTTGGGTAGGAAGCCTGCTCTTGGAAA-3，)進(jìn)行巢式PCR。使用適配子引物API和引物GBSSIGW1(5'-TTTACTCATCTCCTCCAGGATCCTTCT-3，)進(jìn)行第一PCR以獲得LB側(cè)翼DNA。使用適配子引物AP2和引物GBSSIGW2(5'-ATCTCCTCCAGGATCCTTCTGCTCCTC-3，)進(jìn)行巢式PCR?；騼?nèi)GBSS-IR轉(zhuǎn)化體的選擇如上所述使用PCR分析來分析5個不含標(biāo)記和載體DNA的單拷貝GBSS-IR轉(zhuǎn)化體中不存在邊界序列。5個轉(zhuǎn)化體中有2個轉(zhuǎn)化體不含任何右邊界序列，然而這些轉(zhuǎn)化體顯示出大的左邊界序列的刪除。在分析的5個轉(zhuǎn)化體中有2個轉(zhuǎn)化體不含任何源自農(nóng)桿菌的T-DNA邊界序列。這些轉(zhuǎn)化體是基因內(nèi)的，所依據(jù)的定義是它們不包含任何非馬鈴薯來源的序列(參見圖7)。實(shí)施例4不含標(biāo)記的R3a-GBSS-IR構(gòu)建體全部馬鈴薯R3a-GBSS-IRT-DNA載體的構(gòu)建T-DNA序列完全源于馬鈴薯GBSSI基因組序列。為了克隆延長的GBSSI啟動子，確定了通常所用啟動子的HindIII位點(diǎn)上游(Visser等，1991b;vanderLeij等，1991a;登錄號X58453)直到BglII位點(diǎn)0.6kb上游(vanderLeij等，1991a)的序列。使用質(zhì)粒pWAMlOl的DNA(vanderLeij等，1991b)作為才莫板，通過引物GBSS-0(5'-TACCGCTACCACTTGACATTC-3，)和BINMCS(5'-GCACCCCAGGCTTTACACTTT-3，)進(jìn)行此PCR。在BglII和HindIII之間的738-bp序列與Dai等(1996)(登錄號X83220)公布的序列具有高度同源性(98%—致)。設(shè)計(jì)引物來擴(kuò)增GBSSI啟動子和上游區(qū)域引物UPGBX(5，-CTCTAGAAGTTCGAGACACTGGCTACG-3，；具有Xbal4立點(diǎn))和引物PGBB(5，-GGATCCTGGAGGAGATGAGTAAAAGTTA-3';具有BamHI位點(diǎn))。這些引物用在以pWAM200DNA為模板的PCR中。載體pWAM200包含與載體pWAMlOO(vanderLeij等，1991a)相同但克隆在pMTL24(Chambers等，1988)中的GBSSI基因組DNA的6.5-kbBglII片段。將1528-bpPCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T并測序。根據(jù)vanderLeij等(1993)(登錄號X66826)公布的序列設(shè)計(jì)GBBSI終止子和下游序列的引物。引物TGBB(5，-GGATCCAAACGTATTTACTAGCGAACT陽3，；具有BamHI位點(diǎn))和DTGBK(5，-GGTACCAAAGAGACAGGTGCCGTTAT-3，；具有Kpnl位點(diǎn))擴(kuò)增出658-bpPCR產(chǎn)物，其包含來自質(zhì)粒pWAM200的GBSSI終止子和下游序列。將此產(chǎn)物克隆到pGEM-T并測序。用Xbal和BamHI消化從pGEM-T載體中釋放延長的GBSSI啟動子。用BamHI和Kpnl消化從pGEM-T載體中釋放延長的GBSSI終止子。將這兩個片段與Xbal/Kpnl消化的pUC28連接(BeneS等，1993),得到質(zhì)粒pUC28-PTGB。隨后用Xbal和Kpnl消化質(zhì)粒pUC28-PTGB,并將釋》文的片段與Xbal/Kpnl消化的pBINAW2a載體連接(參見實(shí)施例1)。在得到的載體pBINAW3中，延長的GBSSI啟動子側(cè)翼于LB且GBSSI終止子側(cè)翼于RB。從載體pIRMAS中分離13卯-bpBamHI片段，其包含GBSSIcDNA中部的反向重復(fù)，具有由馬鈴薯GBSSIcDNA組成的間隔子序列(Heilersig等，2006)。將此片段克隆到BamHI消化的pBINAW3。得到的二元載體pBINAW4包含GBSSI基因的反義-正義反向重復(fù)，其位于pBIN19LB和RB序列緊鄰側(cè)的延長的GBSSI啟動子和延長的GBSSI終止子之間。載體pBINAW4a源于載體pBINAW4。將具有兩個Kpnl粘末端的雙鏈寡核苷酸與pBINAW4的Kpnl位點(diǎn)連接。此雙鏈寡核苷酸具有Ascl、Smal和PvuI的限制性位點(diǎn)。寡核苷酸可能有兩個方向一種是AscI位點(diǎn)最靠近RB，而另一種是PvuI位點(diǎn)最靠近RB。選擇第一種方向。通過將SH23-2的Pacl/Ascl基因組DNA片段克隆到Pvul/Ascl消化的pBINAW4a得到載體pBINAW4a::R3a。SH23-2是細(xì)菌人工染色體(BAC)SH23的亞克隆(Huang等，2005)。用Sau3AI部分消化此BAC,并將7-10kb部分連接到載體pBINPLUS的BamHI位點(diǎn)。使用限制性酶Pacl和Ascl,從pBINPLUS::R3a上切下9-kb片段(截短的SH23-2)并將此片段與pBINAW4a的Pvul和Ascl位點(diǎn)連才妾。T-DNA包含SH23-2的片段，R3a基因的編碼序列(CDS)位于其中。此CDS(在植物轉(zhuǎn)化后)受同樣存在于SH23-2中R3a最初的啟動子和終止子的調(diào)控。從二倍體馬鈴薯克隆SH83-92-488中分離基因組片段SH23-2(Huang等，2005)。使用輔助質(zhì)粒pRK2013通過三親交配將二元載體pBINAW4a::R3a(圖6)轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌菌林AGL-1中(Figurski和Helinski，1979)。馬發(fā)#的脊^和^必傳的這舉根據(jù)Visser等(1991a)描述的方法，將來自馬鈴薯栽培種'Desiree'、'Aventra'或'Aveka'的體外生長植物的節(jié)間插條通過根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。根據(jù)相同的方法用根癌農(nóng)桿菌菌株AGL-1中pBINAW4a::R3a轉(zhuǎn)化馬鈴薯栽培種'Desiree'。沒有進(jìn)行選擇。在4周后，收獲第一個枝條并連續(xù)收獲枝條約3個月。每個莖外植體收獲了不超過兩個再生體，并使枝條生長于玻璃罐(直徑10cm)或塑料罐(直徑15cm)中的MS30培養(yǎng)基上。每個罐包含5個插條。在插條和罐的內(nèi)壁間留出2至3cm的空間。用于疾病測試的體外試驗(yàn)使體外植抹在24。C和16小時光/8小時黑暗下生長。將帶有3至4片完全發(fā)育葉片的植抹用于體外接種。根據(jù)馬鈴薯基因型，在2至4周后可以對植抹進(jìn)行接種。通過吸取10pl液滴的游動孢子懸液(2.5x104孢子/ml)在近軸側(cè)接種每個體外植抹的3個最大葉片(每葉片l個斑點(diǎn))。在無菌條件下進(jìn)行接種物制備和接種。排除接觸罐或培養(yǎng)基的內(nèi)壁或蓋的葉片，因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)這些葉片比相同植物的其它葉片的易感性更高。在與帶有被接種脫離葉片的盤相同的氣候室中孵育接種有體外植抹的罐。將表現(xiàn)出易感性相互作用的非轉(zhuǎn)化植抹記為S(具有大量孢子形成的擴(kuò)展傷口)或類別SQ(沒有或很少孢子形成的擴(kuò)展傷口)。將表現(xiàn)出抗相互尾的HR壞死)。將推定轉(zhuǎn)化體移至新培養(yǎng)基中和/或移至溫室的盆栽土中。45向PCR陽性枝條中加入20ml液體培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基由加有325g/L蔗糖和1.75g/LCCC(氯化氯膽堿，或矮壯素)的KI培養(yǎng)基('knolinducerend'(=塊莖誘導(dǎo))培養(yǎng)基，Duchefa)組成。將盆置于18°C的黑暗生長室中。在2至4周后大多數(shù)枝條上發(fā)育出小塊莖。淀粉染^將小塊莖切下并用碘溶液染色以評估淀粉顆粒中直鏈淀粉的存在。使用顯微鏡檢查淀粉顆粒的染色。DiVJ為、浙根據(jù)Rogers和Bendich(1988)所述的CTABDNA分離方法從體外枝條中分離DNA。使用引物NPT1和NPT2、trfAl和trfA2、insBl和insB2(序列號1、2、5、6、7和8;Wolters等，1998a)進(jìn)行PCR,以研究轉(zhuǎn)化體中骨架載體DNA的存在。用HindlII消化4iig的轉(zhuǎn)化體DNA,通過凝膠電泳分離片段，并進(jìn)行Southern印跡。使用R3a探針與印跡雜交，以檢驗(yàn)T-DNA插入的數(shù)量。不含邊界的轉(zhuǎn)化體T-DNA的右邊界和左邊界序列并非源自茄屬^t物，而是從pBIN19(pTiT37邊界)中獲得。進(jìn)行PCR以分析這些邊界序列是否存在于轉(zhuǎn)化體中。使用以下引物分析右邊界引物RBcheckl(5，-CCAATATATCCTGTCAGGTA-3，)和引物SHcisl(5，-CATCATCATCCCAAGTACAA-3，)。當(dāng)用載體pBINAW4a::R3a的DNA作為模板時，使用這些引物預(yù)期得到795bp的片段。使用引物GBSSIcisl(5，-CTCTGTCAACAGCCAAATAG-3，)和引物L(fēng)Bcheckl(5，-GGATATATTGTGGTGTAAAC-3，)的組合分析左邊界。當(dāng)用載體pBINAW4a::R3a的DNA作為模板時，使用這些引物預(yù)期得到836bp的片段。遽^差茵邀步移使用UniversalGenomeWalkerKit(Clontech)以從轉(zhuǎn)化體獲得T-DNA側(cè)翼序列。用Dral、EcoRV、PvuII、Seal和Stul消化轉(zhuǎn)化體的DNA。基因組步移適配子與獲得的片段連接來構(gòu)建酶特異性文庫。使用適配子引物API(5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3，)和引物SHGWl(5'隱TAAGTTTAATCAGAAGTTGGGTAGGAA-3，)進(jìn)行第一PCR以獲得RB側(cè)翼DNA。使用適配子引物AP2(5，-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3，)和引物SHGW2(5'-GTTGGGTAGGAAGCCTGCTCTTGGAAA-3，)進(jìn)行巢式PCR。使用適配子引物API和引物GBSSIGW1(5'-TTTACTCATCTCCTCCAGGATCCTTCT-3，)進(jìn)行第一PCR以獲得LB側(cè)翼DNA。使用適配子引物AP2和引物GBSSIGW2(5'-ATCTCCTCCAGGATCCTTCTGCTCCTC-3，)進(jìn)行巢式PCR。實(shí)施例5不含標(biāo)記的同種源基因R3a-blbl構(gòu)建體載體pBINAW2b::blbl-R3a是T-DNA中沒有選擇基因的二元質(zhì)粒，且其源自載體pBINAW2b::R3a。通過將SH23-2的Pacl/Ascl基因組DNA片段克隆到Pvul/Ascl消化的pBINAW4a得到載體pBINAW4a::R3a。通過使用限制性酶PacI和AscI從亞克隆中克隆SH23-2片段，并將其與pBINAW2b的Pacl和Ascl位點(diǎn)連接來構(gòu)建載體pBINAW2b::R3a(參見實(shí)施例1)。SH23-2是細(xì)菌人工染色體(BAC)SH23的亞克隆(Huang等，2005)。用Sau3AI部分消化此BAC,并將7-10kb部分連接到載體pBINPLUS的BamHI位點(diǎn)。在構(gòu)建pBINAW2b::R3a后，使用限制性酶Ascl和Sbfl將RGC2片段置于Ascl位點(diǎn)和右邊界之間。RGC2是pBINPLUS亞克隆，且與SH23-2類似，其也是通過將Sau3AI部分消化BAC得到的7-10kb部分(SPB4)(vanderVossen等，2003)克隆進(jìn)pBINPLUS的BamHI位點(diǎn)來構(gòu)建的。使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來擴(kuò)增6.5-kb的RGC2片段。所用的引物延長具有Ascl和Sbfl位點(diǎn)。因此擴(kuò)增的片段可以被這些酶消化，且隨后將此片段與pBINAW2b::R3a的Ascl和Sbfl位點(diǎn)連接。全部pBINAW2b::blbl-R3a構(gòu)建體的大小為23,147bp。T-DNA側(cè)翼于邊界；左邊界(LB)和右邊界(R)。這些邊界源自農(nóng)桿菌，并起用于農(nóng)桿菌區(qū)分載體和T-DNA間邊界的信號作用。此T-DNA通過農(nóng)桿菌被整合到馬鈴薯基因組中。T-DNA包含SH23-2和RGC2pBINPLUS亞克隆的片段，其中R3a的編碼序列(CDS)位于SH23-2上且Rpi-blbl的CDS位于RGC2上。T-DNA包含SH23-2的片段，R3a基因的編碼序列(CDS)位于其中。這些CDS(在植物轉(zhuǎn)化后)受同樣存在于SH23-2和RGC2中R3a和Rpi-blbl最初的啟動子和終止子的調(diào)控。從二倍體馬鈴薯克隆SH83-92-488中分離基因組片段SH23-2(H腿g等，2005)，且從5b/謹(jǐn)附W6ocas她應(yīng)中分離基因組片段RGC2。T-DNA中不存在用于選擇轉(zhuǎn)基因植物的選擇基因(如NPTII)。只有基因組SH23-2片段、基因組RGC2片段和邊界序列將被整合進(jìn)入植物基因組。<吏用輔助質(zhì)4立pRK2013通過三親本交配將二元載體pBINAW2b::blbl-R3a轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌菌抹AGL-1中(Figurski和Helinski，1979)。馬發(fā)#^脊化和餘^#的遂#根據(jù)Visser等(1991a)描述的方法，將來自馬鈴薯栽培種'Desiree'的體外生長植物的節(jié)間插條通過根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。用根癌農(nóng)桿菌菌抹AGL-1中pBINAW2b::blbl-R3a轉(zhuǎn)化馬鈴薯栽培種'Desiree'。沒有進(jìn)行選擇。在4周后，收獲第一個枝條并連續(xù)收獲枝條約3個月。每個莖外植體收獲了不超過兩個再生體，并使枝條生長于玻璃罐(直徑10cm)或塑料罐(直徑15cm)中的MS30培養(yǎng)基上。每個罐包含5個插條。在插條和罐的內(nèi)壁間留出2至3cm的空間。通過avr3進(jìn)行體外選擇使體外植林在24'C和16小時光/8小時黑暗下生長。將帶有3至4片完全發(fā)育葉片的植抹用于體外接種。根據(jù)馬鈴薯基因型，在2至4周后可以對植抹進(jìn)行接種。通過吸取10(il液滴的游動孢子懸液(2.5x104孢子/ml)在近軸側(cè)接種每個體外植株的3個最大葉片(每葉片l個斑點(diǎn))。在無菌條件下進(jìn)行接種物制備和接種。排除接觸罐或培養(yǎng)基的內(nèi)壁或蓋的葉片，因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)這些葉片比相同植物的其它葉片的易感性更高。在與帶有被接種脫離葉片的盤相同的氣候室中孵育接種有體外植株的罐。將表現(xiàn)出易感性相互作用的非轉(zhuǎn)化植抹記為S(具有大量孢子形成的擴(kuò)展傷口)或類別SQ(沒有或很少孢子形成的擴(kuò)展傷口)。將表現(xiàn)出抗相互作用的推定轉(zhuǎn)化體記為類別R(無癥狀或局部的HR樣壞死)或類別RQ(拖尾的HR壞死)。將推定轉(zhuǎn)化體移至新培養(yǎng)基中和/或移至溫室的盆栽土中。針對blbl基因表達(dá)再次分析推定轉(zhuǎn)化體。因此，用IpOl接種或體外植物或溫室植物葉片。對于分離的葉片分析，從溫室生長植物上切下第三至第五完全發(fā)育的葉片(從頂端算起)并將其置于盤中水飽和的種花泡沫(Oasis,Grtinstadt,Germany)中。根據(jù)茄屬植物葉片的形狀和大小，將一個或多個葉片用于接種。通常，通過吸取10pl液滴的游動孢子懸液(5x104孢子/ml)在近軸側(cè)對每個基因型接種IO個斑點(diǎn)。隨后將盤用透明蓋子蓋住(有蓋的盤)，轉(zhuǎn)移至氣候室中，并在16。C和16小時/8小時白天夜晚光周期下孵育。通過測定傷口大小(LS)、宏觀評分或二者相結(jié)合來確定抗性水平。通常點(diǎn)接種6天后在使用與計(jì)算機(jī)相連的電子卡尺測定LS。從10次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中計(jì)算平均LS?；谄骄鶄诖笮。鄬intje指定從0-9的相對分?jǐn)?shù)(表2)。也檢查傷口表型。此外根據(jù)以下進(jìn)行宏觀評分。將相容的相互作用分為S(具有大量孢子形成的易感性擴(kuò)展傷口)或SQ(沒有或很少孢子形成的擴(kuò)展傷口)。將不相容的相互作用記為R(抗性的，無癥狀或局部的HR樣壞死)或RQ(拖尾的HR壞死)。也觀察到相容和不相容相互作用之間的中間表型(Q),如在每片復(fù)葉的2至3片小葉上的孢子形成和在其它小葉上的局部HR。Z)M4為、浙根據(jù)Rogers和Bendich(1988)所述的CTABDNA分離方法從體外一支條中分離DNA。使用引物NPT1和NPT2、trfAl和trfA2、insBl和insB2(序列號l、2、5、6、7和8;Wolters等，1998a)進(jìn)行PCR,以研究轉(zhuǎn)化體中骨架載體DNA的存在。用HindIII消化4(ig的轉(zhuǎn)化體DNA,通過凝膠電泳分離片段，并進(jìn)行Southern印跡。使用R3a探針與印跡雜交，以檢驗(yàn)T-DNA插入物的數(shù)量。不含邊界的轉(zhuǎn)化體對3##/{/迷存尸0T-DNA的右邊界和左邊界序列并非源自茄屬才直物，而是從pBIN19(pTiT37邊界)中獲得。進(jìn)行PCR以分析這些邊界序列是否存在于轉(zhuǎn)化體中。使用以下引物分析右邊界引物RBcheckl(5'-CCAATATATCCTGTCAGGTA-3，)和引物RGCcisl(5，-CGCTTTCAGAATCTATTACT-3，)。當(dāng)用載體pBINAW2b::blbl-R3a的DNA作為才莫板時，使用這些引物預(yù)期得到693bp的片段。使用引物SHcis2(5，-AAGGGCAAACATAACCATTC-3，)和引物L(fēng)Bcheckl(5'-GGATATATTGTGGTGTAAAC-3，)的組合分析左邊界。當(dāng)用載體pBINAW2b::blbl-R3a的DNA作為模板時，使用這些引物預(yù)期得到1084bp50的片段。遞^7差^遂,移使用UniversalGenomeWalkerKit(Clontech)以從轉(zhuǎn)化體獲得T-DNA側(cè)翼序列。用Dral、EcoRV、PvuII、Seal和Stul消化轉(zhuǎn)化體的DNA。基因組步移適配子與獲得的片段連接來構(gòu)建酶特異性文庫。使用適配子引物API(5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3，)和引物RGCGW1(5'-ATTTCATGCGCATATTCCCGATCAAAC-3，)進(jìn)行第一PCR以獲得RB側(cè)翼DNA。使用適配子引物AP2(5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3，)和引物RGCGW2(5'-TCCCGATCAAACTTAAATTACTAGACT-3，)進(jìn)行巢式PCR。使用適配子引物API和引物SHGW3(5'-GTATGTATGTGTAGTTAATGGGGTAGT-3，)進(jìn)行第一PCR以獲得LB側(cè)翼DNA。使用適配子引物AP2和引物SHGW4(5'陽ACGGTTTCTAAATTAACGTAGCCAATA-3,)進(jìn)行巢式PCR。實(shí)施例6不含標(biāo)記的R3a::蒸煮型不含標(biāo)記的轉(zhuǎn)化-選擇不含直鏈淀粉-選擇不含載體DNA和邊界的轉(zhuǎn)化體不含標(biāo)記的R3a::蒸煮型基因StTLRP不含標(biāo)記的轉(zhuǎn)化-選擇R3a-選擇不含載體DNA和邊界的轉(zhuǎn)化體使用PCR引物L(fēng)TF1(5，-GGATCCATGGGTTCCAAGGCAATTATGTT-3，)和LTR1(5，-GGATCCGAATGGCTTTATTCATACTTGTT-3，)擴(kuò)增蒸煮型基因StTLRP(Klooste醒n2006)的編碼序列。將360-bpPCR片段克隆進(jìn)pGEM-T載體，并隨后用BamHI消化。從瓊脂糖凝膠中分離BamHI插入物，并將其與載體pBINAW4的大BamHI片段連接(參見實(shí)施例2)，因此將GBSSIcDNA反向重復(fù)替換為StTLRPcDNA序列。選擇在GBSSI啟動子和GBSSI終止子間StTLRPcDNA為正義方向的克隆，并將其命名為200880003086.6說明書第49/60頁pBINAW7。將具有兩個Kpnl粘末端的雙鏈寡核苷酸與pBINAW7的Kpnl位點(diǎn)連接。此雙鏈寡核苷酸具有Ascl、Smal和Pvul的限制性位點(diǎn)。寡核苷酸可能有兩個方向一種是Ascl位點(diǎn)最靠近RB,而另一種是PvuI位點(diǎn)最靠近RB。選捧第一種方向。將得到的載體命名為pBINAW7a。通過將SH23-2的Pacl/Ascl基因組DNA片段克隆到Pvul/Ascl消化的pBINAW7a得到pBINAW7a::R3a。SH23-2是細(xì)菌人工染色體(BAC)SH23的亞克隆(Huang等，2005)。用Sau3AI部分消化此BAC,并將7-10kb部分連接到載體pBINPLUS的BamHI位點(diǎn)。使用限制性酶Pacl和Ascl,從pBINPLUS::R3a上切下9-kb片段(截短的SH23-2)并將此片段與pBINAW7a的Pvul和Ascl^f立點(diǎn)連才妻。T-DNA包含SH23-2的片段，R3a基因的編碼序列(CDS)位于其中。此CDS(在^i物轉(zhuǎn)化后)受同樣存在于SH23-2中R3a最初的啟動子和終止子的調(diào)控。從二倍體馬鈴薯克隆SH83-92-488中分離基因組片段SH23-2(H腿g等，2005)。使用輔助質(zhì)粒pRK2013通過三親交配將二元載體pBINAW7a::R3a轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌菌林AGL-1中(Figurski和Helinski，1979)。馬發(fā)多的脊化和發(fā)化傳的遂斧根據(jù)Visser等(1991a)描述的方法，將來自馬鈴薯栽培種'Desiree'、'Aventra'或'Aveka'的體外生長植物的節(jié)間插條通過根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。根據(jù)相同的方法用根癌農(nóng)桿菌菌株AGL-1中pBINAW4a::R3a轉(zhuǎn)化馬鈴薯栽培種'Desiree'。沒有進(jìn)行選擇。在4周后，收獲第一個枝條并連續(xù)收獲枝條約3個月。每個莖外植體收獲了不超過兩個再生體，并使枝條生長于玻璃罐(直徑10cm)或塑料罐(直徑15cm)中的MS30培養(yǎng)基上。每個罐包含5個插條。在插條和罐的內(nèi)壁間留出2至3cm的空間。用于疾病測試的體外試驗(yàn)使體外植林在24。C和16小時光/8小時黑暗下生長。將帶有3至4片完全發(fā)育葉片的植株用于體外接種。根據(jù)馬鈴薯基因型，在2至4周后可以對植抹進(jìn)行接種。通過吸取10pl液滴的游動孢子懸液(2.5x104孢子/ml)在近軸側(cè)接種每個體外植抹的3個最大葉片(每葉片1個斑點(diǎn))。在無菌條件下進(jìn)行接種物制備和接種。排除接觸罐或培養(yǎng)基的內(nèi)壁或蓋的葉片，因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)這些葉片比相同植物的其它葉片的易感性更高。在與帶有被接種脫離葉片的盤相同的氣候室中孵育接種有體外植抹的罐。將表現(xiàn)出易感性相互作用的非轉(zhuǎn)化植抹記為S(具有大量孢子形成的擴(kuò)展傷口)或類別SQ(沒有或很少孢子形成的擴(kuò)展傷口)。將表現(xiàn)出抗相互作用的推定轉(zhuǎn)化體記為類別R(無癥狀或局部的HR樣壞死)或類別RQ(拖尾的HR壞死)。將推定轉(zhuǎn)化體移至新培養(yǎng)基中和/或移至溫室的盆栽土中。蕃;^藝W》浙在對質(zhì)構(gòu)進(jìn)行可視評分并在范圍從堅(jiān)實(shí)的/非粉狀塊莖(1)到極度粉狀塊莖(6)的公稱值上進(jìn)行分類后，將每種樣品的三個塊莖去皮并蒸汽蒸煮20分鐘。D假為、浙根據(jù)Rogers和Bendich(1988)所述的CTABDNA分離方法從體外枝條中分離DNA。使用引物NPT1和NPT2、trfAl和trfA2、insBl和insB2(序列號l、2、5、6、7和8;Wolters等，1998a)進(jìn)行PCR,以研究轉(zhuǎn)化體中骨架載體DNA的存在。用HindIII消化4的轉(zhuǎn)化體DNA,通過凝月交電泳分離片段，并進(jìn)行Southern印跡。使用R3a探針與印跡雜交，以檢驗(yàn)T-DNA插入的數(shù)量。不含邊界的轉(zhuǎn)化體義,遂#淨(jìng)/{/遽/戶尸CWT-DNA的右邊界和左邊界序列并非源自茄屬植物，而是從pBIN19(pTiT37邊界)中獲得。進(jìn)行PCR以分析這些邊界序列是否存在于轉(zhuǎn)化體中。使用以下引物分析右邊界引物RBcheckl(5，-CCAATATATCCTGTCAGGTA誦3，)和引物SHcisl(5，-CATCATCATCCCAAGTACAA-3，)。當(dāng)用載體pBINAW4a::R3a的DNA作為模板時，使用這些引物預(yù)期得到795bp的片段。使用引物GBSSIcisl(5'-CTCTGTCAACAGCCAAATAG-3，)和引物L(fēng)Bcheckl(5，-GGATATATTGTGGTGTAAAC-3，)的組合分析左邊界。當(dāng)用載體pBINAW4a::R3a的DNA作為模板時，使用這些引物預(yù)期得到836bp的片段。遞^差^逸#移使用UniversalGenomeWalkerKit(Clontech)以從轉(zhuǎn)化體獲得T-DNA側(cè)翼序列。用Dral、EcoRV、PvuII、Seal和Stul消化轉(zhuǎn)化體的DNA?；蚪M步移適配子與獲得的片段連接來構(gòu)建酶特異性文庫。使用適配子引物API(5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3，)和引物SHGWl(5，-TAAGTTTAATCAGAAGTTGGGTAGGAA-3，)進(jìn)行第一PCR以獲得RB側(cè)翼DNA。使用適配子引物AP2(5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3，)和引物SHGW2(5，-GTTGGGTAGGAAGCCTGCTCTTGGAAA-3，)進(jìn)行巢式PCR。使用適配子引物API和引物GBSSIGW3(5'-ATTGCCTTGGAACCCATGGATCCTTCT-3，)進(jìn)行第一PCR以獲得LB側(cè)翼DNA。使用適配子引物AP2和引物GBSSIGW4(5'-TGGAACCCATGGATCCTTCTGCTCCTC-3，)進(jìn)行巢式PCR。實(shí)施例7具有減弱區(qū)的不含標(biāo)記的同種源基因R3aGBSS-IR構(gòu)建體構(gòu)建具有LB外序列以防止骨架栽體DNA整合的全馬鈴薯T-DNA載體骨架載體(非T-DNA)序列在植物基因組中的整合通常發(fā)生在根癌農(nóng)才干菌專爭4匕期間(Kononov等，1997;Ramanathan禾口Veluthambi,1995;VanderGraaff等，1996;Wenck等，1997;Wolters等，1998b)。Wang等(1987)報(bào)道了"邊界重復(fù)的旁側(cè)序列增強(qiáng)(在右側(cè))或減弱(在左側(cè))它們的活性"。他們定義了'減弱區(qū)，靠近質(zhì)粒pTiC58的LB的T-DNA的363-bp富含AT的EcoRI/BclI片段。DeBuck等(2000)指出"有可能刪除內(nèi)部邊界區(qū)(存在于載體來源的最初Ti質(zhì)粒的一段T-DNA)會引起LB重復(fù)的無效缺口，導(dǎo)致位于下游的載體序列連讀通過LB和轉(zhuǎn)移"。Kuraya等(2004)報(bào)道"來自對照載體的'載體骨架，的轉(zhuǎn)移主要是因?yàn)門-DNA轉(zhuǎn)移中間產(chǎn)物形成的無效終止，且其它LB序列有效地抑制此轉(zhuǎn)移"?；谶@些報(bào)道，我們已經(jīng)克隆了額外的胭脂堿型LB以及在二元載體的LB外的側(cè)翼減弱區(qū)，以防止骨架載體載體向植物基因組中的整合。從根癌農(nóng)桿菌菌枒、LBA958(由P.Hooykaas博士4是供，LeidenUniversity,TheNetherlands)中分離Ti質(zhì)粒pTiC58Cl。Gielen等(1999)公布了此Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)域的完整序列。使用引物L(fēng)B2(5，-TAAGCGAGAAATGAATAAGAAG-3，)和LBatt(5，-GCGAGACAGATGAAACGAAGTA-3，)通過PCR從此Ti質(zhì)粒中擴(kuò)增出8S5-bp片段。將此片段克隆到pGEM-T并測序。隨后將此質(zhì)粒(pAttl-1)轉(zhuǎn)化到為danf和dcm—的大腸桿菌菌抹GM2163(Fermentas)中。用Bell消化從此菌林中分離的質(zhì)粒DNA,釋放出包含減弱區(qū)和LB序列的Bell片段。將此片段克隆到經(jīng)Bell消化和堿性磷酸酶處理的pBINAW2a質(zhì)粒DNA中，所述pBINAW2a質(zhì)粒DNA分離自大腸桿菌菌株GM2163轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物。分析一些菌落是否存在右方向的Bell片段。這樣產(chǎn)生了二元載體pBINAW5。隨后，將來自于包含延長的GBSSI啟動子、GBSSI反向重復(fù)和延長的GBSSI終止子的載體pBINAW4(參見實(shí)施例2)的Xbal/Kpnl片段克隆到pBINAW5的Xbal和Kpnl位點(diǎn)，得到二元載體pBINAW6。載體pBINAW6a源自載體pBINAW6。將具有兩個Kpnl粘末端的雙鏈寡核苦酸與pBINAW6的Kpnl位點(diǎn)連接。此雙鏈寡核苷酸具有Ascl、Smal和PvuI的限制性位點(diǎn)。寡核苷酸可能有兩個方向一種是AscI位點(diǎn)最靠近RB,而另一種是PvuI位點(diǎn)最靠近RB。選擇第一種方向。通過將SH23-2的Pacl/Ascl基因組DNA片段克隆到Pvul/Ascl消化的pBINAW6a得到pBINAW6a::R3a。SH23-2是細(xì)菌人工染色體(BAC)SH23的亞克隆(Huang等，2005)。用Sau3AI部分消化此BAC，并將7-10kb部分連接到載體pBINPLUS的BamHI位點(diǎn)。使用限制性酶Pacl和Ascl,從pBINPLUS::R3a上切下9-kb片段(截短的SH23-2)并將此片段與pBINAW6a的Pvul和Ascl位點(diǎn)連孑妄。T-DNA包含SH23-2的片段，R3a基因的編碼序列(CDS)位于其中。此CDS(在^f直物轉(zhuǎn)化后)受同樣存在于SH23-2中R3a最初的啟動子和終止子的調(diào)控。從二倍體馬鈴薯克隆SH83-92-488中分離基因組片段SH23-2(H腿g等，2005)。使用輔助質(zhì)粒pRK2013通過三親交配將二元載體pBINAW6a::R3a轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌菌抹AGL-1中(Figurski和Helinski，1979)。馬發(fā)J1W^化和脊^沐的遞脊根據(jù)Visser等(1991)描述的方法，將來自馬鈴薯栽培種'Desiree'、'Aventra'或'Aveka'的體外生長植物的節(jié)間插條通過根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。用根癌農(nóng)桿菌菌才朱AGL-1中pBINAW6a::R3a轉(zhuǎn)化馬鈴薯栽培種'Desiree'。沒有進(jìn)行選擇。在4周后，收獲第一個枝條并連續(xù)收獲枝條約3個月。每個莖外植體收獲了不超過兩個再生體，并使枝條生長于玻璃罐(直徑10cm)或塑料罐(直徑15cm)中的MS30培養(yǎng)基上。每個罐包含5個插條。在插條和罐的內(nèi)壁間留出2至3cm的空間。用于疾病測試的體外試驗(yàn)使體外植抹在24。C和16小時光/8小時黑暗下生長。將帶有3至4片完全發(fā)育葉片的植抹用于體外接種。根據(jù)馬鈴薯基因型，在2至4周后可以對植株進(jìn)行接種。通過吸取10pi液滴的游動孢子懸液(2.5x104孢子/ml)在近軸側(cè)接種每個體外植抹的3個最大葉片(每葉片1個斑點(diǎn))。在無菌條件下進(jìn)行接種物制備和接種。排除接觸罐或培養(yǎng)基的內(nèi)壁或蓋的葉片，因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)這些葉片比相同植物的其它葉片的易感性更高。在與帶有被接種脫離葉片的盤相同的氣候室中孵育接種有體外植林的罐。將表現(xiàn)出易感性相互作用的非轉(zhuǎn)化植株記為S(具有大量孢子形成的擴(kuò)展傷口)或類別SQ(沒有或很少孢子形成的擴(kuò)展傷口)。將表現(xiàn)出抗相互作用的推定轉(zhuǎn)化體記為類別R(無癥狀或局部的HR樣壞死)或類別RQ(拖尾的HR壞死)。將推定轉(zhuǎn)化體移至新培養(yǎng)基中和/或移至溫室的盆栽土中。謬^塊^多成向PCR陽性枝條中加入20ml液體培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基由加有325g/L蔗糖和1.75g/LCCC(氯化氯膽堿，或矮壯素)的KI培養(yǎng)基('knolinducerend，(=塊莖誘導(dǎo))培養(yǎng)基，Duchefa)組成。將盆置于18°C的黑暗生長室中。在2至4周后大多數(shù)枝條上發(fā)育出小塊莖。將小塊莖切下并用碘溶液染色以評估淀粉顆粒中直鏈淀粉的存在。使用顯微鏡檢查淀粉顆粒的染色。，D福為、浙根據(jù)Rogers和Bendich(1988)所述的CTABDNA分離方法從體外枝條中分離DNA。使用引物NPT1和NPT2、trfAl和trfA2、insBl和insB2(序列號l、2、5、6、7和8;Wolters等，1998a)進(jìn)行PCR,以研究轉(zhuǎn)化體中骨架載體DNA的存在。用HindIII消化4|ig的轉(zhuǎn)化體DNA，通過凝膠電泳分離片段，并進(jìn)4亍Southern印跡。使用R3a探針與印跡雜交，以檢驗(yàn)T-DNA插入的數(shù)量。不含邊界的轉(zhuǎn)化體對遂##/{/迷存PCiT-DNA的右邊界和左邊界序列并非源自茄屬植物，而是從pBIN19(pTiT37邊界)中獲得。進(jìn)行PCR以分析這些邊界序列是否存在于轉(zhuǎn)化體中。使用以下引物分析右邊界引物RBcheckl(5'-CCAATATATCCTGTCAGGTA-3，)和引物SHcisl(5，-CATCATCATCCCAAGTACAA-3，)。當(dāng)用載體pBINAW6a::R3a的DNA作為模板時，使用這些引物預(yù)期得到795bp的片段。使用引物GBSSIcisl(5'-CTCTGTCAACAGCCAAATAG-3，)和引物L(fēng)Bcheckl(5'-GGATATATTGTGGTGTAAAC-3，)的組合分析左邊界。當(dāng)用載體pBINAW6a::R3a的DNA作為模板時，使用這些引物預(yù)期得到836bp的片段。使用UniversalGenomeWalkerKit(Clontech)以從轉(zhuǎn)化體獲得T-DNA側(cè)翼序列。用Dral、EcoRV、PvuII、Seal和Stul消化轉(zhuǎn)化體的DNA?；蚪M步移適配子與獲得的片段連接來構(gòu)建酶特異性文庫。使用適配子引物API(5，-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3，)和引物SHGWl(5，-TAAGTTTAATCAGAAGTTGGGTAGGAA-3，)進(jìn)行第一PCR以獲得RB側(cè)翼DNA。使用適配子引物AP2(5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3，)和引物SHGW2(5'誦GTTGGGTAGGAAGCCTGCTCTTGGAAA陽3，)進(jìn)行巢式PCR。使用適配子引物API和引物GBSSIGW1(5，-TTTACTCATCTCCTCCAGGATCCTTCT-3，)進(jìn)行第一PCR以獲得LB側(cè)翼DNA。使用適配子引物AP258和引物GBSSIGW2(5'-ATCTCCTCCAGGATCCTTCTGCTCCTC-3，)進(jìn)^f亍巢式PCR。表格表1.所報(bào)道的野生茄屬物種晚疫病抗性的R基因和數(shù)量性狀座位<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>參考文獻(xiàn)Bene§V,Hostoms坊Z，ArnoldL,Pa￡esV(1993)Ml3andpUCvectorswithnewuniquerestrictionsitesforcloning.Gene130:151-152DeBuckS，DeWildeC，VanMontaguM，DepickerA(2000)T-DNAvectorbackbonesequencesarefrequentlyintegratedintothegenomeoftransgenicplantsobtainedbyAgrobacterium-mediatedtransformation.MolBreed6:459-468ChambersSP，PriorSE,BarstowDA，MintonNP(1988)ThepMTLnic—cloningvectors.I.ImprovedpUCpolylinkerregionstofacilitatetheuseofsonicatedDNAfornucleotidesequencing.Gene68:139-149DaiWL,DengW，CuiWY，ZhaoSY,WangXM(1996)Molecularcloningandsequenceofpotatogranule-boundstarchsynthasegene.ActaBotanicaSinica38:777-784FigurskiDH,HelinskiDR(1979)Replicationofanorigin-containingderivativeofplasmidRK2dependentonaplasmidfunctionprovidedintrans.ProcNatlAcadSciUSA76:1648-1652GielenJ，TerrynN,VillarroelR，VanMontaguM(1999)CompletenucleotidesequenceoftheT-DNAregionoftheplanttumour-inducingAgrobacteriumtumefaciensTiplasmidpTiC58.JExpBot50:1421-1422HeilersigHJB，LoonenA，BergervoetM,WoltersAMA,VisserRGF(2006)Post-tmnscriptionalgenesilencingofGBSSIinpotato:effectsofsizeandsequenceoftheinvertedrepeats.PlantMolBiol60:647-662HuangS,vanderVossenEAG,KuangH,VleeshouwersVGAA，ZhangN,BormTJA,vanEckHJ,BakerB,JacobsenE,VisserRGF(2005)ComparativegenomicsenabledtheisolationoftheR3alateblightresistancegeneinpotato.PlantJ42:251-261.KloostermanB(2006)Transcriptomicanalysisofpotatotuberdevelopmentandtuberqualitytraitsusingmicroarraytechnology.Insearchofcandidategenes.PhDThesis,WageningenUniversity,TheNetherlands.ISBN90-8504-454-5KononovME，BassunerB，GelvinSB(1997)IntegrationofT-DNAbinaryvector'backbone'sequencesintothetobaccogenome:evidenceformultiplecomplexpatternsofintegration.PlantJ11:945-957KurayaY,OhtaS,FukudaM，HieiY，MumiN,HamadaK，UekiJ,ImasekiH，KomariT(2004)Suppressionoftransferofnon-T-DNA'vectorbackbone'sequencesofhigherplantsmediatedbyAgrobacteriumtumefaciens.MolBreed14:309-320RamanathanV,VeluthambiK(1995)Transferofnon-T-DNAportionsoftheAgrobacteriumtumefaciensTiplasmidpTiA6fromtheleftterminusofTL-DNA.PlantMolBiol28:1149-1154RogersSO,BendichAJ(1988)ExtractionofDNAfromplanttissues.In:PlantMolecularBiologyManual(GelvinSB,SchilperoortRA，eds).KluwerAcademicPubl，Dordrecht,pp.A6/1-A6/10TortoT.etal.(2003)ESTminingandfunctionalexpressionassaysidentifyextracellulareffectorproteinsfromPhytophthorta.GenomeRes.13:1675-1685.VanderGmaffE,denDulk-RasA，HooykaasPJJ(1996)DeviatingT-DNAtransferfromAgrobacteriumtumefacienstoplants.PlantMolBiol31:677-681VanderLeijFR，VisserRGF,PonsteinAS,JacobsenE,FeenstraWJ(1991a)Sequenceofthestructuralgeneforgranule-boundstarchsynthaseofpotato(SolanumtuberosumL.)andevidenceforasinglepointdeletionintheamfallele.MolGenGent228:240-248VanderLeijFR,VisserRGF,OosterhavenK，vanderKopDAM,JacobsenE，F(xiàn)eenstraWJ(1991b)Complementationoftheamylose-freestarchmutantofpotato(Solanumtuberosum)bythegeneencodinggranule-boundstarchsynthase.TheorApplGenet82:289-295VanderLeijFR,AbelnECA,Hesseling-MeindersA,FeenstraWJ(1993)AputativeB-glucanasepseudogenebehindthepotatoGBSSgene.PlantMolBiol21:567-571VanderVossenE,SikkemaA,teLintelHekkertB,GrosJ,StevensP，MuskensM，WoutersD,PereiraA,StiekemaW，AllefsS(2003)AnancientRgenefromthewildpotatospeciesSolanumbulbocastanumconfersbroad-spectrumresistancetoPhytophthorainfestansincultivatedpotatoandtomato.PlantJ36:867-882VisserRGF,SomhorstI,KuipersGJ,RuysNJ,FeenstraWJ,JacobsenE(1991a)Inhibitionoftheexpressionofthegeneforgranule-boundstarchsynthaseinpotatobyantisenseconstructs.MolGenGenet225:289-296VisserRGF,StolteA，JacobsenE(1991b)Expressionofachimaericgranule-boundstarchsynthase-GUSgeneintransgenicpotatoplants.PlantMolBiol17:691-699WangK，GenetelloC，VanMontaguM,ZambryskiPC(1987)SequencecontextoftheT-DNAborderrepeatelementdeterminesitsrelativeactivityduringT-DNAtransfertoplantcells.MolGenGent210:338-346WenckA，Czak6M,KanevskiI,MortonL(1997)FrequentcollinearlongtransferofDNAinclusiveofthewholebinaryvectorduringAgrobacterium-mediatedtransformation.PlantMolBiol34:913-922WindelsP，DeBuckS,VanBockstaeleE,DeLooseM，DepickerA(2003)T-DNAintegrationinArabidopsischromosomes.PresenceandorginoffillerDNAsequences.PlantPhysiol133:2061-2068WoltersAMA，JanssenEM,Rozeboom-SchippersMGM,JacobsenE，VisserRGF(1998a)Compositionofendogenousallelescaninfluencethelevelofantisenseinhibitionofgranule-boundsta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