專(zhuān)利名稱(chēng)：高粱的高頻再生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及包括器官發(fā)生的高粱再生。更具體地，本發(fā)明涉及一種高粱再生 方法，尤其是Sorghum bicolor(L. )Moench，通過(guò)器官發(fā)生獲得高頻再生。本文引用以說(shuō)明本發(fā)明背景的公開(kāi)文獻(xiàn)和其它材料，以及尤其是提供關(guān)于實(shí)施的 附加細(xì)節(jié)的實(shí)例，在此一并引入作為參考，為了方便起見(jiàn)，在下文通過(guò)作者、日期引用并且 在所附參考文獻(xiàn)中按照作者字母順序排列。高粱(Sorghum bicolor (L. )Moench)是一種廣泛種植的谷類(lèi)和飼料作物，更緊密 地與原產(chǎn)熱帶的主要作物相聯(lián)系，比如大米、玉米、甘蔗和黑黍。高粱在谷類(lèi)作物產(chǎn)量中居 第五，是熱帶禾本科植物的重要模型。由于能非常好地適應(yīng)極端環(huán)境，特別是干旱和高溫， 因此在主要谷類(lèi)中是獨(dú)特的。這些特性使得高粱成為在極端高溫和極少降水的地區(qū)養(yǎng)活人 類(lèi)和動(dòng)物種群的合適的谷物(Howe等2006)。另外，目前國(guó)際對(duì)經(jīng)濟(jì)、環(huán)境和能源安全的關(guān) 注促使從礦物燃料向生物燃料替代品轉(zhuǎn)變，比如生物乙醇和生物柴油。由于生物燃料能從 多種作物產(chǎn)生，每個(gè)國(guó)家采取策略開(kāi)發(fā)所擁有作物的比較優(yōu)勢(shì)。不同生物燃料作物中，高粱由于其生理和天然因素(包括其事實(shí)是光合高效的C4 植物)，被認(rèn)為是生產(chǎn)生物乙醇更好的選擇?？梢岳弥T如組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化的生物技術(shù)進(jìn)一 步改良該作物。30多年中，一些報(bào)道記錄了使用各種外植體使用不同培養(yǎng)基組合物的高粱 再生。這些報(bào)道包括高粱植株再生(未成熟胚(Gamborg等1977，Ma等1987,Hagio 2002), 成熟胚的莖葉(shoot)部(Cai等1987)，苗端(Zhong等1988)，成熟胚(Nirwan和Kothari 2003)，根部橫向薄層細(xì)胞(Baskaran等2006))，體細(xì)胞胚發(fā)生(未成熟和成熟胚(Rao等 1995,Elkonin 等 1996,MacKinnon 等 1986)，葉基(Mishra和 Khurana 2003))及其轉(zhuǎn)化(未 成熟胚(Zhao等2000，Carvalho等2004)，未成熟和成熟胚，莖尖和胚性愈傷組織(Tadesse 等 2003)和苗端(Giriiashankar 等 2005)，種子(Howe 等 2006))。盡管有這些成功的報(bào)道，但是還需要開(kāi)發(fā)用于高粱的新技術(shù)。這種技術(shù)必須具有 高頻再生，其有助于該技術(shù)應(yīng)用于諸如增加生物量或提高糖含量的遺傳學(xué)操作，以改善該 作物的生物乙醇產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一般涉及包括器官發(fā)生的高粱再生。更具體地，本發(fā)明涉及一種高粱再生 方法，尤其是Sorghum bicolor (L. )Moench，通過(guò)器官發(fā)生獲得高頻再生。因此，本發(fā)明首次提出一種甜高粱(Sorghum bicolor (L. )Moench)的再生方法。 簡(jiǎn)言之，使用切開(kāi)的具胚子葉(DEC)外植體通過(guò)器官發(fā)生再生高粱。本發(fā)明廣泛應(yīng)用于 甜高粱變種和雜種，此處特別說(shuō)明是關(guān)于甜高粱(Sorghum bicolor (L.)Moench)雜交品種 Liotian ULioza 7050A和LiaoJi Za 1。除了提供高頻再生之外，本發(fā)明還可直接應(yīng)用于 通過(guò)體細(xì)胞無(wú)性系變異生產(chǎn)高粱變異體和可直接應(yīng)用于高粱的遺傳學(xué)轉(zhuǎn)化。根據(jù)本發(fā)明，從中國(guó)甜高粱(Sorghum bicolor (L. )Moench)的切開(kāi)的具胚子葉 (DEC)外植體誘導(dǎo)器官性愈傷組織，并從該器官性愈傷組織再生植株。本發(fā)明的高頻再生系統(tǒng)由六階段組成階段1 (愈傷組織誘導(dǎo))，階段2和3 (莖葉芽(shoot bud)誘導(dǎo)和減少 酚滲出液)，階段4 (誘導(dǎo)莖葉芽萌發(fā)和伸長(zhǎng))，階段5 (莖葉伸長(zhǎng)和減少酚滲出)以及階段 6 (生根)。階段1中MS礦物鹽添加N6維生素，在后續(xù)階段MS礦物鹽添加B5維生素，并且 在特定階段改變抗氧化劑(例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP))、 有機(jī)添加劑(例如硫酸腺嘌呤(AdSO4))、無(wú)機(jī)添加劑(例如AgNO3)、氨基酸(例如L-脯氨 酸，L-谷氨酰胺，L-甘氨酸)和PGRs (植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑)，提高了再生效率并減少高粱組織 培養(yǎng)中固有的高酚化合物滲出。短短三個(gè)月內(nèi)從DEC外植體產(chǎn)生無(wú)基因型顯著變異的大約 250-300株健康小植株，存活率為100%。


圖1A-1I示出了依照本發(fā)明通過(guò)切開(kāi)的具胚子葉(DEC)的器官發(fā)生實(shí)現(xiàn)的高粱再 生。圖IA和IB示出了子葉節(jié)內(nèi)和周?chē)鷽](méi)有生根和愈傷組織誘導(dǎo)的切開(kāi)的具胚子葉外植體。 圖IC示出了從DEC愈傷組織誘導(dǎo)的莖葉芽。圖ID和IE示出了從莖葉芽再生的多個(gè)莖葉。圖IF示出了再生莖葉的伸長(zhǎng)。圖G和H出示了伸長(zhǎng)的莖葉的生根。圖II示出了已煉苗的小植株。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明一般涉及包括器官發(fā)生的高粱再生。更具體地，本發(fā)明涉及一種高粱再生 方法，尤其是Sorghum bicoloHDMoench，通過(guò)器官發(fā)生獲得高頻再生。除了提供高頻再 生之外，本發(fā)明還可直接應(yīng)用于通過(guò)體細(xì)胞無(wú)性系變異生產(chǎn)高粱變異體和可直接應(yīng)用于高 粱的遺傳學(xué)轉(zhuǎn)化。說(shuō)明書(shū)下文，僅僅出于方便考慮，通過(guò)參考某些高粱雜種來(lái)描述發(fā)明各方面。用其 它高粱變種和雜種代替提到的高粱雜種是可以理解的。此處提到的“器官發(fā)生”是指通過(guò)愈傷組織或植物任意部位的直接分生組織在可 控環(huán)境條件下在特定培養(yǎng)基內(nèi)再生莖葉。此處提到的“愈傷組織”是指從任意外植體組織產(chǎn)生的無(wú)器官或未分化的增殖細(xì) 胞塊。根據(jù)本發(fā)明，提供了一種通過(guò)器官發(fā)生再生高粱的方法，其有效地獲得高頻的再 生植物。一個(gè)實(shí)施方案中，從獲得自高粱，尤其是Sorghum bicoloHDMoench的具胚子葉 外植體再生植物。將具胚子葉的外植體切開(kāi)并放入固體培養(yǎng)基中，在此指階段1的培養(yǎng)基。 在一個(gè)實(shí)施方案中，階段1培養(yǎng)基包括MS礦物鹽和N6維生素并添加L-脯氨酸和L-谷氨酰 胺。在一個(gè)實(shí)施方案中，階段1培養(yǎng)基中添加大約25mg至大約200mgL-脯氨酸，優(yōu)選大約 50mg至大約IOOmg L-脯氨酸，更優(yōu)選大約IOOmg L-脯氨酸。另一實(shí)施方案中，階段1培養(yǎng) 基中添加大約50mg至大約250mg L-谷氨酰胺，優(yōu)選大約50mg至大約IOOmg L-谷氨酰胺， 更優(yōu)選大約IOOmg L-谷氨酰胺。階段1培養(yǎng)基還包括植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。在一個(gè)實(shí)施方案 中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是生長(zhǎng)素和脫落酸(ABA)。優(yōu)選實(shí)施方案中，生長(zhǎng)素是二氯苯氧基乙酸 (2，4-D)。一個(gè)實(shí)施方案中，階段1培養(yǎng)基中ABA濃度是大約0. 94 μ M至大約18. 9 μ Μ，優(yōu)選 大約0. 94 μ M至大約7. 56 μ Μ,更優(yōu)選大約3. 78 μ Μ。另一實(shí)施方案中，階段1培養(yǎng)基中2， 4-D濃度是大約2. 26 μ M至大約9. 04 μ Μ,優(yōu)選大約4. 52 μ M至大約6. 78 μ Μ,更優(yōu)選大約6. 78 μ M0階段1培養(yǎng)基還包括碳源。在一個(gè)實(shí)施方案中，碳源是大約2%至大約5%，優(yōu)選 大約2 %至大約3 %，更優(yōu)選大約3 %的蔗糖。另一實(shí)施方案中，碳源是大約2 %至大約5 %， 優(yōu)選大約3 %至大約5 %的葡萄糖。另一實(shí)施方案中，碳源是大約2 %至大約5 %，優(yōu)選大約 2%至大約3%的果糖。又一實(shí)施方案中，碳源是大約2%至大約5%，優(yōu)選大約2%至大約 3%的麥芽糖。另一實(shí)施方案中，碳源是蔗糖和葡萄糖混合物，蔗糖大約2%至大約3%，優(yōu) 選大約2%，葡萄糖大約2%至大約3%，優(yōu)選大約2%。再一實(shí)施方案中，碳源是果糖和葡 萄糖混合物，果糖大約1 %至大約2 %，優(yōu)選大約1 %，葡萄糖大約2 %至大約3 %，優(yōu)選大約 2%。又一實(shí)施方案中，碳源是麥芽糖和葡萄糖混合物，麥芽糖大約至大約2%，優(yōu)選大 約1 %，葡萄糖大約2 %至大約3 %，優(yōu)選大約2 %。一個(gè)實(shí)施方案中，DEC片段在階段1培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約4-8周，優(yōu)選大約6周。另 一實(shí)施方案中，階段1培養(yǎng)物以大約2周的周期繼代培養(yǎng)。一個(gè)實(shí)施方案中，階段1培養(yǎng)保 持大約25°C 士 2°C，16h/8h(光/暗)光周期，55%至60%的相對(duì)濕度。一個(gè)實(shí)施方案中， 光周期是在大約25 μ EnT2s-1光密度的白色熒光下進(jìn)行。階段1培養(yǎng)基中培養(yǎng)的無(wú)根的DEC 片段顯示受抑制的生長(zhǎng)，但是同時(shí)外植體膨脹，粗而短，變成黃綠色。與子葉相連的胚芽在 子葉節(jié)內(nèi)或周?chē)蛊鹦纬捎鷤M織(SCPC)。階段1培養(yǎng)基中ABA、脯氨酸和L-谷氨酰胺誘 導(dǎo)脅迫并抑制與子葉相連的胚芽的發(fā)芽。2，4-D誘導(dǎo)愈傷組織形成。隨同胚芽一起，根組織 也在2周內(nèi)開(kāi)始凸出。將這些根組織從外植體全部除去。在階段1培養(yǎng)基培養(yǎng)后，損傷SCPC，放入被稱(chēng)為階段2培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)基中。在 一個(gè)實(shí)施方案中，階段2培養(yǎng)基包括MS礦物鹽和B5維生素并且添加L-脯氨酸、L-谷氨酰 胺、L-甘氨酸、抗壞血酸(Asc)、AgN03、PVP和PVPP。在一個(gè)實(shí)施方案中，階段2培養(yǎng)基中添 加大約IOOmg至大約IOOOmg L-脯氨酸，優(yōu)選大約300mg至大約600mg L-脯氨酸，更優(yōu)選 大約500mg L-脯氨酸。另一實(shí)施方案中，階段2培養(yǎng)基中添加大約IOOmg至大約IOOOmg L-谷氨酰胺，優(yōu)選大約300mg至大約600mg L-谷氨酰胺，更優(yōu)選大約500mg L-谷氨酰胺。 再一實(shí)施方案中，階段2培養(yǎng)基添加大約1. 42 μ M至大約11. 36 μ Μ，優(yōu)選大約2. 84 μ M至 大約8. 52 μ Μ,更優(yōu)選大約5. 67 μ M濃度的Asc。在一個(gè)實(shí)施方案中，階段2培養(yǎng)基添加大 約0. 25g至大約1. 5g，優(yōu)選大約0. 5g至大約1. 5g，更優(yōu)選大約1. Og的PVP。另一實(shí)施方 案中，階段2培養(yǎng)基添加大約0. 25g至大約1. 5g，優(yōu)選大約0. 5g至大約1. Og,更優(yōu)選大約 1. Og的PVPP。再一實(shí)施方案中，階段2培養(yǎng)基中添加大約2mg至大約20mg L-甘氨酸，優(yōu) 選大約5mg至大約15mg L-甘氨酸，更優(yōu)選大約IOmg L-甘氨酸。又一實(shí)施方案中，階段2 培養(yǎng)基添加大約0. 2mg至大約1. 5mg,優(yōu)選大約0. 5mg至大約1. Omg,更優(yōu)選大約1. Omg的 AgNO30階段2培養(yǎng)基還包括植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是生長(zhǎng) 素。優(yōu)選實(shí)施方案中，生長(zhǎng)素是2，4-D。在一個(gè)實(shí)施方案中，階段2培養(yǎng)基中2，4-D濃度是 大約2. 26 μ M至大約9. 04 μ Μ,優(yōu)選大約4. 52 μ M至大約6. 78 μ Μ,更優(yōu)選大約6. 78 μ Μ。階 段2培養(yǎng)基還包括碳源。階段2培養(yǎng)基中的碳源可與階段1培養(yǎng)基中相同。優(yōu)選實(shí)施方案 中，碳源是大約2%至大約5%，優(yōu)選大約2%至大約3%，更優(yōu)選大約3%的蔗糖。一個(gè)實(shí)施方案中，受損的SCPC在階段2培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約3-7天，優(yōu)選大約5天。 另一實(shí)施方案中，階段2培養(yǎng)保持在前面所述的大約25°C 士2°C，16h/8h(光/暗)光周期， 55%至60%的相對(duì)濕度。在這期間，莖葉芽開(kāi)始從胚芽愈傷組織和子葉節(jié)內(nèi)和周?chē)T導(dǎo)出。 同時(shí)，大量酚滲出液開(kāi)始從莖葉芽基部滲出。階段2培養(yǎng)基中添加Asc、PVP、PVPP、L-甘氨酸和AgNO3阻止這些酚滲出液的滲出。階段2培養(yǎng)基中SCPC超過(guò)5天的長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)抑制 莖葉芽發(fā)育，同時(shí)莖葉芽變褐色，最終衰老。在階段2培養(yǎng)基培養(yǎng)后，組織放入被稱(chēng)為階段3培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)基中。在一個(gè) 實(shí)施方案中，階段3培養(yǎng)基包括MS礦物鹽和B5維生素并且添加L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、 干酪素水解物(CH)、硫酸腺嘌呤(AdSO4)和PVP。在一個(gè)實(shí)施方案中，階段3培養(yǎng)基中添加 大約IOOmg至大約lOOOmg，優(yōu)選大約300mg至大約600mg，更優(yōu)選大約500mg L-谷氨酰胺。 另一實(shí)施方案中，階段3培養(yǎng)基中添加大約5mg至大約25mg，優(yōu)選大約IOmg至大約20mg， 更優(yōu)選大約20mg L-甘氨酸。再一實(shí)施方案中，階段3培養(yǎng)基添加大約0. 25g至大約1.5g， 優(yōu)選大約0. 5g至大約1. 5g，更優(yōu)選大約1. Og的PVP。在一個(gè)實(shí)施方案中，階段3培養(yǎng)基添 加大約0. 5g至大約1. 5g，優(yōu)選大約0. 5g至大約1. Og,更優(yōu)選大約1. Og的CH。另一實(shí)施方 案中，階段3培養(yǎng)基中添加大約25mg至大約200mg，優(yōu)選大約50mg至大約lOOmg，更優(yōu)選大 約IOOmg的AdS04。階段3培養(yǎng)基還包括植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物生長(zhǎng)調(diào) 節(jié)劑是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素。優(yōu)選實(shí)施方案中，生長(zhǎng)素是2，4-D。在一個(gè)實(shí)施方案中，階段 3培養(yǎng)基中2，4-D濃度是大約0. 56 μ M至大約2. 24 μ Μ，優(yōu)選大約0. 56 μ M至大約1. 12μΜ， 更優(yōu)選大約1. 12 μ Μ。優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞分裂素是6-芐基氨基嘌呤(BA)和激動(dòng)素(KN) 的混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，階段3培養(yǎng)基中BA濃度是大約4. 43 μ M至大約13. 29 μ Μ, 優(yōu)選大約4. 43 μ M至大約11. 07 μ Μ，更優(yōu)選大約8. 86 μ Μ。另一實(shí)施方案中，階段3培養(yǎng)基 中KN濃度是大約2. 32 μ M至大約18. 56 μ Μ,優(yōu)選大約4. 64 μ M至大約13. 92 μ Μ,更優(yōu)選大 約9.28 μ Μ。階段3培養(yǎng)基還包括碳源。階段3培養(yǎng)基中的碳源可與階段1培養(yǎng)基中相同。 優(yōu)選實(shí)施方案中，碳源是大約2 %至大約5 %，優(yōu)選大約2 %至大約3 %，更優(yōu)選大約3 %的蔗 糖。一個(gè)實(shí)施方案中，組織在階段3培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約7-15天，優(yōu)選大約10天。另一 實(shí)施方案中，階段3培養(yǎng)物以大約5天的周期繼代培養(yǎng)。一個(gè)實(shí)施方案中，階段3培養(yǎng)保持 在前面所述的大約25°C 士 2°C，16h/8h(光/暗)光周期，55%至60%的相對(duì)濕度。階段3 培養(yǎng)基中，降低生長(zhǎng)素(2，4-D)濃度，添加細(xì)胞分裂素(BA，KN)和有機(jī)添加劑(如CH、AdS04、 PVP)以提高莖葉芽增殖和生長(zhǎng)。在階段3培養(yǎng)基培養(yǎng)后，從一簇莖葉芽分成每簇有3-5個(gè)芽的8-10簇增殖莖葉 芽，放入被稱(chēng)為階段4培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，階段4培養(yǎng)基包括 MS礦物鹽和B5維生素并且添加L-甘氨酸和硫酸腺嘌呤(AdS04)。在一個(gè)實(shí)施方案中，階段 4培養(yǎng)基中添加大約5mg至大約25mg，優(yōu)選大約IOmg至大約20mg，更優(yōu)選大約20mg L-甘 氨酸。另一實(shí)施方案中，階段4培養(yǎng)基中添加大約25mg至大約200mg，優(yōu)選大約50mg至大 約lOOmg，更優(yōu)選大約IOOmg的AdS04。階段4培養(yǎng)基還包括植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。在一個(gè)實(shí)施 方案中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是細(xì)胞分裂素和赤霉酸(GA3)。優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞分裂素是BA。 在一個(gè)實(shí)施方案中，階段4培養(yǎng)基中BA濃度是大約4. 43 μ M至大約13. 29 μ Μ,優(yōu)選大約 4. 43 μ M至大約11. 07 μ Μ，更優(yōu)選大約8. 86 μ Μ。另一實(shí)施方案中，階段4培養(yǎng)基中GA3濃度 是大約0. 72 μ M至大約2. 88 μ Μ,優(yōu)選大約0. 72 μ M至大約2. 16 μ Μ,更優(yōu)選大約1. 44 μ Μ。 階段4培養(yǎng)基還包括碳源。階段4培養(yǎng)基中的碳源可與階段1培養(yǎng)基中相同。優(yōu)選實(shí)施方 案中，碳源是大約2%至大約5%，優(yōu)選大約2%至大約3%，更優(yōu)選大約3%的蔗糖。一個(gè)實(shí)施方案中，增殖莖葉芽在階段4培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約1-3周，優(yōu)選大約2周。
9另一實(shí)施方案中，階段4培養(yǎng)物以一周的周期繼代培養(yǎng)。一個(gè)實(shí)施方案中，階段4培養(yǎng)保 持在前面所述的大約25°C 士 2°C，16h/8h(光/暗)光周期，55%至60%的相對(duì)濕度。2周 后大約25-30個(gè)具有再生莖葉的莖葉芽從每單簇中長(zhǎng)出。在階段4中除去植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié) 劑(PRGs) (2,4-D和KN)和無(wú)機(jī)添加劑(PVP、CH和L-谷氨酰胺)并添加GA3以使得莖葉伸 長(zhǎng)。當(dāng)莖葉芽從簇中分開(kāi)時(shí)組織會(huì)損傷，這些損傷產(chǎn)生酚類(lèi)分泌物，以至于組織基部變?yōu)楹?br> 里任在階段4培養(yǎng)基培養(yǎng)后，增殖莖葉芽放入被稱(chēng)為階段5培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)基中培 養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，階段5培養(yǎng)基包括MS礦物鹽和B5維生素并且添加L-甘氨酸、PVP 和硫酸腺嘌呤(AdS04)。在一個(gè)實(shí)施方案中，階段5培養(yǎng)基中添加大約5mg至大約25mg，優(yōu) 選大約IOmg至大約20mg，更優(yōu)選大約20mg L-甘氨酸。另一實(shí)施方案中，階段5培養(yǎng)基中 添加大約25mg至大約200mg，優(yōu)選大約50mg至大約lOOmg，更優(yōu)選大約IOOmg的AdSO4。再 一實(shí)施方案中，階段5培養(yǎng)基添加大約0. 5g至大約1. 5g，優(yōu)選大約0. 5g至大約1. Og,更優(yōu) 選大約l.Og的PVP。階段5培養(yǎng)基還包括植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物生長(zhǎng) 調(diào)節(jié)劑是細(xì)胞分裂素和赤霉酸(GA3)。優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞分裂素是ΒΑ。在一個(gè)實(shí)施方 案中，階段5培養(yǎng)基中BA濃度是大約4. 43 μ M至大約13. 29 μ Μ，優(yōu)選大約4. 43 μ M至大約 11. 07 μ Μ,更優(yōu)選大約8. 86 μ Μ。另一實(shí)施方案中，階段5培養(yǎng)基中GA3濃度是大約0. 72 μ M 至大約2. 88 μ Μ,優(yōu)選大約0. 72 μ M至大約2. 16 μ Μ,更優(yōu)選大約1. 44 μ Μ。階段5培養(yǎng)基還 包括碳源。階段5培養(yǎng)基中的碳源可與階段1培養(yǎng)基中相同。優(yōu)選實(shí)施方案中，碳源是大 約2 %至大約5 %，優(yōu)選大約2 %至大約3 %，更優(yōu)選大約3 %的蔗糖。一個(gè)實(shí)施方案中，增殖中的莖葉芽在階段5培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約1-3周，優(yōu)選大約2 周。另一實(shí)施方案中，階段5培養(yǎng)物以大約1周的周期繼代培養(yǎng)。一個(gè)實(shí)施方案中，階段5 培養(yǎng)維持在前面所述的大約25°C 士2°C，16h/8h(光/暗)光周期，55%至60%的相對(duì)濕度。 為避免組織進(jìn)一步褐變，在階段5培養(yǎng)基中添加PVP作為抗氧化劑。PVP不抑制莖葉生長(zhǎng)， 但是能提高莖葉增殖。在階段5培養(yǎng)基中，莖葉增殖和生長(zhǎng)在2周內(nèi)達(dá)到最大(4cm)。在階段5培養(yǎng)基培養(yǎng)后，將長(zhǎng)有2-3個(gè)大約4cm高的莖葉的莖葉簇轉(zhuǎn)入用于生根 的被稱(chēng)為階段6培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，階段6培養(yǎng)基包括MS礦 物鹽和B5維生素并且添加L-甘氨酸、PVP和硫酸腺嘌呤(AdSO4)。在一個(gè)實(shí)施方案中，階段 6培養(yǎng)基中添加大約5mg至大約25mg，優(yōu)選大約IOmg至大約20mg，更優(yōu)選大約20mg L-甘 氨酸。另一實(shí)施方案中，階段6培養(yǎng)基中添加大約25mg至大約200mg，優(yōu)選大約50mg至大 約lOOmg，更優(yōu)選大約IOOmg的AdSO4。再一實(shí)施方案中，階段6培養(yǎng)基添加大約0. 5g至大 約1. 5g，優(yōu)選大約0. 5g至大約1. Og,更優(yōu)選大約1. Og的PVP。階段6培養(yǎng)基還包括植物 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是生長(zhǎng)素。優(yōu)選實(shí)施方案中，生長(zhǎng)素是吲 哚-3-乙酸(IAA)。在一個(gè)實(shí)施方案中，階段6培養(yǎng)基中IAA濃度是大約2. 85 μ M至大約 11. 4 μ Μ，優(yōu)選大約2. 85 μ M至大約8. 55 μ Μ,更優(yōu)選大約5. 7 μ Μ。階段6培養(yǎng)基中的碳源 可與階段1培養(yǎng)基中相同。優(yōu)選實(shí)施方案中，碳源是大約2%至大約5%，優(yōu)選大約2%至大 約3 %，更優(yōu)選大約3 %的蔗糖?！獋€(gè)實(shí)施方案中，增殖莖葉芽在階段6培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約1-3周，優(yōu)選大約2周。 一個(gè)實(shí)施方案中，階段6培養(yǎng)保持在前面所述的大約25°C 士2°C，16h/8h(光/暗)光周期， 55%至60%的相對(duì)濕度。階段6培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)素IAA在1周內(nèi)誘導(dǎo)生根。在沒(méi)有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或者僅僅包含分裂素的培養(yǎng)基中沒(méi)有根形成。根的誘導(dǎo)必須有生長(zhǎng)素，沒(méi)有生長(zhǎng)素就 沒(méi)有根形成。在階段6培養(yǎng)基中，平均每個(gè)莖葉會(huì)產(chǎn)生3cm長(zhǎng)的10-15條根。生根后的小 植株成功煉苗，100%存活，移植到溫室繼續(xù)生長(zhǎng)。另外，本發(fā)明提供了可用于高粱植株轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)，從而可獲得高頻轉(zhuǎn)基因植株。這 種轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染方法對(duì)于高粱植物的轉(zhuǎn)化并不是關(guān)鍵的；目前可獲得多種轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染方法。 當(dāng)獲得轉(zhuǎn)化作物或其它寄主細(xì)胞的更新的方法，可以直接采用這些方法。相應(yīng)地，研制出許 多種將DNA序列插入寄主細(xì)胞基因組以得到序列轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，從而實(shí)現(xiàn)生物體表型改 變的方法。因而，可采用任何有效轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染的方法。例如參見(jiàn)Mathews等(1992)，Neuhaus 等(1987)，Wilde等(1992)，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7241937，7273966和7291765和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公 開(kāi)號(hào)2007/0231905和2008/0010704。還參見(jiàn)國(guó)際公開(kāi)申請(qǐng)?zhí)朩02005/103271。一個(gè)實(shí)施方案中，可采用本領(lǐng)域公知技術(shù)將外植體組織與農(nóng)桿菌共同培養(yǎng)，所述 農(nóng)桿菌菌株包含一個(gè)或多個(gè)DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體包含一個(gè)或多個(gè)基因或核酸。可使 用本領(lǐng)域公知的常規(guī)技術(shù)選擇轉(zhuǎn)化組織。在一實(shí)施方案中，使用常規(guī)技術(shù)如粒子轟擊技術(shù) 將DNA導(dǎo)入外植體組織?？墒褂帽绢I(lǐng)域公知常規(guī)技術(shù)選擇轉(zhuǎn)化組織。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)基因植物可 使用在此描述的方法再生。同樣，插入高粱植物的DNA(所述DNA)對(duì)于轉(zhuǎn)化過(guò)程并不是關(guān)鍵性的。通常導(dǎo)入 植物的DNA是構(gòu)建體的一部分。DNA可以是關(guān)注的基因，例如蛋白質(zhì)編碼序列，或者它可以 是能調(diào)控基因表達(dá)的序列，例如反義序列、正義抑制序列或miRNA序列。構(gòu)建體通常包括有 效地連接所述DNA5’端和/或DNA3’端的調(diào)控區(qū)。包括全部這些元件的盒此處也稱(chēng)為表達(dá) 盒。表達(dá)盒另外可包括在表達(dá)盒構(gòu)建體中的5’端前導(dǎo)序列。調(diào)控區(qū)(即啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) 區(qū)和翻譯終止區(qū))和/或編碼信號(hào)錨定的多聚核苷酸相對(duì)于寄主細(xì)胞或者相對(duì)于彼此可以 是天然的/類(lèi)似的?？蛇x地，調(diào)控區(qū)和/或編碼信號(hào)錨定的多聚核苷酸相對(duì)于寄主細(xì)胞或者 相對(duì)于彼此可以是異源的。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7205453和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)
發(fā)明者K·納丁穆圖, R·A·瓦蘇德萬(wàn), S·拉馬錢(qián)德蘭 申請(qǐng)人:淡馬錫生命科學(xué)研究院有限公司