專利名稱：：用于殺死孢子和裝置消毒或滅菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于殺死或滅活微生物孢子、及用于裝置和設(shè)備消毒或滅菌的酶促方法。
背景技術(shù)：
：已知由需氧的芽孢桿菌(Bacilli)、厭氧的梭菌(Clostridia)、選定的八疊球菌(sarcinae)和少數(shù)放線菌(actinomycetes)形成孢子。孢子類似某些植物種子，即它們不進(jìn)行任何代謝反應(yīng)。在這點(diǎn)上，它們尤其適合抵擋嚴(yán)峻的環(huán)境壓力，而且已知在長(zhǎng)時(shí)間暴露于熱、干燥、輻射和毒性化學(xué)品后存活。這些特性使得孢子尤其難以在像會(huì)受到極端條件的不利影響的活組織或與活組織接觸的物體的環(huán)境中一樣被殺死。真菌、病毒和病原性細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在70°C在幾分鐘內(nèi)被滅菌；許多孢子在100°C被滅菌。然而，有些腐生生物的孢子能在沸騰中存活幾小時(shí)。熱是當(dāng)前最常用于確保孢子滅菌的手段。孢子的外殼由角蛋白樣蛋白質(zhì)(其占到孢子總蛋白質(zhì)的多達(dá)80%)制成。正是這種蛋白質(zhì)殼負(fù)責(zé)孢子對(duì)化學(xué)滅菌劑的抵抗力。微生物生命周期的孢子階段以代謝休眠及對(duì)會(huì)在其營(yíng)養(yǎng)階段破壞微生物的環(huán)境因素的抵抗力為特征。細(xì)菌內(nèi)生孢子和真菌孢子的萌發(fā)與代謝升高和對(duì)熱和化學(xué)反應(yīng)物的抵抗力降低有關(guān)。為了使萌發(fā)發(fā)生，孢子必須感到環(huán)境足以支持生長(zhǎng)(vegetation)和生殖。簡(jiǎn)單的α氨基酸可刺激孢子萌發(fā)。EP500387中披露了酶促抗微生物組合物，其包含在存在過(guò)氧化物和商化物的情況中選擇性結(jié)合于并抑制靶微生物生長(zhǎng)的鹵過(guò)氧化物酶，例如髓過(guò)氧化物酶、嗜曙紅細(xì)胞氧化物酶、乳過(guò)氧化酶和氯過(guò)氧化物酶。WO95/27046披露了一種抗微生物組合物，其包含釩氯過(guò)氧化物酶、鹵素離子、和過(guò)氧化氫或過(guò)氧化氫生成劑。WO96/38548披露了一種抗微生物組合物，其包含鹵過(guò)氧化物酶、鹵素離子、過(guò)氧化物生成劑和氨基酸類型。本發(fā)明提供了用于殺死或滅活孢子的改進(jìn)的酶促方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于殺死或滅活微生物孢子的方法，包括使所述孢子接觸鹵過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫源、氯和/或溴離子源、和銨離子源。另一方面，本發(fā)明提供了用于裝置(優(yōu)選醫(yī)療裝置)消毒或滅菌的方法，包括使所述裝置接觸鹵過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫、氯和/或溴離子、和銨離子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述鹵過(guò)氧化物酶是氯過(guò)氧化物酶或溴過(guò)氧化物酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鹵過(guò)氧化物酶是含有釩的鹵過(guò)氧化物酶。發(fā)明詳述新寸氧北_禾口臓新寸氧北勁勿適合于摻入本發(fā)明方法的鹵過(guò)氧化物酶包括氯過(guò)氧化物酶、溴過(guò)氧化物酶和展現(xiàn)氯過(guò)氧化物酶或溴過(guò)氧化物酶活性的化合物。商過(guò)氧化物酶形成一類酶，其能夠在存在過(guò)氧化氫或過(guò)氧化氫生成系統(tǒng)的情況中將鹵化物(Cl-、Br-、I_)氧化成相應(yīng)的次鹵酸。鹵過(guò)氧化物酶依據(jù)它們對(duì)鹵離子的特異性來(lái)分類。氯過(guò)氧化物酶(E.C.1.11.1.10)催化自氯離子形成次氯酸鹽、自溴離子形成次溴酸鹽、和自碘離子形成次碘酸鹽；而溴過(guò)氧化物酶催化自溴離子形成次溴酸鹽和自碘離子形成次碘酸鹽。然而，次碘酸鹽經(jīng)歷自發(fā)歧化(spontaneousdisproportionation)成碘，因此觀察到的產(chǎn)物是碘。這些次鹵酸鹽化合物可隨后與其它化合物起反應(yīng)，形成鹵代化合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的鹵過(guò)氧化物酶是氯過(guò)氧化物酶。已經(jīng)自多種生物體分離了鹵過(guò)氧化物酶哺乳動(dòng)物、海洋動(dòng)物、植物、藻類、地衣、真菌和細(xì)菌。普遍接受的是鹵過(guò)氧化物酶是自然界中負(fù)責(zé)鹵代化合物形成的酶，盡管可涉及其它酶。已經(jīng)自多種不同真菌分離了鹵過(guò)氧化物酶，特別是真菌組暗色絲孢菌類(dematiaceoushyphomycetes),如卡爾黑霄屬(Caldariomyces)(例如煙色卡爾黑霉(C.fumago))、鏈格孢屬(Alternaria)、彎孢屬(Curvularia)(例如疣狀彎孢(C.verruculosa)和不等彎孢(C.inaequalis))、內(nèi)臍蠕孢/德氏霉屬(Drechslera)、細(xì)基格孢屬(Ulocladium)和葡萄孢屬(Botrytis)。已經(jīng)自細(xì)菌分離了鹵過(guò)氧化物酶，如假單胞菌屬(Pseudomonas)例如吡咯菌素假單胞菌(P.pyrrocinia)和鏈霉菌屬(Str印tomyces)例如金黃色鏈霉菌(S.aureofaciens)0在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述鹵過(guò)氧化物酶是自彎孢屬菌種，特別是疣狀彎孢或不等彎孢、如WO95/27046中記載的不等彎孢CBS102.42(例如由WO95/27046圖2的DNA序列編碼的釩鹵過(guò)氧化物酶，都通過(guò)提述來(lái)并入)；或如WO97/04102中記載的疣狀彎孢CBS147.63或疣狀彎孢CBS444.70可得到的釩商過(guò)氧化物酶(即含有釩或釩酸鹽的鹵過(guò)氧化物酶)。優(yōu)選地，所述鹵過(guò)氧化物酶的氨基酸序列與自疣狀彎孢(參見(jiàn)例如WO97/04102中的SEQIDNO2)或不等彎孢(例如由WO95/27046圖2中的DNA序列編碼的成熟氨基酸序列)可得到的鹵過(guò)氧化物酶的氨基酸序列具有至少90%同一性、優(yōu)選95%同一性。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述鹵過(guò)氧化物酶是含有釩的鹵過(guò)氧化物酶；特別是釩氯過(guò)氧化物酶。所述釩氯過(guò)氧化物酶可以是自如WO01/79459中記載的Drechslerahartlebii、如WO01/79458中記載的Dendryphiellasalina、如W001/79461中記載的Phaeotrichoconiscrotalarie、或如WO01/79460中記載的棉絲菌菌種(Geniculosporiumsp.)可得到的。所述釩鹵過(guò)氧化物酶更優(yōu)選是自Drechslerahartlebii(DSM13444)、Dendryphiellasalina(DSM13443)>Phaeotrichoconiscrotalarie(DSM13441)^M1^菌菌種(DSM13442)可得到的。鹵過(guò)氧化物酶的濃度通常在0.Ol-IOOppm酶蛋白質(zhì)、優(yōu)選0.05_50ppm酶蛋白質(zhì)、更優(yōu)選l_40ppm酶蛋白質(zhì)、更優(yōu)選0.l-20ppm酶蛋白質(zhì)、和最優(yōu)選0.5-10ppm酶蛋白質(zhì)的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，鹵過(guò)氧化物酶的濃度通常在5_50ppm酶蛋白質(zhì)、優(yōu)選5_40ppm酶蛋白質(zhì)、更優(yōu)選8-32ppm酶蛋白質(zhì)的范圍內(nèi)。鹵過(guò)氧化物酶活件的測(cè)定可通過(guò)如下進(jìn)行測(cè)定鹵過(guò)氧化物酶活性的一種測(cè)定法混合100μ1鹵過(guò)氧化物酶樣品(約0.2μg/ml)和100μ10.3Μ磷酸鈉ρΗ7緩沖液-0.5Μ溴化鉀-0.008%酚紅，將該溶液添加至10μ10.3%H2O2，并測(cè)量595nm處的吸收，作為時(shí)間的函數(shù)。通過(guò)測(cè)量290nm處吸收的降低(作為時(shí)間的函數(shù))，可進(jìn)行使用單氯雙甲酮(SigmaM4632，ε=20000M"1cm"1,290nm)作為底物的另一種測(cè)定法。該測(cè)定法是在0.IM磷酸鈉或0.IM乙酸鈉、50μM單氯雙甲酮、IOmMKBr/KClUmMH2O2和約1μg/ml鹵過(guò)氧化物酶的水溶液中進(jìn)行的。一個(gè)鹵過(guò)氧化物酶單位(HU)定義為于pH5和30°C每分鐘氯化或溴化1微摩爾單氯雙甲酮。過(guò)氧化氫鹵過(guò)氧化物酶所需要的過(guò)氧化氫可以作為用于原位生成過(guò)氧化氫的過(guò)氧化氫或過(guò)氧化氫前體的水溶液來(lái)提供。在溶解后釋放商過(guò)氧化物酶可利用的過(guò)氧化物的任何固體實(shí)體能充當(dāng)過(guò)氧化氫的來(lái)源。在水或適宜基于水的介質(zhì)中溶解后產(chǎn)生過(guò)氧化氫的化合物包括但不限于金屬過(guò)氧化物、過(guò)碳酸鹽、過(guò)硫酸鹽、過(guò)磷酸鹽、過(guò)氧酸、烴基過(guò)氧化物、?；^(guò)氧化物、過(guò)氧化酯、脲過(guò)氧化物、過(guò)硼酸鹽和過(guò)氧羧酸或其鹽。過(guò)氧化氫的另一種來(lái)源是過(guò)氧化氫生成酶系統(tǒng)，如氧化酶以及該氧化酶的底物。氧化酶和底物的組合的例子包括但不限于氨基酸氧化酶(參見(jiàn)例如US6，248，575)和合適的氨基酸、葡萄糖氧化酶(參見(jiàn)例如WO95/29996)和葡萄糖、乳酸氧化酶和乳酸鹽、半乳糖氧化酶(參見(jiàn)例如WO00/50606)和半乳糖、和醛糖氧化酶(參見(jiàn)例如WO99/31990)和合適的醛糖。通過(guò)研究EC1.1.3._、EC1.2.3._、EC1.4.3._、禾口EC1.5.3._或相似的類(在國(guó)際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)下)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地識(shí)別這樣的氧化酶和底物組合的其它例子?？梢栽诠に囬_(kāi)始或期間添加過(guò)氧化氫或過(guò)氧化氫源，例如通常以與0.OOlmM至25mM的水平、優(yōu)選與0.005mM至5mM的水平、和特別是與0.Ol-ImM過(guò)氧化氫的水平對(duì)應(yīng)的量添加。也可以以與0.ImM至25mM的水平、優(yōu)選與0.5mM至15mM的水平、更優(yōu)選與ImM至IOmM的水平、和最優(yōu)選與2mM至SmM過(guò)氧化氫的水平對(duì)應(yīng)的量使用過(guò)氧化氫。氯或溴離子根據(jù)本發(fā)明，與鹵過(guò)氧化物酶反應(yīng)所需要的氯或溴離子(Cl_或Br_)可以以許多不同方式來(lái)提供，如通過(guò)添加氯化物或溴化物的鹽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述氯化物或溴化物的鹽是氯化鈉(NaCl)、溴化鈉(NaBr)、氯化鉀(KCl)、溴化鉀(KBr)、氯化銨(NH4Cl)或溴化銨(NH4Br)、或其混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述氯或溴離子只限于氯離子(Cl—)。所述氯離子可以通過(guò)將氯化物的鹽添加至水溶液來(lái)提供。所述氯化物的鹽可以是氯化鈉、氯化鉀或氯化銨、或其混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述氯或溴離子只限于溴離子(Br_)。所述溴離子可以通過(guò)將溴化物的鹽添加至水溶液來(lái)提供。所述溴化物的鹽可以是溴化鈉、溴化鉀或溴化銨、或其混合物。氯或溴離子的濃度通常在0.OlmM至IOOOmM的范圍內(nèi)、優(yōu)選在0.05mM至500mM的范圍內(nèi)、更優(yōu)選在0.ImM至IOOmM的范圍內(nèi)、最優(yōu)選在0.ImM至50mM的范圍內(nèi)、和特別是在ImM至25mM的范圍內(nèi)。當(dāng)使用氯和溴兩種離子時(shí)，氯離子的濃度獨(dú)立于溴離子的濃度；反之亦然。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法、組合物和用途包括氯和溴離子；例如通過(guò)使用氯化物鹽和溴化物鹽的混合物來(lái)提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，氯或溴離子的摩爾濃度是銨離子濃度的至少兩倍、優(yōu)選至少四倍、更優(yōu)選至少六倍、最優(yōu)選至少八倍、和特別是至少十倍。銨離子根據(jù)本發(fā)明方法殺死或滅活微生物孢子所需要的銨離子(NH4+)可以以許多不同方式來(lái)提供，如通過(guò)添加銨鹽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述銨鹽是硫酸銨((NH4)2SO4)、碳酸銨((NH4)2C03)、氯化銨(NH4Cl)、溴化銨(NH4Br)、或碘化銨(NH4I)、或其混合物。銨離子的濃度通常在0.OlmM至IOOOmM的范圍內(nèi)、優(yōu)選在0.05mM至500mM的范圍內(nèi)、更優(yōu)選在0.ImM至IOOmM的范圍內(nèi)、最優(yōu)選在0.ImM至50mM的范圍內(nèi)、和特別是在ImM至25mM的范圍內(nèi)。微牛物孢子根據(jù)本發(fā)明用鹵過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫、氯或溴離子、和銨離子殺死或滅活的微生物孢子包括所有種類的孢子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微生物孢子是內(nèi)生孢子，如所有梭菌屬菌種(Clostridiumsp.)孢子、短芽孢桿菌屬菌種(Brevibacillussp.)孢子和芽孢桿菌屬菌種(Bacillussp.)孢子，例如來(lái)自炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、惡臭芽孢桿菌(Bacillusputida)、和短小芽孢桿菌(Bacilluspumila)的孢子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述微生物孢子是外生孢子，如放線菌目(Actinomycetales)孢子，例如來(lái)自放線菌屬菌種(Actinomycessp.)、鏈霉菌屬菌種(Strcptomycessp.)、熱放線菌屬菌種(Thermoactinomycessp·)、糖單胞菌屬菌種(Saccharomonosporasp.)和糖多孢菌屬菌種(Saccharopylosporasp.)的孢子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述微生物孢子是細(xì)菌孢子。細(xì)菌孢子的例子包括但不限于所有梭菌屬菌種孢子和芽孢桿菌屬菌種孢子，如上所述。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述微生物孢子是真菌孢子。真菌孢子的例子包括但不限于分生孢子，如來(lái)自曲霉屬菌種(Aspergillussp.)、和青霉屬菌種(Penicilliumsp.)的孢子。表面活性劑本發(fā)明的方法可包括表面活性劑(作為洗滌劑配制劑的一部分或作為濕潤(rùn)劑)的應(yīng)用。適合于應(yīng)用的表面活性劑可以是非離子的(包括半極性的)、陰離子的、陽(yáng)離子和/或兩性離子的；優(yōu)選所述表面活性劑是陰離子的(如線性烴基苯磺酸酯、α-烯烴磺酸酯、烴基硫酸酯(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸酯、仲烷磺酸酯、α-硫代/磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或肥皂)或非離子的(如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烴基多糖苷、烴基二甲胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烴基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-?；鵑-烴基衍生物(“葡糖酰胺”))、或其混合物。當(dāng)包括在本發(fā)明方法中時(shí)，表面活性劑的濃度通常會(huì)是按重量計(jì)約0.01%至約10%、優(yōu)選約0.05%至約5%、和更優(yōu)選約0.至約1%。方法和用涂在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于殺死或滅活孢子的酶促方法，包括使所述孢子接觸包括鹵過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫、氯和/或溴離子、和銨離子的組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包括鹵過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫、氯離子和銨離子。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于裝置(優(yōu)選醫(yī)療裝置)消毒或滅菌的方法，其包括使所述(醫(yī)療)裝置接觸所述組合物。所述組合物可配制成液體(例如含水的)或干產(chǎn)物配制劑。所述干產(chǎn)物配制劑可隨后再水合以形成在本發(fā)明方法中有用的有活性的液體或半液體配制劑。當(dāng)所述組合物配制成干配制劑時(shí)，組分可以是混合的、安排在離散的層中的或分開(kāi)包裝的。在第二個(gè)方面，本發(fā)明還涵蓋一種組合物，其源自應(yīng)用本發(fā)明的方法。在這種情況中，所述組合物包含商過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫、氯或溴離子、銨離子和微生物孢子；或者包含鹵過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫、氯或溴離子、銨離子和醫(yī)療裝置。本發(fā)明的方法對(duì)于已經(jīng)暴露于孢子(如生物戰(zhàn)爭(zhēng)劑，例如能夠引起炭疽的炭疽芽孢桿菌的孢子)的場(chǎng)所的去污是有用的。在本發(fā)明的語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)“殺死或滅活孢子”意圖指至少99%的孢子不能轉(zhuǎn)化(萌發(fā))成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。優(yōu)選99.9%、更優(yōu)選99.99%、最優(yōu)選99.999%、和特別是99.9999%的孢子不能轉(zhuǎn)化成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“消毒”指根據(jù)美國(guó)食品藥品管理局2000年1月“ContentandFormatofPremarketNotification[510(k)]SubmissionsforLiquidChemicalSterilants/HighLevelDisinfectgrnts，，白勺根據(jù)本發(fā)明的方法可以在0-90°C、優(yōu)選5-80°C、更優(yōu)選10-70°C、甚至更優(yōu)選15-60°C、最優(yōu)選18-50°C、和特別是20_40°C的溫度進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以在30_70°C、優(yōu)選40_60°C的溫度進(jìn)行。本發(fā)明的方法可以采用10分鐘至(至少)4小時(shí)、優(yōu)選15分鐘至(至少)3小時(shí)、更優(yōu)選20分鐘至(至少)2小時(shí)、最優(yōu)選20分鐘至(至少)1小時(shí)、和特別是30分鐘至(至少)1小時(shí)的處理時(shí)間。本發(fā)明的方法適合于殺死或滅活多種環(huán)境中的孢子。本發(fā)明的方法可理想地用于任何環(huán)境中以降低孢子污染，如醫(yī)療保健產(chǎn)業(yè)(例如動(dòng)物醫(yī)院、人類醫(yī)院、動(dòng)物診所、人類診所、療養(yǎng)所、兒童或老年居民的日間護(hù)理設(shè)施等)、食品工業(yè)(例如餐館、食品加工廠、食品貯存場(chǎng)、雜貨店等)、招待產(chǎn)業(yè)(例如旅館、汽車旅館、游樂(lè)勝地、游船等)、教育產(chǎn)業(yè)(例如學(xué)校和大學(xué))，等等。由于本發(fā)明方法利用相對(duì)較低的溫度，它們對(duì)于醫(yī)療保健產(chǎn)業(yè)中所使用的設(shè)備如醫(yī)療裝置(例如干的手術(shù)設(shè)備、麻醉設(shè)備、器皿等)的消毒或滅菌是非常有用的。消毒或滅菌后的設(shè)備會(huì)展現(xiàn)降低的變形和磨損，而且該設(shè)備便于在消毒或滅菌后基本上立即使用。當(dāng)對(duì)復(fù)雜的或熱敏感的醫(yī)療裝置如包含不同材料的超聲換能器和內(nèi)窺鏡進(jìn)行消毒或滅菌時(shí)，這是尤其有利的，因?yàn)檫@些裝置的磨損顯著降低，這導(dǎo)致這些常常是非常昂貴的裝置有更長(zhǎng)的使用壽命，這有效降低了它們的操作成本。實(shí)際上，通過(guò)使用本發(fā)明，可以有效地對(duì)甚至其它非醫(yī)療類型的設(shè)備如重復(fù)使用的衛(wèi)生用品消毒或滅菌。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，醫(yī)療裝置和/或非醫(yī)療類型的設(shè)備的消毒或滅菌在根據(jù)ENISO15883-1的(或如美國(guó)食品藥品管理局2002年2月“ClassIISpecialControlsGuidanceDocument:MedicalWasherandMedicalffasher-Disinfectors；GuidancefortheMedicalDeviceIndustryandFDAReviewStaff”中所記載的)(醫(yī)療)清洗機(jī)-消毒機(jī)中使用本發(fā)明的方法而進(jìn)行。本發(fā)明的方法可理想地用于任何環(huán)境中以降低孢子污染，如一般房屋表面(例如地面、墻、天花板、家具外部等)、特殊設(shè)備表面(例如硬表面、制造設(shè)備、加工設(shè)備等)、紡織品(例如棉、毛、絲、合成纖維織物如聚酯、聚烯烴和丙烯酸酯類、纖維混合物如棉聚酯等)、木材和基于纖維素的系統(tǒng)(例如紙)、土壤、動(dòng)物軀體(例如皮、肉、毛發(fā)、羽等)、食品(例如果實(shí)、植物、堅(jiān)果、肉等)、和水。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法針對(duì)紡織品的殺孢子處理。蠟狀芽孢桿菌組的孢子已經(jīng)被鑒定為紡織品的主要洗滌后污染物。如此，用本發(fā)明的組合物處理紡織品對(duì)于針對(duì)紡織品污染物的殺孢子活性是特別有用的。能用本發(fā)明組合物處理的紡織品的例子包括但不限于個(gè)人項(xiàng)目(例如襯衣、褲子、襪子、內(nèi)衣等)、公共項(xiàng)目(例如毛巾、實(shí)驗(yàn)服、制服、圍裙等)、招待項(xiàng)目(例如毛巾、餐巾、桌布等)。用本發(fā)明組合物對(duì)紡織品的殺孢子處理可包括使紡織品接觸本發(fā)明的組合物。此接觸可以在洗滌紡織品之前發(fā)生?；蛘?，此接觸可以在洗滌紡織品期間發(fā)生以提供殺孢子活性和任選地提供清潔活性以自紡織品消除或減少塵土、污漬等。本發(fā)明組合物所接觸的孢子可以位于任何表面上，包括但不限于例如乳制品、化學(xué)品或藥品加工廠中所使用的工藝設(shè)備、醫(yī)療裝置如內(nèi)窺鏡或其它醫(yī)療器具、實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、洗滌機(jī)、水衛(wèi)生系統(tǒng)、油加工廠、紙漿加工廠、水處理廠、或冷卻塔的表面。本發(fā)明的組合物應(yīng)當(dāng)以有效殺死或滅活所討論表面上的孢子的量使用。通過(guò)將孢子浸沒(méi)在組合物的含水配制劑中(例如洗滌過(guò)程)中，通過(guò)將組合物噴灑到孢子上，通過(guò)借助布將組合物應(yīng)用至孢子，或通過(guò)技術(shù)人員認(rèn)可的任何其它方法，可以使孢子接觸本發(fā)明方法中所使用的組合物。任何將本發(fā)明的組合物應(yīng)用于孢子，導(dǎo)致殺死或滅活所述孢子的方法是可接受的應(yīng)用方法。本發(fā)明的方法對(duì)于已經(jīng)暴露于孢子(例如病原性孢子)(如生物戰(zhàn)爭(zhēng)劑，例如能夠引起炭疽的炭疽芽孢桿菌的孢子)的場(chǎng)所的去污也是有用的。此類場(chǎng)所包括但不限于衣物(如軍服)、車輛(vehicle)內(nèi)部和外部、建筑物內(nèi)部和外部、任何種類的軍事設(shè)施、和任何種類的上文所述環(huán)境。通過(guò)下列實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，它們不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例作為緩沖液和底物使用的化學(xué)品是至少試劑級(jí)的商業(yè)產(chǎn)品。在下列實(shí)施例中，符號(hào)“_”表示“未測(cè)定”。實(shí)施例1孢子牛成自球形芽孢桿菌(Bacillusglobigii)或蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)(蘇云金芽孢桿菌模式株ATCC10792)的新鮮培養(yǎng)物在TryptoseBlodAgarBase(TBAB)板上劃線。將培養(yǎng)物于30°C溫育過(guò)夜。懸浮一滿環(huán)來(lái)自TBAB板的純芽孢桿菌，并將細(xì)胞懸浮在2mL無(wú)菌水中。用100μL細(xì)胞懸浮液每塊板接種2xSG板。2xSG的組成如下16g/LDifco細(xì)菌用營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液、0.5g/LMgS04x7H20、2.Og/LKC1、1.0mL/100mL10%葡萄糖、0.lmL/lOOmLIMCa(NO3)2,0.lmL/lOOmL0.IMMnSO4UOμL/lOOmLO.OlMFeSO4JP1%Difco細(xì)菌用瓊脂。將板于30°C溫育48-72小時(shí)。用相差顯微術(shù)檢查孢子形成。孢子是明亮相的(phase-bright)0當(dāng)孢子形成效率接近100%時(shí)，用水收獲細(xì)胞苔，并通過(guò)強(qiáng)烈旋渦震動(dòng)來(lái)懸浮細(xì)胞。通過(guò)于4°C以6000G離心5-10分鐘來(lái)收集細(xì)胞。用冰冷的水清洗細(xì)胞3次。沉淀物含有營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和孢子。應(yīng)用分級(jí)密度梯度將孢子與營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞分開(kāi)。為每份清洗后的沉淀物準(zhǔn)備一個(gè)裝有30mL43%Urographin的離心管。在Urographin中制備3mL細(xì)胞孢子混合物，使得最終的Urographin濃度為20%。將20%Urographin細(xì)胞/孢子混合物溫和地加載到43%Urographin的頂層上。于室溫以10000G離心30分鐘。溫和地除去上清液。在ImL冰冷的水中懸浮純孢子沉淀物，并轉(zhuǎn)移至微量離心管。于4°C以最大速度離心1-2分鐘，將沉淀物在冰冷的水中再清洗2次。通過(guò)相差顯微術(shù)和血球計(jì)檢查純度和孢子數(shù)/ml。將在水中懸浮的孢子保存于-20"C。實(shí)施例2殺死液體制備物中的芽孢桿菌屬孢子制備下列試劑-DMG緩沖液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，IOOmM,pH用NaOH調(diào)至6.0；-IXIO8個(gè)萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)孢子每mL(萎縮芽孢桿菌孢子SUS-l-8Log.RavenLabs,www.Ravenlabs.com),在MilliQ/K中懸浮；-IXIO8個(gè)蘇云金芽孢桿菌孢子每mL(根據(jù)實(shí)施例1制備)，在MilliQ水中懸??；-50mg/L來(lái)自疣狀彎孢的鹵過(guò)氧化物酶(參見(jiàn)WO97/04102)，在MilliQ水中；-800mM氯化鈉(NaCl)，在MilliQ水中；-IOOmM硫酸銨((NH4)2S04)，在MilliQ水中；-IOmM過(guò)氧化氫(H2O2)，在MilliQ水中；禾口-自在IOOOmL水中溶解的37gLB瓊脂(Merck0283)制備LB板。在管形瓶中混合下列各項(xiàng)IOyL孢子懸浮液，250μLDMG緩沖液，40μLNaCl溶液，40μL(NH4)2SO4溶液，禾口20μL鹵過(guò)氧化物酶溶液。通過(guò)添加40μL過(guò)氧化氫來(lái)起始反應(yīng)。裝有10μL孢子懸浮液和490μLMilliQ水的管形瓶充當(dāng)對(duì)照。將管形瓶于室溫(大約23°C)溫育110分鐘。此后，在MilliQ水中制備稀釋系列，并將來(lái)自稀釋度10°至10_5的100μL(—式兩份)涂布到LB瓊脂板上。將板于33°C溫育48小時(shí)，并記錄每對(duì)一式兩份板的菌落形成單位(CFU)的平均數(shù)(顯示于表1)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表1所示結(jié)果指示本發(fā)明的鹵過(guò)氧化物酶溶液具有清楚且顯著的殺孢子效果。處理后能夠萌發(fā)的孢子的數(shù)目降低了至少5個(gè)對(duì)數(shù)單位。實(shí)施例3殺死不銹鋼表面上的芽孢桿菌屬孢子制備下列試劑-DMG緩沖液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，50mM，ρΗ用NaOH調(diào)至7.0；-200mg/L來(lái)自疣狀彎孢的鹵過(guò)氧化物酶(參見(jiàn)WO97/04102)，在50mMDMG緩沖液中；_400mM氯化鈉(NaCl)，在MilliQ水中；-IOOmM硫酸銨((NH4)2S04)，在MilliQ水中；-IOmM過(guò)氧化氫(H2O2)，在MilliQ水中；-5%硫代硫酸鈉(Na2S2O3)；-裝有5mL溶于水中的Tween80和大約ImL玻璃珠(3mm)的管；禾口-自在IOOOmL水中溶解的37gLB瓊脂(Merck0283)制備LB板。實(shí)驗(yàn)使用每個(gè)裝有IO6個(gè)萎縮芽孢桿菌孢子(RavenLabs產(chǎn)品目錄編號(hào)1-6100ST)的不銹鋼盤(一種處理用一個(gè)盤)。在管形瓶中混合下列組分373.75μLDMG緩沖液，31.25μLNaCl溶液，25μL(NH4)2SO4溶液，禾口20μL鹵過(guò)氧化物酶溶液一個(gè)萎縮芽孢桿菌孢子盤(IO6個(gè)孢子)。通過(guò)添加50μL過(guò)氧化氫來(lái)起始反應(yīng)。裝有孢子盤和500μLDMG緩沖液的管形瓶充當(dāng)對(duì)照。將管形瓶于40°C溫育45分鐘。為了終止反應(yīng)，添加500μL硫代硫酸鈉，并于室溫(大約23°C)溫育15分鐘。然后將每個(gè)盤轉(zhuǎn)移至裝有Tween80和玻璃珠的管，并將管以300rpm搖動(dòng)15分鐘。此后，在Mi11iQ水中制備稀釋系列，并將來(lái)自稀釋度10—1至10_3的500μL涂布到LB瓊脂板(14cm板)上。將來(lái)自100溶液的剩余液體(大約4.9mL)涂布到大LB板(正方形，2OX2Ocm板)上。將板于37°C溫育48小時(shí)，并記錄每個(gè)板上的菌落形成單位(CFU)的平均數(shù)(顯示于表2)。表2稀釋度萎縮芽抱桿菌孢子(板上”CFU)___對(duì)照處理_IO0(4.9tnL)__1000__0__IO'1(500μ)__200__0__IO'2(500μ)__200__0__IO'3(500μ)__100__0_處理后盤上剩下的孢子的λ^,^Zll1，000，000個(gè)孢子/盤0個(gè)孢子/盤_計(jì)算數(shù)_____表2所示結(jié)果指示本發(fā)明的鹵過(guò)氧化物酶溶液具有清洗且顯著的殺孢子效果。處理后能夠萌發(fā)的孢子的數(shù)目降低了6個(gè)對(duì)數(shù)單位。實(shí)施例4殺死表面制備下列試劑-商業(yè)清潔劑(pH7.0)，用水稀釋成指定的工作溶液；-DMG緩沖液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，50mM,pH用NaOH調(diào)至7.0；-200mg/L來(lái)自疣狀彎孢的鹵過(guò)氧化物酶(參見(jiàn)WO97/04102)，在50mMDMG緩沖液中；_400mM氯化鈉(NaCl)，在MilliQ水中；-IOOmM硫酸銨((NH4)2S04)，在MilliQ水中；-IOmM過(guò)氧化氫(H2O2)，在MilliQ水中；-5%硫代硫酸鈉(Na2S2O3)-裝有5mL溶于水中的1%Tween80和大約ImL玻璃珠(3mm)的管；禾口-自在IOOOmL水中溶解的37gLB瓊脂(Merck0283)制備LB板。實(shí)驗(yàn)使用每個(gè)裝有IO6個(gè)萎縮芽孢桿菌孢子(RavenLabs產(chǎn)品目錄編號(hào)1-6100ST)的不銹鋼盤(一種處理用一個(gè)盤)。如表3所示制備三個(gè)管形瓶。通過(guò)添加50μL過(guò)氧化氫來(lái)起始管形瓶1和管形瓶2中的反應(yīng)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>將來(lái)自表3的管形瓶于40°C溫育30分鐘。為了終止反應(yīng)，添加500μL硫代硫酸鈉，并于室溫(大約23°C)溫育15分鐘。然后將每個(gè)盤轉(zhuǎn)移至裝有Tween80和玻璃珠的管，并將管以300rpm搖動(dòng)15分鐘。此后，在MilliQ水中制備稀釋系列，并將來(lái)自稀釋度10°至10_3的500μL涂布到LB瓊脂板(14cm板)上。將板于37°C溫育48小時(shí)，并記錄每個(gè)板上的菌落形成單位(CFU)的平均數(shù)(顯示于表4)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>孢子的計(jì)算數(shù)表4所示結(jié)果指示本發(fā)明的鹵過(guò)氧化物酶溶液具有清洗且顯著的殺孢子效果，這在當(dāng)溶液與商業(yè)清潔劑一起使用時(shí)得到增強(qiáng)。單獨(dú)用鹵過(guò)氧化物酶溶液處理后能夠萌發(fā)的孢子的數(shù)目降低了4個(gè)對(duì)數(shù)單位。若溶液與商業(yè)清潔劑一起使用，能夠萌發(fā)的孢子的數(shù)目降低了4-5個(gè)對(duì)數(shù)單位。實(shí)施例5用氯化物、溴化物和銨離子的組合殺死孢子制備下列試劑-DMG緩沖液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，IOOmM,pH用NaOH調(diào)至7.0；-IXIO9個(gè)萎縮芽孢桿菌孢子每mL(萎縮芽孢桿菌孢子SUS-1_8Log.RavenLabs,www.Ravenlabs.com)；-40mg/L來(lái)自疣狀彎孢的鹵過(guò)氧化物酶(參見(jiàn)WO97/04102)，在MilliQ水中；-500mM溴化鈉(NaBr)，在MilliQ水中；-IOOOmM氯化鈉(NaCl)，在MilliQ水中；_500mM氯化銨(NH4Cl)，在MilliQ水中-IOmM過(guò)氧化氫(H2O2)，在MilliQ水中；-5%(w/v)硫代硫酸鈉(Na2S2O3)，在MilliQ水中；禾口-自在IOOOmL水中溶解的37gLB瓊脂(Merck0283)制備LB板。在管形瓶中根據(jù)表5混合試劑。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>通過(guò)添加過(guò)氧化氫來(lái)起始反應(yīng)。裝有10μL孢子懸浮液和490μLMilliQ水的管形瓶充當(dāng)對(duì)照。將管形瓶于40°C溫育30分鐘。通過(guò)添加500μL硫代硫酸鈉來(lái)淬滅反應(yīng)，這容許反應(yīng)15分鐘。此后，在MilliQ水中制備稀釋系列，并將來(lái)自稀釋度10°至10_5的100μL(—式兩份)涂布到LB瓊脂板上。將板于33°C溫育48小時(shí)，并記錄每套板上的菌落形成單位每板(CFU/板)的平均數(shù)(顯示于表6)。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表6所示結(jié)果指示向鹵過(guò)氧化物酶/氯化物/銨溶液添加溴化物將殺孢子效果增強(qiáng)至少1個(gè)對(duì)數(shù)單位。處理后能夠萌發(fā)的孢子的數(shù)目比只用氯化物/銨/鹵過(guò)氧化物酶溶液處理時(shí)多降低了至少1個(gè)對(duì)數(shù)單位。實(shí)施例6麻酬列白·/氯釘魏荊包_腳子制備下列試劑-DMG緩沖液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，IOOmM,pH用NaOH調(diào)至7.0；-IXIO9個(gè)萎縮芽孢桿菌孢子每mL(萎縮芽孢桿菌孢子SUS-1_8Log.RavenLabs,www.Ravenlabs.com)；_250mg/L來(lái)自疣狀彎孢的鹵過(guò)氧化物酶(參見(jiàn)WO97/04102)，在MilliQ水中；-50mM溴化鈉(NaBr)，在MilliQ水中；_200mM氯化鈉(NaCl)，在MilliQ水中；_200mM氯化銨(NH4Cl)，在MilliQ水中；-IOmM過(guò)氧化氫(H2O2)，在MilliQ水中；-5%(w/v)硫代硫酸鈉(Na2S2O3),在MilliQ水中；禾口-自在IOOOmL水中溶解的37gLB瓊脂(Merck0283)制備LB板。在管形瓶中根據(jù)表7混合試劑。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>通過(guò)添加過(guò)氧化氫來(lái)起始反應(yīng)。裝有10μL孢子懸浮液和490μLMilliQ水的管形瓶充當(dāng)對(duì)照。將管形瓶于22°C溫育30分鐘。然后通過(guò)添加500μL硫代硫酸鈉來(lái)淬滅反應(yīng)，這容許反應(yīng)15分鐘。此后，在MilliQ水中制備稀釋系列，并將來(lái)自稀釋度10°至10_5的100μL(—式兩份)涂到LB瓊脂板上。將板于33°C溫育48小時(shí)，并記錄每套板上的菌落形成單位每板(CFU/板)的平均數(shù)(顯示于表8)。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>所示結(jié)果指示殺生物效果或多或少地獨(dú)立于溴化物濃度，但是傾向于低溴化物/氯化物比例具有略微更好的殺死效果。實(shí)施例7殺死處于多種DH倌的液體制備物中的芽孢桿菌屬孢子制備下列試劑-磷酸鹽緩沖液IOOmM,具有下列pH值pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.4和pH8.0；-BrittonRobinson緩沖液lOOmM，pH8.5；-1XIO9個(gè)萎縮芽孢桿菌孢子每mL(萎縮芽孢桿菌孢子SUS_1_8Log.RavenLabs,www.Ravenlabs.com)；_250mg/L來(lái)自疣狀彎孢的鹵過(guò)氧化物酶(參見(jiàn)WO97/04102)，在MilliQ水中；-200mM氯化鈉(NaCl)，在MilliQ水中；-50mM溴化鈉(NaBr)，在MilliQ水中；_200mM氯化銨(NH4Cl)，在MilliQ水中；-IOmM過(guò)氧化氫(H2O2)，在MilliQ水中；禾口-自在IOOOmL水中溶解的37gLB瓊脂(Merck0283)制備LB板。在管形瓶中根據(jù)表9混合試劑。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>通過(guò)添加過(guò)氧化氫來(lái)起始反應(yīng)。裝有10μL孢子懸浮液和490μLMilliQ水的管形瓶充當(dāng)對(duì)照。將管形瓶于室溫(大約22°C)、于40°C或于50°C溫育30分鐘。然后通過(guò)添加500μL硫代硫酸鈉來(lái)淬滅反應(yīng)，這容許反應(yīng)10分鐘。此后，在MilliQ水中制備稀釋系列，并將來(lái)自稀釋度10°至10_5的100μL(—式兩份)涂布到LB瓊脂板上。將板于33°C溫育48小時(shí)，并記錄每對(duì)一式兩份板的菌落形成單位(CFU)的平均數(shù)(顯示于下文表10-12)。表10溫育溫度=22°C。用鹵過(guò)氧化物酶/氯化物/銨溶液處理的孢子在每個(gè)稀釋度的平均CFU。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表11溫育溫度=40°C。用鹵過(guò)氧化物酶/氯化物/銨溶液處理的孢子在每個(gè)稀釋度的平均CFU。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表12溫育溫度=50°C。用鹵過(guò)氧化物酶/氯化物/銨溶液處理的孢子在每個(gè)稀釋度的平均CFU。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>結(jié)果匯總于下文表13。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表13所示結(jié)果指示鹵過(guò)氧化物酶/氯化物/溴化物/銨溶液具有清洗且顯著的殺孢子效果。在所有3個(gè)測(cè)試溫度，該效果在pH范圍6.5-7.4中處于其最大值。實(shí)施例8在不同H2C^濃度殺死孢子制備下列試劑-DMG緩沖液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，IOOmM,pH用NaOH調(diào)至7.0；-1XIO9個(gè)萎縮芽孢桿菌孢子每mL(萎縮芽孢桿菌孢子SUS_1_8Log.RavenLabs,www.Ravenlabs.com)；_250mg/L來(lái)自疣狀彎孢的鹵過(guò)氧化物酶(參見(jiàn)WO97/04102)，在MilliQ水中；-50mM溴化鈉(NaBr)，在MilliQ水中；-200mM氯化鈉(NaCl)，在MilliQ水中；-200mM氯化銨(NH4Cl)，在MilliQ水中-25mM過(guò)氧化氫(H2O2)，在MilliQ水中；-1%(w/v)硫代硫酸鈉(Na2S2O3)，在MilliQ水中；禾口-自在IOOOmL水中溶解的37gLB瓊脂(Merck0283)制備LB板。在管形瓶中根據(jù)表14混合試劑。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>通過(guò)添加過(guò)氧化氫來(lái)起始反應(yīng)。裝有10iiL孢子懸浮液和490uLMilliQ水的管形瓶充當(dāng)對(duì)照。將管形瓶于室溫(大約23°C)溫育30分鐘。通過(guò)添加500PL硫代硫酸鈉來(lái)淬滅反應(yīng)，這容許于室溫反應(yīng)10分鐘。此后，在MilliQ水中制備稀釋系列，并將來(lái)自稀釋度10°至10_5的lOOiiL(—式兩份)涂布到LB瓊脂板上。將板于33°C溫育48小時(shí)，并記錄每對(duì)一式兩份板上的菌落形成單位每板(CFU/板)的平均數(shù)(顯示于表15)。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表15的結(jié)果顯示了用2_5mMH2O2實(shí)現(xiàn)了最高殺死效果，指示這是這些實(shí)驗(yàn)條件下的最佳過(guò)氧化氫濃度。范圍ImM-IOmM中的所有濃度都給出可接受的去污性能。實(shí)施例9以不同比例的氯化物/溴化物/銨恒定的鹵過(guò)氧化物酶濃度殺死孢子制備下列試劑-DMG緩沖液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，IOOmM,pH用NaOH調(diào)至7.0；-1XIO9個(gè)萎縮芽孢桿菌孢子每mL(萎縮芽孢桿菌孢子SUS_1_8Log.RavenLabs,www.Ravenlabs.com)；_250mg/L來(lái)自疣狀彎孢的鹵過(guò)氧化物酶(參見(jiàn)WO97/04102)，在MilliQ水中；-50mM溴化鈉(NaBr)，在MilliQ水中；_200mM氯化鈉(NaCl)，在MilliQ水中；-500mM氯化鈉(NaCl)，在MilliQ水中；_200mM氯化銨(NH4Cl)，在MilliQ水中；-20mM硫酸銨((NH4)2S04)，在MilliQ水中；-IOOmM硫酸銨((NH4)2S04)，在MilliQ水中；-25mM過(guò)氧化氫(H2O2)，在MilliQ水中；-1%(w/v)硫代硫酸鈉(Na2S2O3)，在MilliQ水中；禾口-自在IOOOmL水中溶解的37gLB瓊脂(Merck0283)制備LB板。遵循前述實(shí)施例的方法和原理，使用上述溶液制備500μL反應(yīng)混合物。在裝有下列各項(xiàng)的管形瓶中進(jìn)行孢子處理-OmM/O.5mM/lmM/5mM溴化物(Br)；-0mM/25mM/50mM/66.7mM/100mM/150mM氯化物(CD；禾口-OmM/O.lmM/lmM/5mM/10mM/16.7mM/25mM/50mM/100mM銨(NH4+)的各種組合；禾口_8ppm鹵過(guò)氧化物酶；-2mMH2O2；-2XIO7個(gè)孢子；-IOmMDMG緩沖液；禾口-MilliQ水，加至500μL通過(guò)添加過(guò)氧化氫來(lái)起始反應(yīng)。裝有10μL孢子懸浮液和490μLMilliQ水的管形瓶充當(dāng)對(duì)照。將管形瓶于室溫(大約23°C)溫育30分鐘。通過(guò)添加500μL硫代硫酸鈉來(lái)淬滅反應(yīng)，這容許于室溫反應(yīng)10分鐘。此后，在MilliQ水中制備稀釋系列，并將來(lái)自稀釋度10°至10_5的lOOiiL(—式兩份)涂布到LB瓊脂板上。將板于33°C溫育48小時(shí)，并記錄每套板上的菌落形成單位每板(CFU/板)的平均數(shù)。使用CFU/mL值，以對(duì)數(shù)單位計(jì)算孢子殺死，并將結(jié)果顯示于表16。表16以對(duì)數(shù)單位計(jì)的孢子殺死<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>氯化物/溴化物/銨的比例影響性能；一般而言，溴化物/銨摩爾比1/10給出最高殺死效果。氯化物濃度越低，達(dá)到滿意的孢子殺死效果所需要的溴化物和銨濃度越低。用下列各項(xiàng)獲得了最佳孢子殺死性能[氯化物]彡25mM；0.ImM^[溴化物]彡ImM；禾口5mM彡[銨]彡25mM。實(shí)施例10以不同比例的氯化物/溴化物/銨和以不同的鹵過(guò)氧化物酶/過(guò)氧化氫濃度殺死孢子制備下列試劑-DMG緩沖液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，IOOmM,pH用NaOH調(diào)至7.O；-1XIO9個(gè)萎縮芽孢桿菌孢子每mL(萎縮芽孢桿菌孢子SUS_1_8Log.RavenLabs,www.Ravenlabs.com)；_250mg/L來(lái)自疣狀彎孢的鹵過(guò)氧化物酶(參見(jiàn)W097/04102)，在MilliQ水中；-50mM溴化鈉(NaBr)，在MilliQ水中；_500mM氯化鈉(NaCl)，在MilliQ水中；-200mM氯化銨(NH4C1)，在MilliQ水中；-25mM過(guò)氧化氫(H202)，在MilliQ水中；-1%(w/v)硫代硫酸鈉(Na2S203)，在MilliQ水中；禾口-自在1000mL水中溶解的37gLB瓊脂(Merck0283)制備LB板。遵循前述實(shí)施例的方法和原理，使用上述溶液制備500uL反應(yīng)混合物。在管形瓶中進(jìn)行反應(yīng)。各組分的終濃度顯示于表17。表17<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>鹵過(guò)氧化物酶/過(guò)氧化氫的比例與實(shí)施例6中發(fā)現(xiàn)為最佳的相同。通過(guò)添加過(guò)氧化氫來(lái)起始反應(yīng)。裝有10μL孢子懸浮液和490μLMilliQ水的管形瓶充當(dāng)對(duì)照。將管形瓶于60°C溫育30分鐘。通過(guò)添加500μL硫代硫酸鈉來(lái)淬滅反應(yīng)，這容許于室溫反應(yīng)10分鐘。此后，在MilliQ水中制備稀釋系列，并將來(lái)自稀釋度10°至IO5的100μL(—式兩份)涂布到LB瓊脂板上。將板于33°C溫育48小時(shí)，并記錄每套板上的菌落形成單位每板(CFU/板)的平均數(shù)。使用CFU/mL值，以對(duì)數(shù)單位計(jì)算孢子殺死，并將結(jié)果顯示于表18。表18<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>用下列各項(xiàng)獲得了最佳孢子殺死性能[鹵過(guò)氧化物酶]=32ppm；5mM彡[氯化物]彡20mM；OmM彡[溴化物]彡2mM；禾口2.5mM彡[銨]彡5mM。實(shí)施例11盲菌孢子牛成在MEA板上培養(yǎng)須毛癬菌(Trichophytonmentagrophytes)ATCC9233，而在MEA斜面上培養(yǎng)黑曲霉(Aspergillusniger)ATCC9642。如下用去離子水制備MEA培養(yǎng)基30g/L麥芽提取物、3g/L大豆蛋白胨(Sojapeptone)(胃蛋白酶消化物或大豆粉)、瓊脂15g/L，pH未調(diào)節(jié)。在MEA皮氏皿的中心接種須毛癬菌，并于30°C溫育10_12天。然后將板用含0.02%Tween80的M9緩沖液覆滿，并通過(guò)用Drigalski刮刀溫和地操作菌絲體團(tuán)/叢(mycelialmatt)將孢子制成懸浮液。然后將細(xì)胞懸浮液經(jīng)Miracloth過(guò)濾以除去菌絲，并隨后通過(guò)在血球計(jì)中計(jì)數(shù)來(lái)確定孢子數(shù)。在實(shí)驗(yàn)中使用此孢子懸浮液。用M9+0.02%Tween收獲旺盛地形成孢子的黑曲霉斜面，并將含有孢子的液體經(jīng)無(wú)菌Miracloth過(guò)濾以除去菌絲。M9的組成如下在MilliQ水中溶解8.77g/L磷酸氫二鈉(Na2HP0，2H20)、3g/L磷酸二氫鉀(KH2P04)、4g/L氯化鈉(NaCl)、0.2g/L硫酸鎂(MgS04，7H20)。隨后通過(guò)在血球計(jì)中計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)定孢子數(shù)，并將孢子懸浮液調(diào)至大約1X107個(gè)孢子/mL。在實(shí)施例中使用此孢子懸浮液。孢子懸浮液于4°C最多保存4天。實(shí)施例12m^Mmm^mMmm^mmMmm^m制備下列試劑-黑曲霉ATCC9642孢子懸浮液，1X107個(gè)孢子/mL；-須毛癬菌ATCC9233孢子懸浮液，1X107個(gè)孢子/mL；-DMG緩沖液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，100mM,pH用NaOH調(diào)至7.0；-100mg/L來(lái)自疣狀彎孢的鹵過(guò)氧化物酶(參見(jiàn)W097/04102)，在MilliQ水中；-50mM溴化鈉(NaBr)，在MilliQ水中；-200mM氯化鈉(NaCl)，在MilliQ水中；-200mM氯化銨(NH4C1)，在MilliQ水中；-10mM過(guò)碳酸鈉(2Na2C033(H202))，在MilliQ水中；禾口-如下制備YPD板在1000mL水中溶解10g酵母提取物、20g蛋白胨、20g右旋糖、20g瓊脂，pH未調(diào)節(jié)。在管形瓶中根據(jù)表19混合試劑。所使用的孢子都是新鮮制備的(即沒(méi)有于4°C貯藏任何時(shí)間段)。表19SSj須毛_菌黑曲霉—__JiL__mM,終__μι__mM,終_NaCl__47^__19__4X5__19_NaBr__5__05__5__0.5_NH4Cl__15__6__15__6_DMG緩沖液__125__25__125__25_鹵過(guò)氧化物醉__40__8ppm__40__8ppm_過(guò)碳酸納__3^5__O1^J__315__0.67_孢子懸浮液__50__IxlO^__50__IxlO6_HsO__184__-__184__-終體積I500I-I500丨-在1.8mLNUNC冷凍管中混合除過(guò)碳酸鹽以外的所有試劑，添加孢子，并通過(guò)添加過(guò)碳酸鹽溶液來(lái)起始實(shí)驗(yàn)。將管于40°C(在熱塊中)溫育30分鐘。30分鐘溫育后，向每個(gè)管添加500μL無(wú)菌水，并制備10倍稀釋系列。將來(lái)自未稀釋樣品的200μL和來(lái)自每種稀釋度的100μL涂布到Y(jié)PD板上。將板于30°C溫育2-4天，并計(jì)算CFU/mL。將50μL孢子懸浮液添加至450μL無(wú)菌水，隨后制備稀釋系列，涂布100μL/板并確定CFU/mL，充當(dāng)生長(zhǎng)對(duì)照。曲霉屬孢子是疏水性的，而且難以獲得孢子的均質(zhì)懸浮液。表20顯示了所記錄的CFU/板和計(jì)算的CFU/ml，以及孢子殺死(對(duì)數(shù)單位)。表20<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>毛癬菌屬孢子被完全滅活，而對(duì)曲霉屬孢子的處理導(dǎo)致可存活孢子數(shù)降低3個(gè)對(duì)數(shù)單位。實(shí)施例13對(duì)貯藏的真菌孢子的真菌孢子殺死制備下列試劑-黑曲霉ATCC9642孢子懸浮液，1XIO7個(gè)孢子/mL，于4°C貯藏2天；-須毛癬菌ATCC9233孢子懸浮液，1XIO7個(gè)孢子/mL，于4°C貯藏2天；-DMG緩沖液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，IOOmM,pH用NaOH調(diào)至7.0；-100mg/L來(lái)自疣狀彎孢的鹵過(guò)氧化物酶(參見(jiàn)WO97/04102)，在MilliQ水中；-50mM溴化鈉(NaBr)，在MilliQ水中；-200mM氯化鈉(NaCl)，在MilliQ水中；-200mM氯化銨(NH4Cl)，在MilliQ水中；-IOmM過(guò)碳酸鈉(2Na2C03·3(H2O2))，在MilliQ水中；禾口-如下制備YPD板在IOOOmL水中溶解IOg酵母提取物、20g蛋白胨、20g右旋糖、20g瓊脂，pH未調(diào)節(jié)。在管形瓶中根據(jù)表21混合試劑。表21須毛痺菌黑，審___μι__mM,終__yJL__mM,終_NaCl__14Z5__19__1415__19_NaBr__15__05__15__0.5NH4Cl145I6145I6DMG緩沖液__375__25__375__25_^__120__8ppm__120__8ppm過(guò)碳酸納__m05__067__1005__0.67_^rf__150__IxlO6__150__IxlO6_H2O__552__-__552__-終體積丨1500丨-丨1500I-在1.8mLNUNC冷凍管中混合除過(guò)碳酸鹽以外的所有成分，添加孢子，并通過(guò)添加過(guò)碳酸鹽溶液來(lái)起始實(shí)驗(yàn)。將管于40°C(在熱塊中)溫育30分鐘。30分鐘溫育后，制備10倍稀釋系列。將來(lái)自每個(gè)稀釋度的333μL涂布到Y(jié)PD板上。將板于30°C溫育2_4天，并計(jì)算CFU/mL0將50μL孢子懸浮液添加至450μL無(wú)菌水，隨后制備稀釋系列，涂布100μL/板并確定CFU/mL，充當(dāng)生長(zhǎng)對(duì)照。表22顯示了所記錄的CFU/板和計(jì)算的CFU/ml，以及孢子殺死(對(duì)數(shù)單位)。表22<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>對(duì)毛癬菌和曲霉孢子二者的處理都導(dǎo)致可存活孢子數(shù)至少5個(gè)對(duì)數(shù)單位的降低。實(shí)施例14^mmmm^卜.的枯草芽孢桿菌包子制備下列試劑-DMG緩沖液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，50mM,pH用NaOH調(diào)至7.0；-磷酸鹽緩沖液，IOOmM,pH用NaOH調(diào)至7.0；-200mg/L來(lái)自疣狀彎孢的鹵過(guò)氧化物酶(參見(jiàn)WO97/04102)，在50mMDMG緩沖液中；-400mM氯化鈉(NaCl)，在MilliQ水中；_200mM氯化銨(NH4Cl)，在MilliQ水中；-40mM過(guò)氧化氫(H2O2)，在MilliQ水中；-10%硫代硫酸鈉(Na2S2O3)；-合成硬水，40°dH；和-商業(yè)非離子表面活性劑的200x稀釋液。其它材料-裝有5mL溶于水中的1%Tween80和大約ImL玻璃珠(3mm直徑)的管；-自在IOOOmL水中溶解的37gLB瓊脂(Merck0283)制備LB板；-Nunc冷凍管；-可調(diào)式加熱塊；和-實(shí)驗(yàn)使用以IO6個(gè)枯草芽孢桿菌ATCC19659孢子(PresqueIsleCultures，產(chǎn)品目錄編號(hào)SP-BS)涂覆的聚酯縫合線(一條縫合線用于一種處理)。在Nunc冷凍管中混合下列組分50μL磷酸鹽緩沖液，12.5μLNaCl溶液，25μLNH4Cl溶液，160μL鹵過(guò)氧化物酶溶液，500μL合成硬水40°dH,15.4μL200χ稀釋的非離子表面活性劑，37.liiLMilliQ水，和一條枯草芽孢桿菌孢子涂覆的聚酯縫合線(106個(gè)孢子)。如上所述制備陰性對(duì)照，只是鹵過(guò)氧化物酶溶液用MilliQ水代替。隨后通過(guò)添加200uL過(guò)氧化氫來(lái)起始反應(yīng)。將管形瓶于40°C溫育20分鐘。為了終止反應(yīng)，添加500uL硫代硫酸鈉，并于室溫(大約23°C)溫育10分鐘。然后將每條縫合線轉(zhuǎn)移至裝有溶于水的Tween80和玻璃珠的管，并將管以300rpm搖動(dòng)15分鐘以回收剩余的孢子。此后，在MilliQ水中制備稀釋系列，并將來(lái)自稀釋度10°至10_3的lOOiiL涂布到LB瓊脂板(14cm板)上。將板于37°C溫育48小時(shí)，并記錄每個(gè)板上的菌落形成單位(CFU)的平均數(shù)。使用菌落數(shù)來(lái)計(jì)算可回收細(xì)菌數(shù)的對(duì)數(shù)降低(殺死)，顯示于表23。表23<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實(shí)施例15■■運(yùn)器卜趟荊包_不好__制備下列試劑-DMG緩沖液(二甲基谷氨酸，SigmaD4379)，50mM,pH用NaOH調(diào)至7.0；_200mg/L來(lái)自疣狀彎孢的鹵過(guò)氧化物酶(參見(jiàn)W097/04102)，在50mMDMG緩沖液中；_400mM氯化鈉(NaCl)，在MilliQ水中；-lOOmM硫酸銨((NH4)2S04)，在MilliQ水中；-10mM過(guò)氧化氫(H202)，在MilliQ水中；-50mM溴化鈉(NaBr)，在MilliQ水中；禾口-5%硫代硫酸鈉(Na2S203)。其它材料-裝有5mL溶于水中的1%Tween80和大約lmL玻璃珠(3mm直徑)的管；-自在1000mL水中溶解的37gLB瓊脂(Merck0283)制備LB板；-Nunc冷凍管；-可調(diào)式加熱塊；和-實(shí)驗(yàn)使用每個(gè)裝有106個(gè)萎縮芽孢桿菌孢子(RavenLabs產(chǎn)品目錄編號(hào)1-6100ST)的不銹鋼盤(一個(gè)盤用于一種處理)。在Nunc冷凍管中混合下列組分478μLDMG緩沖液，7.5μLNaBr(在沒(méi)有NaBr的實(shí)驗(yàn)中用DMG緩沖液代替)，47μLNaCl溶液，38μL(NH4)2SO4溶液，30μL鹵過(guò)氧化物酶溶液，和一個(gè)萎縮芽孢桿菌孢子盤(IO6個(gè)孢子)。為了測(cè)試溴化鈉對(duì)殺死功效的影響，在有和無(wú)NaBr的這兩種情況中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在后一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，NaBr用DMG緩沖液代替。如上所述制備陰性對(duì)照，只是鹵過(guò)氧化物酶溶液用DMG緩沖液代替。隨后通過(guò)添加150μL過(guò)氧化氫來(lái)起始反應(yīng)。將管形瓶于40°C溫育20分鐘。為了終止反應(yīng)，添加750μL硫代硫酸鈉，并于室溫(大約23°C)溫育10鐘。然后將每個(gè)盤轉(zhuǎn)移至裝有溶于水中的Tween80和玻璃珠的管，并將管以300rpm搖動(dòng)15分鐘以回收剩余的孢子。此后，在MilliQ水中制備稀釋系列，并將來(lái)自稀釋度10°至10_3的100μL涂布到LB瓊脂板(14cm板)上。將板于37°C溫育48小時(shí)，并記錄每個(gè)板上的菌落形成單位(CFU)的平均數(shù)。使用菌落數(shù)來(lái)計(jì)算可回收細(xì)菌數(shù)的對(duì)數(shù)降低(殺死)，顯示于表24。表24對(duì)數(shù)降低(對(duì)數(shù)單位)陰性對(duì)照0處理(無(wú)NaBr)I處理(有NaBr)>3自對(duì)照筒回收的孢子的數(shù)目IO5個(gè)孢子/縫合線權(quán)利要求一種用于殺死或滅活微生物孢子的酶促方法，其包括使所述孢子接觸鹵過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫、氯或溴離子、和銨離子。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述鹵過(guò)氧化物酶是來(lái)自酶類EC1.11.1.10的氯過(guò)氧化物酶。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述商過(guò)氧化物酶是含有釩的商過(guò)氧化物酶。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述鹵過(guò)氧化物酶的氨基酸序列與自疣狀彎孢(Curvulariaverruculosa)(Curvulariainequalis)nT^tHW的氨基酸序列具有至少90%同一性、優(yōu)選95%同一性。5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述氯或溴離子是自氯化物或溴化物的鹽得到的；優(yōu)選所述氯化物或溴化物的鹽是氯化鈉、溴化鈉、氯化鉀、溴化鉀、氯化銨或溴化銨、或其混合物。6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述銨離子是自銨鹽得到的；優(yōu)選所述銨鹽是硫酸銨、碳酸銨、磷酸銨、氯化銨、溴化銨或碘化銨、或其混合物。7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中氯離子濃度是銨離子濃度的至少兩倍；優(yōu)選至少四倍、更優(yōu)選至少六倍、最優(yōu)選至少八倍、和特別是銨離子濃度的至少十倍。8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括使所述孢子接觸表面活性劑。9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物孢子是真菌或細(xì)菌孢子。10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述過(guò)氧化氫是自過(guò)碳酸鹽得到的。11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述孢子位于表面上，如紡織品表面或?qū)嶒?yàn)室或工藝設(shè)備或醫(yī)療裝置的表面。12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的方法，其中使所述孢子接觸氯和溴離子。13.—種組合物，其包含鹵過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫、氯或溴離子、銨離子和醫(yī)療裝置。14.一種用于裝置消毒或滅菌的方法，包括使所述裝置接觸鹵過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫、氯或溴離子、和銨離子。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述鹵過(guò)氧化物酶是來(lái)自酶類EC1.11.1.10的氯過(guò)氧化物酶。16.權(quán)利要求14的方法，其中所述鹵過(guò)氧化物酶是含有釩的鹵過(guò)氧化物酶。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述鹵過(guò)氧化物酶的氨基酸序列與自疣狀彎孢或不等彎孢可獲得的鹵過(guò)氧化物酶的氨基酸序列具有至少90%同一性、優(yōu)選95%同一性。18.權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)的方法，其中所述氯或溴離子是自氯化物或溴化物的鹽得到的；優(yōu)選所述氯化物或溴化物的鹽是氯化鈉、溴化鈉、氯化鉀、溴化鉀、氯化銨或溴化銨、或其混合物。19.權(quán)利要求14-18中任一項(xiàng)的方法，其中所述銨離子是自銨鹽得到的；優(yōu)選所述銨鹽是硫酸銨、碳酸銨、磷酸銨、氯化銨、溴化銨或碘化銨、或其混合物。20.權(quán)利要求14-19中任一項(xiàng)的方法，其中氯離子濃度是銨離子濃度的至少兩倍；優(yōu)選至少四倍、更優(yōu)選至少六倍、最優(yōu)選至少八倍、和特別是銨離子濃度的至少十倍。21.權(quán)利要求14-20中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括使所述裝置接觸表面活性劑。22.權(quán)利要求14-21中任一項(xiàng)的方法，其中所述過(guò)氧化氫是自過(guò)碳酸鹽得到的。23.權(quán)利要求14-22中任一項(xiàng)的方法，其中所述裝置是醫(yī)療裝置。24.權(quán)利要求14-23中任一項(xiàng)的方法，其中使所述裝置或醫(yī)療裝置接觸氯和溴離子。25.鹵過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫、氯化物鹽和/或溴化物鹽、和銨鹽用于殺死或滅活孢子的用途。26.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，用于醫(yī)療裝置消毒。27.根據(jù)權(quán)利要求26的用途，其中將所述醫(yī)療裝置滅菌。28.根據(jù)權(quán)利要求27的用途，其中所述鹵過(guò)氧化物酶是含有釩的氯過(guò)氧化物酶。29.根據(jù)權(quán)利要求25-28任一項(xiàng)的用途，在清洗機(jī)_消毒機(jī)中使用。全文摘要本發(fā)明提供了通過(guò)使孢子接觸鹵過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫、氯或溴離子、和銨離子來(lái)殺死或滅活所述孢子的方法。文檔編號(hào)A01N63/00GK101827527SQ200880112289公開(kāi)日2010年9月8日申請(qǐng)日期2008年10月23日優(yōu)先權(quán)日2007年10月23日發(fā)明者斯蒂芬·達(dá)尼爾森,比約恩·E·克里斯滕森,瑪麗·奧爾森-霍爾姆,莫滕·格杰曼森申請(qǐng)人:諾維信公司