專利名稱：抗真菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于發(fā)酵產(chǎn)生的且可用作抗真菌劑的異噁唑烷酮(isoxazolidinone) 化合物。
背景技術(shù)：
美國第6，017，924號(hào)專利描述了可用作雄激素受體調(diào)節(jié)劑的吡啶并喹啉，吡啶并 吡咯烷并喹啉和相關(guān)化合物。此外，WO 97/49709描述了可用作雄激素受體調(diào)節(jié)劑的非類 固醇氮雜多環(huán)物質(zhì)。人們已經(jīng)知道許多麥角色素(ergochrome)次級(jí)真菌代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和活性，包 括黑麥酮酸在內(nèi)。Von B. Franck & H. Flasch, DieErRochrome (PhysioloRie, IsolierunR, Strucker und Biosynthie)，30Fortschritte der Chemie OrRanischer Naturstoffe 151-206 (1973)，描述了麥角色素AA(黑麥酮酸A)，麥角色素BB(黑麥酮酸B)，麥角色素 AB (黑麥酮酸C)和麥角色素EE (黑麥酮酸D)等的結(jié)構(gòu)和特性。Colin C. Howard & Robert Α. W. Johnstone, FunRal Metabolites. Part IV. Crystal and Molecular Structure of Secalonic Acid A, T. C. S. Perkins Transactions I 1820-1822 (1976)，描述了 黑麥酮 酸 A 的晶體和分子結(jié)構(gòu)。Raymond Anderson 等人，Secalonic Acids D and F AreToxic Metabolites of Aspergillus aculeatus, 42 (2) T. Org. Chem. 352-353 (1977)，將黑麥酮 酸D和F描述為棘孢曲霉(aspergillus aculeatus)的毒性代謝物。Itsuo Kurobane等 人，A New Secalonic Acid, LinkaReBetween Tetrahydroxanthone Units Determined From Deuterium Isotope-C Chemical Shifts, Tet. Lett. 4633-4636 (1978)，對黑麥酮酸 G的結(jié)構(gòu)作出描述，所述黑麥酮酸G從棘殼孢紅根腐菌(pyrenochaetaterrestris)分離而 出。Istuo Kurobane 等人，Biosynthetic RelationshipsAmonR the Secalonic Acids. Isolation of Emodin,Endocrocin andSecalonic Acids from Pyrenochaeta terrestris and Aspergillus aculeatus, 32 (12) T. Antibiot. 1256-1266 (1979)，描述了大黃素，山 扁豆酸和黑麥酮酸A，E和G從棘殼孢紅根腐菌的分離，大黃素，山扁豆酸和黑麥酮酸B， D和F從棘孢曲霉的分離，并對黑麥酮酸之間的生物合成關(guān)系作出說明。A. E. Pohland等 人，Physicochemical Data forSome Selected Mycotoxins,54(11)Pure & App1. Chem. 2219-2284(1982)，對所選真菌毒素的物理化學(xué)數(shù)據(jù)做出描述，包括黑麥酮酸D。Charles L. Barnes 等人，Crystal Structures of Methanol and EthanolSolvates of Secalonic Acid D，29(9) J. Chem. Crystallography 1031-1035 (1999)，對黑麥酮酸 D 的甲醇和乙醇 溶劑化物的晶體結(jié)構(gòu)做出描述。George R. Pettit等人，Isolation and Structure of Ruprechstyril fromRuprechtia tangarana, 66 J. Nat. Prod. 1065-1069 (2003)，描述了 ruprechstyril 從 Ruprechtia tangarana 的分離，并對其結(jié)構(gòu)作出描述。Richard J. Cole & Richard H. Cox, Handbook of Toxic FungalMetabolites，647—661 (Academic Press 1981)，描述了黑麥酮酸A，B，C和D的化學(xué)和毒性數(shù)據(jù)。然而，我們?nèi)孕枰话阌猛镜膹?qiáng)力抗真菌劑，以應(yīng)對與人類和農(nóng)作物真菌感染有 關(guān)的病原體。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及化合物，該化合物選自式I和式II的化合物， 或其在制藥上或農(nóng)業(yè)上可接受的鹽類。在式I和II中，R1是選自由氫和C1-C6烷 基構(gòu)成的組，且R1在一個(gè)特定實(shí)施方案中是氫。這些化合物是強(qiáng)大的抗真菌劑，具有廣譜 活性，并可用于抵制與人類和農(nóng)作物真菌感染有關(guān)的病原體。本發(fā)明的其它方面涉及組合物，該組合物包括本發(fā)明化合物的混合物，制藥和農(nóng) 業(yè)組合物，以及包含本發(fā)明化合物的配制劑。此外，本發(fā)明還涉及以下方面制備本發(fā)明化 合物的方法，治療或預(yù)防使用了本發(fā)明化合物的人和動(dòng)物出現(xiàn)真菌感染的方法，以及控制 使用了本發(fā)明化合物的人，動(dòng)物和植物出現(xiàn)真菌感染的方法。發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明的一方面是提供提純的化合物，該化合物選自于由式I和II的化合物，其 制藥上可接受的鹽類以及其農(nóng)業(yè)上可接受的鹽類構(gòu)成的組。在式I和II中，R1選自由氫和 (^-(；烷基構(gòu)成的組。在特定實(shí)施方案中，R1是氫。 本發(fā)明化合物可從生物標(biāo)本中獲得(如下所述)，可由對來自于生物標(biāo)本的化合 物進(jìn)行化學(xué)改性而產(chǎn)生，或可化學(xué)合成。本發(fā)明化合物可能是天然存在的化合物和化合物 的混合物，或可以是分離和提純的，以提供“提純的”化合物和/或組合物。在本文中使用時(shí)，術(shù)語“提純的”是指按以下形式提供的化合物或組合物，即基本 上不含除了式I和II的所需化合物及其鹽之外的任何其它成分；例如，如果包含式I和II 的化合物及其鹽(其中R1是氫)的混合物的組合物基本上不含除了前述混合物之外的任 何其它真菌成分，則其可被稱為“提純的”組合物。本發(fā)明的另一方面是提供組合物，該組合物包括一種或多種選自式I或II化合物及其制藥或農(nóng)業(yè)上可接受鹽的化合物。在某些實(shí)施方案中，此類組合物可以是提純的。此 夕卜，所述組合物可以是此類化合物的外消旋混合物(在某些實(shí)施方案中)。
本發(fā)明的另一方面是提供藥物組合物，該組合物包括式I或II的一種或多種化合 物或其鹽，和制藥上可接受的載體。式I和II化合物的制藥學(xué)上可接受的鹽包括例如無機(jī)堿鹽，如堿金屬鹽(例如鈉 鹽和鉀鹽)，銨鹽和有機(jī)堿鹽。適合的有機(jī)堿鹽包括胺鹽，如四烷基季銨鹽(如四丁銨和三 甲基十六烷基銨)，三烷基胺鹽(如三乙胺)，二烷基胺鹽(二環(huán)己基胺)，任選取代的芐胺 (如苯基芐胺和對溴芐胺)，乙醇胺，二乙醇胺，N-甲基葡萄糖胺，N-甲基哌啶，吡啶，取代的 吡啶(如可力丁，盧剔啶和4-二甲基氨基吡啶)，以及三(羥甲基)甲胺鹽及氨基酸鹽(如 賴氨酸或精氨酸鹽)。本發(fā)明的另一方面是提供藥物組合物，該組合物包括式I或II的一種或多種化 合物或其制藥上可接受的鹽以及第二種治療劑或其制藥上可接受的鹽的組合。所述第二 種治療劑是選自以下的化合物唑類(azoles)；多烯類；嘌呤或嘧啶核苷酸抑制劑；復(fù)合 碳水化合物抗真菌劑，紐莫康定(pneumocandin)衍生物和棘白菌素(echinocandin)衍生 物；多氧菌素；甘露聚糖抑制劑；殺菌性/滲透性誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)品；延伸因子抑制劑；和免 疫調(diào)節(jié)劑。更尤其是，所述第二種治療劑可選自唑類，如氟康唑，伏立康唑，伊曲康唑，酮康 唑，咪康唑，ER 30346和SCH 56592 ；多烯類，如兩性霉素B，制霉菌素(nystatin)，和脂質(zhì) 體(liposomal)及其脂類形式，如Abelcet ，AmBisome 和Amphocil ；嘌呤或嘧啶核苷酸 抑制劑，例如氟胞嘧啶；復(fù)合碳水化合物抗真菌劑，紐莫康定衍生物或棘白菌素衍生物，如 卡泊芬凈，安麻吩金(enfumafungin)，micofungin及其類似物；多氧菌素，如尼可霉素(如 尼可霉素Z)；和其它甲殼質(zhì)抑制劑；甘露聚糖抑制劑，如predamycin ；殺菌性/滲透性誘導(dǎo) (BPI)的蛋白質(zhì)產(chǎn)品，如XMP. 97和XMP. 127 ；和延伸因子調(diào)節(jié)劑，如糞殼菌素及其類似物。 在某些實(shí)施方案中，所述第二種治療劑是選自伊曲康唑，氟胞嘧啶，氟康唑，兩性霉素B和 卡泊芬凈的化合物。本發(fā)明還有一方面是提供農(nóng)用化學(xué)品組合物，該組合物包含式I或II的一種或多 種化合物或其鹽和農(nóng)業(yè)上可接受的載體。本發(fā)明還有一方面是提供農(nóng)用化學(xué)品組合物，包括式I或II的一種或多種化合物 或其農(nóng)業(yè)上可接受的鹽，以及第二種活性成分。所述第二種活性成分可以選自于除草劑，殺 蟲劑，殺菌劑，殺線蟲劑，殺螺劑，生長調(diào)節(jié)劑，微量營養(yǎng)物，肥料和殺真菌劑構(gòu)成的組。式I或II的化合物和其制藥上或農(nóng)業(yè)上可接受鹽在本文中還稱為“活性成分”，在 與制藥上或農(nóng)業(yè)上可接受載體一起配制成組合物或配制劑時(shí)，將獲得最有效的利用?！敖M合 物” 一詞，如在“藥物組合物”或“農(nóng)用化學(xué)品組合物”中的，意在涵蓋包含一種或多種構(gòu)成 載體的活性成分和惰性成分的產(chǎn)品?！敖M合物”一詞還意在涵蓋因任何兩種或更多種活性成 分和/或惰性成分的結(jié)合，絡(luò)合，凝聚或其它相互作用而直接或間接產(chǎn)生的任何產(chǎn)品；一種 或多種活性成分和/或惰性成分的分離而直接或間接產(chǎn)生的任何產(chǎn)品；以及一種或多種活 性成分和/或惰性成分任何其它類型的反應(yīng)產(chǎn)生的任何產(chǎn)品。藥物和農(nóng)用化學(xué)品組合物包含至少一種在抗真菌方面治療有效量的活性成分。本 文中所用“治療有效量”是指足以產(chǎn)生所需治療效果的活性成分量。例如，化合物的抗真菌 治療有效量，是指足以顯示一種或多種真菌菌株的抗真菌活動(dòng)和/或抑制增長的量。
在藥物組合物中，活性成分的抗真菌治療有效量的范圍可以為大約0. 001毫克每千克患者體重至大約400毫克每千克患者體重。藥物組合物和/或農(nóng)用化學(xué)品組合物可以通過將一種或多種活性成分與載體緊 密混合而制成，并且可選擇該載體的成分以提供所需的介質(zhì)。例如，配制的霜?jiǎng)┗蛳匆嚎赏?過將活性成分混合入適當(dāng)選取的霜?jiǎng)┗蛳匆撼煞种?，以產(chǎn)生約0. 01%至約8%的活性成分 濃度而制成。根據(jù)本發(fā)明的某些方面，藥物組合物和農(nóng)用化學(xué)品組合物可配制成適用于口服， 局部的，非腸道的(包括腹腔內(nèi)(I.P.)，皮下，肌肉內(nèi)和靜脈內(nèi)(I.V.))，經(jīng)鼻和栓劑給藥， 或以吹入給藥。當(dāng)活性成分用作抗真菌劑時(shí)，給藥的任何適用方法均可使用。當(dāng)活性成分用于治 療真菌感染時(shí)，通常采用口服或靜脈給藥。對于口服給藥，一些實(shí)施方案的藥品組合物和農(nóng)用化學(xué)品組合物可以被配制成液 體或固體組合物。液體組合物的制備可以通過將活性成分與制藥上或農(nóng)業(yè)上可接受的液體 載體的結(jié)合進(jìn)行，所述載體如水，二醇，油，酒精和類似物。對于固體組合物，活性成分可以 與制藥上或農(nóng)業(yè)上可接受的固體載體相結(jié)合，所述載體如淀粉，糖，高嶺土，乙基纖維素，碳 酸鈣，碳酸鈉，磷酸鈣，滑石和乳糖。這些固體載體可以任選地與潤滑劑(如硬脂酸鈣)相 結(jié)合，和/或與粘合崩解劑或類似物相結(jié)合。因?yàn)槠瑒┖湍z囊易于給藥，在某些情況下，這 些劑型可以代表最便利的口服給藥形式。單位劑型的組合物也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。對于注射給藥，一些實(shí)施方案的藥物組合物和/或農(nóng)用化學(xué)品組合物可以被配制 成懸浮液，溶液或乳狀液。對于可注射組合物，制藥上或農(nóng)業(yè)上可接受的載體可以是油性載 體或含水載體，如含0.85%氯化鈉的水，或含5%葡萄糖的水。此外，可注射組合物可以包 括配制用劑，如緩沖劑，增溶劑，懸浮劑和/分散劑。緩沖劑，以及諸如鹽水或葡萄糖等添加 齊U，可以被添加進(jìn)去以制成等滲透壓的溶液。對于靜脈點(diǎn)滴給藥，活性成分可以溶解在酒精 /丙二醇或聚乙二醇中?？勺⑸浣M合物可以作為液體組合物，安瓿中的單位劑型，或多次劑 量的容器提供，任選包含額外的防腐劑。做為選擇，提供的活性成分也可以是粉末狀，且可 以在給藥之前在適當(dāng)?shù)囊后w載體中重構(gòu)?！皢挝粍┬汀?一詞在說明書和權(quán)利要求中使用時(shí)，指物理上的離散單位，每單位劑 型包含預(yù)定量的活性成分，目的在于達(dá)到所需的治療效果，與可接受的載體相結(jié)合。該種單 位劑型的例子包括片劑，膠囊，藥丸，粉包，圓片，以安瓿或多次用量容器測量的單位，以及 類似物品。還有，本發(fā)明的另一方面是提供治療或預(yù)防真菌感染的方法，真菌感染可以是系 統(tǒng)性和/或非系統(tǒng)性的，針對哺乳動(dòng)物(包括人和動(dòng)物)而言，其中該方法包括對哺乳動(dòng)物 投放治療有效量的活性成分。這方面的方法可用于治療或預(yù)防菌類感染，如新型隱球菌，白 色念珠菌，白色念珠菌，光滑念珠菌，葡萄牙念珠菌，近平滑念珠菌，克魯斯氏念珠菌，熱帶 念珠菌，酵母菌和熏煙色曲菌。本發(fā)明還有一個(gè)方面是，提供治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物真菌感染的方法，這包括為前 述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的活性成分和第二種治療劑，該第二種治療劑選自于以下一組 化合物唑類；多烯類；嘌呤或嘧啶核苷酸抑制劑；復(fù)合碳水化合物抗真菌劑，紐莫康定衍 生物和棘白菌素衍生物；多氧菌素；甘露聚糖抑制劑；殺菌性/滲透性誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)品；延伸因子抑制劑；和免疫調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明還有一個(gè)方面，是提供控制導(dǎo)致植物致病的真菌類的方法，該方法包括向 需要此種控制的動(dòng)植物施用治療有效量的活性成分。還有一個(gè)方面，本發(fā)明要提供控制導(dǎo)致植物致病的真菌類的方法，該方法包括向 有此需要的動(dòng)植物施用治療有效量的活性成分和第二種活性劑，該第二種活性劑選自除草 齊U，殺蟲劑，殺菌劑，殺線蟲劑，殺螺劑，生長調(diào)節(jié)劑，微量營養(yǎng)物，肥料和殺真菌劑等構(gòu)成的
組。 在本文使用時(shí)，除非另有說明，以下術(shù)語具有下文所示的意義。本文所用“植物” 一詞，意在包括活的植物和植物材料，例如葉子，花，種籽，果實(shí)， 以及從植物中獲得的其它材料。該術(shù)語還包括植物的根，活性成分通過施用到土壤而投放 到所述根處。本文所用“哺乳動(dòng)物” 一詞意在包括人類和溫血?jiǎng)游铮Z養(yǎng)動(dòng)物如貓，狗，牲畜寸。本文所述的化合物，可以通過真菌菌株MF7022和/或MF7023的發(fā)酵，及溶劑萃取 而制成。在一些實(shí)施方案中，通過真菌菌株發(fā)酵和溶劑萃取獲得的化合物，可以進(jìn)一步合成 地改性，以生成本發(fā)明的其它化合物。此外，本發(fā)明的化合物可以合成地制成。真菌菌株MF7022和MF7023已被識(shí)別為赤殼屬類(cosmospora sp.)(肉座菌目)， 其分離自在西班牙馬德里的Mirafloresde la Sierra收集到的苔蘚葉狀體。真菌菌株 MF7022和MF7023已根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2006年9月26日進(jìn)行保藏，菌種保藏于在10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 的 American Type Culture Collection,且指定的編號(hào)分別為ATCC編號(hào)PAT-7894和ATCC編號(hào)PAT-7895。在本文使用時(shí)，真菌菌株的“生物純樣” 一詞指感興趣的真菌菌株的樣品，且并不 是按自然發(fā)現(xiàn)的形式提供的，也就是說，真菌菌株生物上的純樣包括感興趣的真菌菌株，但 基本上缺少真菌菌株，真菌材料和/或其它生物材料。在2 2 °C，在連續(xù)的熒光照射下生長21天后，不同瓊脂培養(yǎng)基中的MF70 2 2和 MF7023菌株菌落顯示出以下形態(tài)特征。對于2%麥芽提取物(Difco )瓊脂，菌落直徑達(dá) 到30-31毫米，菌絲浸入，光滑的菌絲限制在中心；菌落邊界處(margin)均勻，且在邊緣處 顯得透明；菌落顏色為淡黃色到金黃色或黃褐色，反面也是一樣。在玉米粉(Difco )瓊脂 中，菌落直徑達(dá)40-45毫米，菌絲浸入且外觀透明，同時(shí)菌落邊界處為細(xì)密的須毛。在燕麥 片(Difco )瓊脂中，菌落直徑為39-40毫米，菌絲緊貼于中心，柔軟且有剛毛；菌落顏色為 淡黃色到金色，帶白色氣生菌絲，形成不明顯的環(huán)帶(subzonate)，某些區(qū)域則沒有氣生菌 絲；菌落反面為暗金色。分生孢子階段僅可在使用玉米粉瓊脂，在相對較低溫度(16°C )，且在延長的孵化 期(超過6周)后觀察得到。當(dāng)菌絲完全覆蓋瓊脂表面且停止延伸時(shí)，在菌落邊緣處形成 分散的分生孢子座(sporodochia)。分生孢子座的顏色是透明到淡桔色或桃紅狀桔色，直 徑高達(dá)300微米，由一到多個(gè)在瓊脂表面形成的分生孢子梗構(gòu)成。分生孢子梗由表面菌絲 生成的短平行分支組成，使呈流蘇狀分支的產(chǎn)孢細(xì)胞形成稀疏或緊密的排列，主要分支有 膜隔開或沒有隔開，由圓柱到棍棒狀的細(xì)胞構(gòu)成，直徑高達(dá)7. 5微米，分枝2到4次，終止于 產(chǎn)孢細(xì)胞。產(chǎn)孢細(xì)胞是瓶梗產(chǎn)孢的，內(nèi)壁芽生式(enteroblastic)，透明的，長7-15微米，寬2-3微米，頂端呈圓柱和圓錐形，產(chǎn)孢場所通常帶有不明顯的圓環(huán)。分生孢子(conidia)強(qiáng)烈彎曲成半月狀，透明，絕大多數(shù)有3個(gè)隔膜，偶爾帶輕微截去頂端或變平的基細(xì)胞，長 15-20微米，寬4-6微米。分生孢子狀況非常類似于Cosmosporaauranticola的分生孢子 狀態(tài)，這在文獻(xiàn)中被稱為Fusarium Iarvum，真菌通常與介殼蟲類和粉虱有關(guān)(C. Booth,Ihe Genus Fusarium(Commonwealth Mycological Institute,Kew,United Kingdom 1971) ；Amy Y. Rossman等人,Genera of Bionectriaceae,Hypocreaceae andNectriaceae (Hypocreales Ascomycetes)，在 42 Studies in MycoIory Φ (1999))。測定了真菌菌株MF7022 (ATCC 編號(hào) PAT-7894)和 MF7023 (ATCC 編號(hào) PAT-7895) 的核糖體DNA(rDNA)基因序列，以幫助識(shí)別其它真菌，同時(shí)用以干預(yù)菌株與其它真菌的種 系關(guān)系。按照標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)程序，菌株MF7022和MF7023的DNA被提取，并用作PCR 反應(yīng)的樣品。28S rDNA的DNA片段被放大和測序，該片段包含此基因的域Dl和D2。兩 個(gè)菌株的序列是相同的，表明它們是同種的，且可能克隆自相同的種群。獲得的序列用 以就類似的核糖體序列查詢GenBank數(shù)據(jù)庫。取回的最佳匹配，以及觀察到百分比相 似度是Cosmospora flammea(U88103)97 %,鐮刀菌類(NRRL25126，AF228357)96 %,鐮 刀菌類(NRRL26790AF228359)98 %，鐮刀菌類(NRRL26803，AF228360)98 %，和 Fusarium larvarum(NRRL20473,U88107) 100%。持續(xù)表現(xiàn)出高序列相似度的均屬于肉座菌目。結(jié)果證 實(shí)，真菌菌株MF7022和MF7023屬于肉座菌目，且表明這些菌株與赤殼屬類真菌是同種的。發(fā)酵稈序真菌菌株MF7022 (ATCC 編號(hào) PAT-7894)和 MF7023 (ATCC 編號(hào) PAT-7895)，識(shí)別為 赤殼屬類，通常于含水營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，這種培養(yǎng)基包含可同化的碳和氮。例如，培養(yǎng)物 可在浸沒的需氧條件(如搖動(dòng)培養(yǎng)物，浸潤培養(yǎng)物等)下生成。發(fā)酵過程開始和結(jié)束(收 獲)時(shí)，含水培養(yǎng)基的PH值優(yōu)選維持在約6-8。需要的pH值可以通過使用緩沖劑來維持， 所述緩沖劑例如嗎啉代乙磺酸(MES)，嗎啉代丙磺酸(MOPS)和類似物，或通過選擇本身具 緩沖特性的營養(yǎng)材料來維持。營養(yǎng)培養(yǎng)基中碳的適當(dāng)來源包括碳水化合物，如葡萄糖，木糖，半乳糖，甘油，淀 粉，蔗糖，糊精和類似物。可以用到的其它適當(dāng)碳源包括麥芽糖，鼠李糖，蜜三糖，阿拉伯醣， 甘露糖，琥珀酸鈉及類似物。適當(dāng)?shù)牡词墙湍赋樘嵛?，肉汁，蛋白胨，面筋粉，棉籽粉，豆粉和其它蔬菜粗?(部分或全部脫脂)，酪蛋白水解物，豆類水解物，酵母水解物，玉米漿，干酵母，麥芽，羽毛 粉，花生粉，酒糟可溶物及其類似物，以及無機(jī)和有機(jī)氮化合物，例如銨鹽(包括硝酸銨，硫 酸銨，磷酸銨等)，尿素，氨基酸及其類似物。碳和氮源可有利地結(jié)合使用，不一定按其純凈形式使用；原因是較不純的材料也 適合使用，這些材料包含痕量的生長因子，維生素和顯著量的礦物質(zhì)營養(yǎng)物。需要時(shí)，可以 向培養(yǎng)基中添加無機(jī)鹽，例如碳酸鈉或碳酸鈣，磷酸鈉或磷酸鉀，氯化鈉或氯化鉀，碘化鈉 或碘化鉀，鎂鹽，銅鹽，鈷鹽及其類似物。如有必要，尤其當(dāng)培養(yǎng)基泡沫過多時(shí)，可以添加一 種或多種去沫劑，例如液體石蠟，脂肪油，植物油，礦物油或硅酮。浸沒的需氧培養(yǎng)條件，是在大批量生產(chǎn)細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞的典型方法。對于小規(guī)模 的生產(chǎn)，可以采用在燒瓶或瓶子中進(jìn)行搖動(dòng)或表面培養(yǎng)。當(dāng)在大的槽中進(jìn)行生長時(shí)，可能優(yōu) 選的是使用營養(yǎng)體型的生物以在生產(chǎn)槽中接種，以便避免生產(chǎn)過程中的生長遲緩。因此，理想的方法可能是，首先通過制備用在“傾斜的”或皮氏培養(yǎng)皿中生成的孢子或菌絲接種相對 少量的培養(yǎng)基，并培養(yǎng)所述接種的培養(yǎng)基(也稱為“接種培養(yǎng)基”)，從而產(chǎn)生生物的營養(yǎng)接 種體，然后將培養(yǎng)的營養(yǎng)接種體無菌地轉(zhuǎn)移到大的槽中。發(fā)酵培養(yǎng)基(其中產(chǎn)生接種體) 通常進(jìn)行壓煮，以在接種之前對培養(yǎng)基進(jìn)行殺菌消毒。壓煮步驟之前，培養(yǎng)基的PH值通常 調(diào)整到約6-7。 培養(yǎng)基混合物的攪拌和曝氣可以通過多種方式完成。攪拌可以通過以下方式進(jìn) 行，使用螺旋槳或類似機(jī)械攪拌設(shè)備，旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)發(fā)酵器，通過各種泵設(shè)備，或通過使無菌
空氣穿過培養(yǎng)基。發(fā)酵進(jìn)行的條件通常如下，溫度約在20°C到30°C (如約在22°C和25°C )，時(shí)間約 為14-28天，并且參數(shù)可以因發(fā)酵條件及規(guī)模不同而有所不同。進(jìn)行發(fā)酵時(shí)優(yōu)選的培養(yǎng)/生產(chǎn)介質(zhì)包括實(shí)施例中列舉的介質(zhì)?；衔锏碾x析和表征本發(fā)明化合物，也就是式I和II的化合物，其中R1是氫，可作為同分異構(gòu)化合物 的互變混合物，通過用丙酮稀釋和在室溫下混合數(shù)小時(shí)，從任一真菌培養(yǎng)基的液體或固體 發(fā)酵中萃取。然后混合物被過濾，且濾出液被濃縮為主要包含式I和II化合物的水溶液， 其中每個(gè)R1均是氫。其它適宜的萃取溶劑包括四氫呋喃，甲醇和乙醇。甲乙酮或乙酸乙酯 等不溶混溶劑也是適合的。通過對聚苯乙烯_ 二乙烯苯樹脂的吸附/提取，從萃取物中回收來自固體或液體 發(fā)酵的產(chǎn)品。然后對洗出液體進(jìn)一步提純，提純通過使用高速逆流色譜進(jìn)行液_液分配實(shí) 施。然后，使用色譜法對產(chǎn)品進(jìn)一步分離，在某些實(shí)施方案中，色譜法可在反相二氧化硅 (包括C8和C18)基樹脂上進(jìn)行?？梢詫Ξa(chǎn)品化合物進(jìn)行化學(xué)改性，以生成烷基化的化合 物，也就是式I和II的化合物，其中R1是烷基。為從粗發(fā)酵提取物中獲得式I和II的化合物，優(yōu)選的吸附/洗脫是利用聚苯乙 烯-二乙烯苯樹脂，如HP20和SP207 (Mitsubishi)進(jìn)行。將包含式I和II化合物的粗提 取物溶解在丙酮和水的混合物中，PH值調(diào)整為約3，并吸附到樹脂床上。將式I和II的化 合物吸附到這樣的樹脂上有機(jī)溶劑濃度低，水濃度高，并且洗脫是通過使用主要為有機(jī)溶 劑(如乙腈或甲醇)的溶液清洗樹脂進(jìn)行。高速逆流色譜還可用以用于從包含式I和II 化合物的乙酸乙酯萃取物中提純式I和II的化合物。對式I和II化合物最終提純的優(yōu)選方法是高速逆流色譜或反相液相色譜法。高 速逆流色譜的溶劑有乙烷，乙酸乙酯，甲醇和水。對于反相色譜法，固定相可以是C8或C18 鍵合相。優(yōu)選洗脫劑是水和乙腈或甲醇的緩沖混合物。進(jìn)行色譜后，通過吸附到聚合疏水 樹脂(如HP20或SP207)和帶有機(jī)溶劑(如乙腈或甲醇)的洗脫液上，自然產(chǎn)品從非揮發(fā) 性的緩沖成分中分離出來。式I和II的化合物可通過以下方式回收通過真空濃縮，在濃 縮至水溶液后過濾，或通過在除去乙腈或甲醇后采用凍干法。然后，回收的化合物可以進(jìn)一步通過紅外吸收光譜法，核磁共振波譜法和質(zhì)譜法 進(jìn)行表征。接種種子培養(yǎng)物在使用之前，將培養(yǎng)基存放于瓊脂塞上，放在含10%甘油的無菌小瓶里，在-80°C 儲(chǔ)存。通過將四個(gè)瓊脂塞無菌地轉(zhuǎn)移到250毫升的三角瓶中接種所述種子培養(yǎng)物，該燒瓶含60毫升組成如下的種子培養(yǎng)基(單位為克/升)玉米漿粉，2. 5番茄醬，40.0;燕麥粉，10.0 ；葡萄糖，10.0和痕量元素溶液，10毫升/升。痕量元素溶液由以下成分構(gòu)成FeSO4 · 7H20，1. 0 克 / 升;MnSO4 · 4H20,1. 0 克 / 升;CuCl2 · 2H20,0. 25 克 / 升;CaCl2 · 2H20,0. 1 克 / 升;H3BO3. 0. 056 克 / 升；(NH4) 6Mo024 · 4H20，0· 019 克 / 升；ZnSO4 · 7Η20,1. 0 克 / 升;溶解在0. 6Ν HCl 中。種子培養(yǎng)基使用蒸餾水制成。通過添加氫氧化鈉，將PH值調(diào)整到6. 8，將培養(yǎng)基浸 入250毫升三角瓶中，蓋上纖維素塞，然后在121°C壓煮20分鐘。在發(fā)酵燒瓶中培養(yǎng)之前，種子培養(yǎng)物在22°C，在轉(zhuǎn)動(dòng)搖床(220轉(zhuǎn)/分)上培育五天。實(shí)施例1MF7022 的發(fā)酵使用蒸餾水制備生產(chǎn)培養(yǎng)基，并將pH值調(diào)整到6. 5。赤殼屬類(Merck Culture Collection MF7022 (ATCC編號(hào)PAT-7894))的培養(yǎng)物在培養(yǎng)基中在22°C生長20天，該培養(yǎng) 基含麥芽糖(75. 0克)，V8 果汁(200毫升)，大豆粉(1. 0克)，L-脯氨酸(3. 0克)，MES 緩沖劑(16. 2克)，和蒸餾水(800毫升)。收獲發(fā)酵物(1升)后，使用一體積的丙酮進(jìn)行 整個(gè)肉湯的萃取，過濾以除去菌絲體，并濃縮以除去丙酮，得到包含式I和II化合物的混合 物的樣品(以下稱自然產(chǎn)品I或NPI)，作為異構(gòu)體形式的平衡混合物。發(fā)酵液中NPI的滴 定度通常為1.0-1. 2克/升。在對整個(gè)肉湯進(jìn)行丙酮萃取后，通過使用C18 HPLC分析可以 觀察到異構(gòu)體形式的混合物。自然產(chǎn)品I(NPI)的離析包含異構(gòu)體形式混合物的萃取物使用CHP20P(MCI)樹脂(50毫升)進(jìn)行分級(jí)，利用PH值為3的在IOmM磷酸鉀緩沖液中的乙腈梯度進(jìn)行洗脫。收集活性物質(zhì)的富含級(jí)分 (在基于瓊脂的檢驗(yàn)(assay)中通過對白色念珠菌的生長抑制來測量)，并用1 1 1 1 比例的己烷乙酸乙酯甲醇水的洗脫/擠出系統(tǒng)(V。= 200毫升，上方相=移動(dòng)相， 1000轉(zhuǎn)/分，10毫升/分)，通過逆流色譜法(CCC)對一部分此材料進(jìn)行分級(jí)。通過分析 性 HPLC(Waters Symmetry 300，300 A, C18，4. 6x50 毫米，5 微米，0-70 % ACN，在 1 9 ACN IOmM磷酸鉀中，pH值3，2毫升/分，25°C )分析來自CCC分級(jí)的活性級(jí)分，并識(shí)別 出負(fù)責(zé)抗真菌活性的相關(guān)成分的混合物。對此樣品的進(jìn)一步色譜(C18HPLC)分離出這些成 分，但10-20小時(shí)(室溫)的平衡化使得提純的成分返回到原始的異構(gòu)體形式混合物。正如HPLC和匪R所分析的，平衡混合物包含兩個(gè)主要的和兩個(gè)次要的成分。對這些樣品的質(zhì) 譜儀分析表明，這些成分全部具有相同的分子量，與分子式C23H17NO9 —致。結(jié)構(gòu)解析 為說明自然產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)，在_78°C將新制成的醚性(ethereal)重氮甲烷添加至懸 浮在1 1的甲醇乙醚中的NPI的攪拌混合物中。反應(yīng)進(jìn)程由HPLC監(jiān)控。當(dāng)分析表明 成分的起始混合物耗盡時(shí)，添加乙酸(1毫升)以猝滅超量的重氮甲烷，并于真空中濃縮反 應(yīng)。制備C18 HPLC(ffaters Symmerty C18 300人，19x300毫米，7微米)用于從粗反應(yīng)混 合物中分離和提純甲基化成分。正如質(zhì)譜分析所確定的，與起始自然產(chǎn)品相比，每個(gè)甲基化 成分均包含單個(gè)額外的甲基。在上述色譜中，化合物A和B的甲基化類似物共同洗脫。這 些化合物可以從化合物C和D的甲基化類似物中分離出來。化合物A和B的單甲基化類似物是從1 1的二氯甲烷甲醇中結(jié)晶而出，并且 獲得其X射線結(jié)構(gòu)，以確定自然產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)。X射線結(jié)構(gòu)是甲基化化合物A和 1共 晶?；衔顲和D的甲基化類似物通過核磁共振波譜法確定。甲基化產(chǎn)品和未改性自然產(chǎn) 品的混合物的核磁共振分析完全支持由χ射線分析確定的結(jié)構(gòu)。自然產(chǎn)品的核磁共振數(shù)據(jù) 指定到每個(gè)主要和次要的異構(gòu)體，所述異構(gòu)體作為混合物存在于單個(gè)樣品中。相應(yīng)的立體 化學(xué)顯示如下
化合物C (主要)化合物D (次要)化合物A(主要的非對映體(syn))13C NMR(126MHZ, DMSO) δ 25. 3,27. 7,53. 0,54. 8,70. 0,85. 3，101. 1, 106. 5， 108. 5，109. 8，109. 9，118. 7，122. 8，125. 9，130. 7，142. 0，155. 5，159. 5，160. 9，167. 2， 169. 7，179. 8，185. 6 ；1H NMR(499MHZ, DMSO) δ 1. 91 (Μ, 1Η)，2· 13 (Μ, 1Η)，2· 57 (Μ, 1Η)， 2. 82 (Μ, 1Η)，3. 56 (S，3Η)，4. 20 (DT, 1Η)，4. 67 (D, 1H)，4. 70 (D, 1H)，5. 95 (D, 1H)，6. 72 (S, 1H)，7. 34 (Τ, 1H)，7. 65 (D, 1H)，8. 27 (D, 1H)，12. 35 (S, 1H)。
化合物B(次要的非對映體(anti))13C NMR(126MHz, DMS0) δ 23. 8,24. 7,53. 6,54. 7,65. 7,84. 5，100. 6，106. 6，
108.5，109. 9，110. 4，118. 7，122. 9，125. 9，130. 8，142. 0，155. 7，158. 2，158. 8，167. 2， 171. 1，180. 9，185. 5 ；1H NMR (499MHz, DMS0) δ 1. 82 (m, 1H)，1. 95 (m, 1H)，2. 45 (m, 1H)， 2. 74 (m, 1H)，3. 59 (s,3H)，4. 39 (m, 1H)，4. 68 (ob, 1H)，4. 70 (ob, 1H)，5. 97 (ob, 1H)，6. 74 (s, 1H), 7. 40 (t, 1H), 7. 67 (d, 1H) ,8. 32 (d, 1H)，11. 62 (s, 1H)?；衔顲(主要的非對映體(syn))13C NMR(126MHz, DMSO) δ 25. 4,28. 0,52. 9,55. 0,70. 2,85. 5，101. 5，106. 9，
109.2，109. 7，110. 4，118. 7，122. 7，126. 0，132. 2，141. 8，155. 6，156. 9，161. 0，167. 3，
169.5，180. 5，184. 6 ；1H NMR (499MHz, DMSO) δ 1. 97 (m, 1H)，2· 17 (m, 1H)，2· 60 (m, 1H)， 2. 85 (m, 1H)，3. 59 (s,3H)，4. 30 (dt, 1H)，4. 55 (d, 1H)，4. 76 (d, 1H)，6. 01 (d, 1H)，6. 67 (s, 1H), 7. 32 (t, 1H), 7. 66 (d, 1H) ,8. 67 (d, 1H)，11. 47 (s, 1H)。化合物D(次要的非對映體(anti))13C NMR(126MHz, DMSO) δ 24. 0,24. 9,53. 6,54. 9,65. 3,84. 9，100. 8，106. 2， 109. 2，109. 8，110. 9，118. 6，123. 0，126. 0，132. 0，142. 0，155. 5，158. 9，158. 9，167. 2，
170.9，181. 9，185. 9 ；1H NMR (499MHz, DMSO) δ 1. 83 (m, 1H)，1. 97 (m, 1H)，2. 43 (m, 1H)， 2. 73 (m, 1H)，3. 65 (s, 3H)，4. 24 (m, 1H)，4. 62 (d, 1H)，4. 68 (d, 1H)，5. 89 (d, 1H)，6. 72 (s, 1H)， 7. 36 (t, 1H)，7. 70 (d, 1H)，8. 63 (d, 1H)，12. 48 (s, 1H)。ESI-FTMS C23H17NO9 ； [M+H]+exp 452. 0976，calc 452. 0982。UV (乙腈)λ max343 (ε =29，400M_1cm_1)，290 ( ε = 15，IOOM-1CnT1)，265 ( ε = 16，200M_1cm_1)，234 ( ε = 28，800M_1cm_1)。IR(薄膜)3475,1750，1611，1579，1500，1455，1431，1364，1348cm_10[ α ]d38. 0° (c = 0. 2，CH2Cl2)。甲基化化合物A 13C NMR(126MHz, DMSO) δ 24. 0,25. 3，52. 7，54. 8，56. 2，69. 8，87. 0，103. 3，107. 4， 107. 5，109. 4，109.8，119. 1，122. 6，125. 9，130.5，141. 1，155. 5，159. 3，160. 1，167. 3， 169. 8，173. 2，184. 8 ；1H NMR (499MHz, DMSO) δ 1. 87 (m, 1H)，2· 06 (m, 1Η)，2· 83 (m, 1Η)， 2. 83 (m, 1Η)，3. 55 (s, 3H)，3. 88 (s, 3H)，4. 15 (m, 1H)，4. 70 (s, 1H)，5. 92 (d, 1H)，6. 68 (s, 1H)， 7. 36 (t, 1H)，7. 66 (d, 1H)，8. 34 (d, 1H)，14. 13 (s, 1H)。ESI-FTMS C24H19NO9 ；exp 466. 1128，calc 466. 1138。甲基化化合物C 13C NMR(126MHz,DMS0) δ 24. 6,25. 5,53. 0,55. 0,56. 0,70. 0,87. 4，103. 0，107. 7， 108. 3，109. 6，109. 9，119. 1，122. 3，125. 8，131. 8，141. 0，155. 6，156. 6，162. 4，167. 4， 169. 6，173. 1,184. 2 ；1H NMR (499MHz, DMSO) δ 2. 00 (m, 1Η)，2· 17 (m, 1Η)，2· 88(m，2H)， 3. 55 (s，3H)，3. 90 (s,3H)，4. 30 (dt, 1H)，4. 55 (d, 1H)，4. 80 (d, 1H)，5. 97 (d, 1H)，6. 60 (s, 1H)，7. 36 (t, 1H)，7. 70 (d, 1H)，8. 68 (d, 1H)，13. 25 (s, 1H)。ESI-FTMS C24H19NO9 ； [M+H]+exp 466. 1129，calc 466. 1138。體外檢驗(yàn)_敏感件試騎藥物儲(chǔ)備液和稀釋液對于96 孔培養(yǎng)板(有 1-12 列和 A-H 行)，使用 Thermal-LabSystems MULTIDE0P 分 配器向每孔加入100微升適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)培養(yǎng)基(例如RPMI-1640，包含0. 165摩爾濃度的 M0PS+3克/升谷氨酰胺(不含碳酸氫鈉)，或RPMI-1640，包含0. 165摩爾濃度的M0PS+3克 /升谷氨酰胺(不含碳酸氫鈉)并含3. 2% DMS0，或?qū)τ谧罱K濃度為50%漿液的培養(yǎng)板， 2X RPMI-1640，包含0. 33摩爾濃度的M0PS+6克/升谷氨酰胺(不含碳酸氫鈉)并含6. 4% DMS0，或含 3. 2% DMSO 的 Cation Adjusted Muller Hilton Broth (CAMHB))。將臨床實(shí)驗(yàn) 室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)(原稱全國臨床實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS))配方用于計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)溶液 所需的稀釋量。將試驗(yàn)化合物以10毫克/毫升的濃度溶解在DMSO中，并稀釋1 78成為 適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基不含DMSO或含1. 92% DMSO或含5. 12% DMSO0達(dá)到的藥物濃 度是128微克/毫升，DMSO濃度為3. 2%。對于每行的第一個(gè)孔，使用多通道矩陣吸液管，添加100微升化合物庫存液(128 微克/毫升)。使用Perkin Elmer CETUSPK()/PETTETM稀釋劑或TE。M ，對化合物進(jìn)行連續(xù)雙重稀 釋(從每行的第一個(gè)孔取出100微升放入第二個(gè)孔并進(jìn)行混合，從每行的第二個(gè)孔取出100 微升放入第三個(gè)孔并進(jìn)行混合，以次類推)，一直到第11列(第12列是生長對照孔-無藥 物)，并將最后的100微升倒掉，得出的化合物濃度為64-0. 06微克/毫升。對于帶皮膚真 菌的培養(yǎng)板，最后的100微升被放入第二個(gè)板的第一行，并進(jìn)行連續(xù)的雙重稀釋，得出的化 合物濃度為64-0. 00004微克/毫升。兩性霉素B和醋酸卡泊芬凈(CANCIDAS )是對照化 合物，制備為在DMSO中10毫克/毫升的儲(chǔ)備溶液，并在微量滴定板中制備為上述試驗(yàn)化合 物。酵母接種在酵母的微量肉湯稀釋檢驗(yàn)中，通過在沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)進(jìn)行酵母培養(yǎng)，選 擇了微生物假絲酵母類，新型隱球酵母(MY2062)和釀酒酵母(MY2255)，在35-37°C培育 24-48小時(shí)，然后選擇一個(gè)典型的菌落，并將其轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)板上，在相同條件下進(jìn)行 培育。從再生長起，選出3到5個(gè)菌落并懸浮在5毫升無菌鹽水(BBL)中，并使用Dade/ Behring濁度計(jì)進(jìn)行調(diào)整，以與0. 5McFarland標(biāo)物相匹配(優(yōu)選OD為0. 06到0. 12)。這導(dǎo)致濃度為每毫升1-5χ106菌落形成單位(CFU/毫升)。接種體進(jìn)一步稀釋1 50進(jìn)入RPMI-1640中，包含0. 165摩爾濃度的MOPS+3克/升谷氨酰胺(不含碳酸氫鈉)并含3. 2% DMS0(0. 1毫升加入4.9毫升中)，并進(jìn)一步在相同培養(yǎng)基中按1 20稀釋(3.2毫升1 50 稀釋液+60.8毫升1 ^1-1640，包含0. 165摩爾濃度的MOPS+3克/升谷氨酰胺(不含碳酸氫 鈉)并含3. 2% DMSO)。然后，先前使用藥物進(jìn)行滴定的檢驗(yàn)板，按每孔100微升此培養(yǎng)稀釋 液進(jìn)行接種，所述藥物在RPMI-1640中，包含0. 165摩爾濃度的MOPS+3克/升谷氨酰胺(不 含碳酸氫鈉)并含3. 2% DMSO0這導(dǎo)致最終生物體濃度為5x IO2到2. 5xl03CFU/毫升，最終 化合物濃度為32到0. 03微克/毫升。此外，白色念珠菌(MY1055)還用經(jīng)熱滅活(55°C下1 小時(shí))的小鼠血清進(jìn)行了試驗(yàn)，所述血清使用0.22微米GP Express PLUSMiIlipore過濾系 統(tǒng)進(jìn)行兩次過濾。此標(biāo)準(zhǔn)化的懸浮液在小鼠血清中按1 50進(jìn)行稀釋(0. 1毫升加入4. 9 毫升中)，并進(jìn)一步在小鼠血清中按1 20稀釋(3.2毫升1 50稀釋液加入60. 8毫升小 鼠血清)。然后，先前使用藥物進(jìn)行滴定的檢驗(yàn)板，按每孔100微升此培養(yǎng)稀釋液進(jìn)行接種， 所述藥物在2X RPMI-1640中，包含0. 33摩爾濃度的M0PS+6克/升谷氨酰胺(不含碳酸氫 鈉)并含6. 4% DMS0。這導(dǎo)致最終生物體濃度為5xl02到2. 5xl03CFU/毫升，最終化合物濃 度為32到0. 03微克/毫升以及50%的小鼠血清。板在35-37°C進(jìn)行培養(yǎng)，假絲酵母的MIC 在24小時(shí)讀取，新型隱球酵母的MIC在48小時(shí)讀取。不同的細(xì)胞計(jì)數(shù)是對0. 5McFarland 樣品做出的，以驗(yàn)證CFU/mL。1 100的稀釋是使用無菌生理鹽水，加0. 5McFarland (0. 1毫 升+9. 9毫升鹽水)進(jìn)行的。然后進(jìn)行三次10倍稀釋(0. 5毫升+4. 5毫升鹽水)。每種稀 釋劑各取100微升(104，105，106)，涂在沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)板上，然后在35°C培育24-48 小時(shí)。培育后，對菌落計(jì)數(shù)并予以記錄，還進(jìn)行了每種生物的生長和無菌對照。第12列是 生長對照，且不包含藥物。H行未使用生物或藥物進(jìn)行培育，被用作無菌對照。所有化合物的最小抑制濃度(MIC-100)確定為與沒用藥物的生長對照相比，在其 下沒有明顯生長的化合物的最低濃度。生長的最小顯著抑制(MIC-80)表明與沒用藥物的 生長對照相比，對生長抑制80%。對于曲霉屬真菌和皮霉癬菌須毛癬菌，將最小有效濃度 (MEC)(菌絲的形態(tài)用肉眼和顯微鏡均可看到)記錄下來。在24小時(shí)培育時(shí)記錄所有念珠 菌的MIC，在20小時(shí)時(shí)記錄細(xì)菌的MIC，在48小時(shí)時(shí)記錄隱球菌和曲霉屬的MIC，和在96小 時(shí)時(shí)記錄皮霉菌的MIC。評(píng)估自然產(chǎn)品I (如實(shí)施例1中分離的)的抗真菌活性。對以下菌株的自然產(chǎn)品 I的MIC進(jìn)行了觀察^t I態(tài)MIC-100 (MIC-80)(微克 / 毫升)白色念珠菌0. 125( < 0.03)微克/毫升白色念珠菌4 (0. 5)微克/毫升(在50%小鼠血清存在下)光滑念珠菌32(16-32)微克/毫升葡萄牙念珠菌4 (0. 25-0. 5)微克/毫升近平滑念珠菌8-16 (2-4)微克/毫升克魯斯氏念珠菌0. 125-0. 25( < 0. 03)微克/毫升熱帶念珠菌2(1)微克/毫升
釀酒酵母菌32(16)微克/毫升實(shí)施例2
搬· - &應(yīng)咨·Φ隱廳細(xì)■牛將1. 8%沙氏葡萄糖瓊脂(12毫升)在55°C平衡化，接種1-5χ106/毫升的煙曲霉 MF5668孢子，添加到12x8厘米Omnidish且使其固化。將自然產(chǎn)品I (2微升，1-2毫克/毫 升DMS0)的溶液施用于瓊脂表面，板在37°C培育16小時(shí)。觀察到熏煙色曲霉菌的自然產(chǎn)品 I的抑制活性。實(shí)施例3gfe^-FT'g^ (ΤΟΚΑ)- i平寸白個(gè)效力使用的是重20克的DBA/2雌性小鼠(Taconic)。小鼠的此天生菌株對補(bǔ)體成分5 具有先天免疫缺陷。使用了白色念珠菌MY1055 (Merck Culture Collection)，人類臨床病 因分離物，最初從Williamsburg Community Hospital,Williamsburg,VA.，(MCV#7. 270)獲 得。過夜沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)培養(yǎng)物的生長是懸浮在無菌鹽水中，細(xì)胞濃度是通過血球 計(jì)確定的。將白色念珠菌MY1055的細(xì)胞懸液調(diào)整到1. 50x10s細(xì)胞/毫升，調(diào)整是通過在 無菌生理鹽水中稀釋進(jìn)行的。當(dāng)0. 2毫升的此種細(xì)胞懸液靜脈內(nèi)施用于小鼠尾靜脈時(shí)，最 終接種體是3. OxlO4細(xì)胞/小鼠(約一個(gè)14天LD5tl)。在激發(fā)(challenge)后，小鼠在15分鐘內(nèi)接受治療，時(shí)間為總計(jì)兩天。用腹腔內(nèi) (I. P.)方法施加自然產(chǎn)品I，一日兩次，試驗(yàn)劑量為50，25及12. 5毫克/公斤。念珠菌種 類的目標(biāo)器官檢驗(yàn)監(jiān)控在接受激發(fā)后配對腎的每克菌落形成單位(CFU)的數(shù)量(目標(biāo)器官 腎檢驗(yàn)，Τ0ΚΑ)。配對腎使用無菌技術(shù)從實(shí)施安樂死的小鼠(4個(gè)/組)中取出，稱重并放在 無菌的Whirl Pak袋(Fisher Scientific)內(nèi)，該袋含有5毫升無菌鹽水。腎在袋內(nèi)均質(zhì) 化，在鹽水中連續(xù)稀釋，并將等分試樣放在SDA上。板在35°C培育，在48小時(shí)后計(jì)算生物體 的數(shù)目。將接受治療組的腎中的平均IogltlCFU/克與假治療小鼠的腎的此種記錄相比較。對于自然產(chǎn)品I，觀察到從假治療減少的計(jì)數(shù)為50mpk(2.30，2.881og)， 25mpk(2. 11，1. 861og)和 12. 5mpk(l. 00，1. 721og)。
權(quán)利要求
提純的組合物，其包括一種或多種化合物，該化合成物選自式I和II的化合物及其制藥或農(nóng)業(yè)上可接受的鹽其中R1選自氫和C1-C6烷基。FPA00001099100200011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中R1是氫。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中所述組合物是式I和II的天然存在的化合物及其在 制藥上或農(nóng)業(yè)上可接受的鹽的混合物。
4.化合物，其選自式I和II的化合物及其制藥或農(nóng)業(yè)上可接受的鹽 其中R1選自氫和C1-C6烷基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中R1是氫。
6.藥物組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求4的一種或多種化合物，以及制藥上可接受的載體。
7.藥物組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求4的一種或多種化合物與第二種治療劑或該第二 種治療劑的制藥上可接受的鹽的組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，其中所述第二種治療劑是選自以下物質(zhì)的化合物 唑類；多烯類；嘌呤或嘧啶核苷酸抑制劑；復(fù)合碳水化合物抗真菌劑，紐莫康定衍生物和棘 白菌素衍生物；多氧菌素；甘露聚糖抑制劑；殺菌性/滲透性誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)品；延伸因子抑 制劑；和免疫調(diào)節(jié)劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，其中所述第二種治療劑是選自于伊曲康唑，氟胞嘧 啶，氟康唑，兩性霉素B和卡泊芬凈的化合物。
10.農(nóng)用化學(xué)品組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求4的一種或多種化合物，以及農(nóng)業(yè)上可接 受的載體。
11.農(nóng)用化學(xué)品組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求4的一種或多種化合物，以及第二種活性 成分，該第二種活性成分選自于除草劑，殺蟲劑，殺菌劑，殺線蟲劑，殺螺劑，生長調(diào)節(jié)劑，微量營養(yǎng)物，肥料和殺真菌劑。
12.治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物真菌感染的方法，該方法包括對哺乳動(dòng)物施用治療有效量的 根據(jù)權(quán)利要求4的一種或多種化合物。
13.治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物真菌感染的方法，該方法包括對哺乳動(dòng)物施用治療有效量的 根據(jù)權(quán)利要求4的一種或多種化合物，以及第二種治療劑或該第二種治療劑的制藥上可接 受的鹽；其中該第二種治療劑是選自以下物質(zhì)的化合物唑類；多烯類；嘌呤嘧啶核苷酸抑制 劑；紐莫康定衍生物；棘白菌素衍生物；多氧菌素；甘露聚糖抑制劑；殺菌性/滲透性誘導(dǎo) 蛋白質(zhì)產(chǎn)品；延伸因子抑制劑；和免疫調(diào)節(jié)劑。
14.控制植物致病真菌的方法，該方法包括向需要此控制的植物施用治療有效量的權(quán) 利要求4的一種或多種化合物。
15.控制植物致病真菌的方法，該方法包括向需要此控制的植物施用治療有效量的根 據(jù)權(quán)利要求4的一種或多種化合物，以及第二種活性成分，該第二種活性成分選自除草劑， 殺蟲劑，殺菌劑，殺線蟲劑，殺螺劑，生長調(diào)節(jié)劑，微量營養(yǎng)物，肥料和殺真菌劑。
16.以ATCC編號(hào)PAT-7894保藏在American Type CultureCollection 的赤殼屬類(肉 座菌目)的生物學(xué)意義上的純培養(yǎng)物。
17.制備根據(jù)權(quán)利要求2的組合物的方法，包括培養(yǎng)和發(fā)酵赤殼屬類，ATCC編號(hào) PAT-7894的培養(yǎng)物。
18.以ATCC編號(hào)PAT-7895保藏在American Type CultureCollection 的赤殼屬類(肉 座菌目)的生物學(xué)意義上的純培養(yǎng)物。
19.制備權(quán)利要求2的組合物的方法，包括培養(yǎng)和發(fā)酵赤殼屬類，ATCC編號(hào)PAT-7895 的培養(yǎng)物。
全文摘要
新的異噁唑烷酮化合物可用于治療和/或預(yù)防人類和動(dòng)物真菌感染方面，同時(shí)可用于控制上述農(nóng)作物的植物致病真菌。本發(fā)明披露了兩種新的真菌菌株(ATCC編號(hào)PAT-7894和ATCC編號(hào)PAT-7895)，用以制備所述的異噁唑烷酮化合物。
文檔編號(hào)A01N43/80GK101868149SQ200880111783
公開日2010年10月20日 申請日期2008年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月16日
發(fā)明者C·A·帕里什, F·佩萊斯, G·F·比爾斯, G·普拉塔斯, J·科拉多, T·勒默 申請人:默沙東公司;默沙東西班牙股份有限公司;默克弗羅斯特加拿大有限公司