專利名稱：一種保持甘藍(lán)rgms雄性不育系的繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物雜種優(yōu)勢(shì)利用技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用二年生植物莖生 葉組織的培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)一種甘藍(lán)隱性核雄性不育型(Recessive genetic male sterility 簡(jiǎn)稱RGMS)中雄性不育系的保持繁殖方法。
背景技術(shù)：
蔬菜作物雄性不育系的發(fā)現(xiàn)和利用，在雜種優(yōu)勢(shì)利用方面具有重要意義， 從而擴(kuò)大了農(nóng)作物雜種優(yōu)勢(shì)應(yīng)用范圍和實(shí)現(xiàn)了雜種100%的雜交率，對(duì)提高種 子質(zhì)量和增加作物種植產(chǎn)量，獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益起到了重要作用。甘藍(lán)是 重要的蔬菜作物之一，全國(guó)各地普遍種植，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，多茬栽培，周年供 應(yīng)，生產(chǎn)中栽培品種全部選用雜種一代種子。甘藍(lán)雜種一代種子的獲得主要 采用自交不親和系制種和利用雄性不育系制種兩種途徑。但利用自交不親和 系制種存在生產(chǎn)的種子具有雜交率低、親本容易流失等缺陷，而利用雄性不 育系作母本系生產(chǎn)一代雜種正好克服了自交不親和系的諸多缺點(diǎn)，對(duì)雜種優(yōu)
勢(shì)發(fā)展利用起到極大的促進(jìn)作用，也成為當(dāng)今雜種一代種子制種的重點(diǎn)。 甘藍(lán)為十字花科蔬菜作物，它的花朵為兩性花，即雌蕊雄蕊同居于一朵花中。 甘藍(lán)的有些基因型材料植株花朵雄性器官發(fā)育不良、表現(xiàn)退化畸形或喪失功 能，但雌性器官發(fā)育正常，能接受外來花粉而結(jié)實(shí)的現(xiàn)象，稱為"雄性不育"。 雄性不育性是可以遺傳的，通過選育可以育成不育性穩(wěn)定的系統(tǒng)，稱為雄性 不育系。利用雄性不育系配制一代雜種，只要將不育系和可育系的父本系種 植在統(tǒng)一隔離區(qū)內(nèi)，從不育系上采收的種子就全部是雜交種。蔬菜作物的雄性不育性按其遺傳方式分為核雄性不育型(Genetic male sterility簡(jiǎn)稱GMS) 和胞質(zhì)雄性不育型(簡(jiǎn)稱CMS)兩種類型。二十世紀(jì)八十年代核雄性不育型
(GMS)雄性不育系已在大白菜、蘿卜、辣椒、番茄等蔬菜作物中育成，并 應(yīng)用于雜種一代種子的制種；而甘藍(lán)核雄性不育型(GMS)雄性不育系育成 和用于制種相對(duì)較晚，據(jù)報(bào)道它具有兩種核基因遺傳類型， 一種由一對(duì)核顯 性基因決定的核雄性不育型(DGMS)雄性不育系，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉 研究所育成； 一種由一對(duì)核隱性基因決定的核雄性不育型(RGMS)雄性不育 系，由西北農(nóng)林科技大學(xué)育成。甘藍(lán)核雄性不育型(RGMS)雄性不育性受 核內(nèi)一對(duì)質(zhì)量性狀隱性基因控制(基因型msms)，雄性可育性則受核內(nèi)一對(duì) 質(zhì)量性狀顯性基因控制決定(基因型MsMs);兩者遺傳以RGMS雄性不育系 基因型(msms)作母本與同質(zhì)結(jié)合基因型(MsMs)能育父本交配，其子一代 是能育的，自交后其子二代分離比例是3 (能育)1 (不育)；若與異質(zhì)結(jié)合 基因型(Msms)能育父本交配，則子一代不育類型和能育類型的比例是l : 1， 其子一代屬于不育類型者是不能繁殖后代的，能育類型自交產(chǎn)生的子代仍按3
(能育)1 (不育)的比例分離。按照細(xì)胞核不育類型的遺傳方式，不能得 到固定的不育類型。在田間不育株與能育株混在一起，生長(zhǎng)前期不能鑒別， 要到開花后才能分清能育與不育株。
甘藍(lán)利用核雄性不育型(RGMS)的雄性不育系制種被稱為利用兩用系制 種法，"兩用系"就是同一系統(tǒng)既作不育系，又作保持系用。由一對(duì)核基因控 制的不育性，用不育株作母本，雜合能育株作父本，從不育株上收獲的種子 播種后，群體內(nèi)能育株和不育株約成l : l分離。利用兩用系制種雜種一代種 子時(shí)按照一定的行比栽植兩用系(母本系)和父本系，但兩用系的株距應(yīng)縮小，使栽植的株數(shù)約增加一倍，在初花期拔除兩用系的能育株，以后從剩下 的不育株上收獲的種子就是一代雜種。這種兩用系制種是生產(chǎn)甘藍(lán)雜種一代 種子的有效途徑之一，但其主要存在三方面問題， 一是大面積制種拔除能育
株將投入大量人力和財(cái)力會(huì)提高種子成本；二是如果拔除能育株不徹底或初 花期拔除不及時(shí)將降低雜交率會(huì)影響種子質(zhì)量；三是如果利用花期雄性不育 植株腋芽扦插繁殖，其繁殖系數(shù)低(一般10 15倍)、并成本高、植株成活 率低。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題與缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種保 持甘藍(lán)RGMS雄性不育系的繁殖方法。該方法不僅有效的解決了大面積制種 時(shí)拔除能育株投入的大量人力和財(cái)力，降低了制種成本；同時(shí)，排除了拔除， 能育株不徹底或初花期拔除不及時(shí)降低雜交率的問題，提高了雜交種子的質(zhì)
實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)解決方案是 一種保持甘藍(lán)RGMS雄性不育系 的繁殖方法，包括下列步驟
1) 外植體選擇
以甘藍(lán)RGMS雄性不育系的不育株msms授可育株Msms花粉后收獲的 種子，適宜時(shí)期播種育苗定植，秋季培養(yǎng)為成株或半成株，翌年植株生殖生 長(zhǎng)抽薹進(jìn)入初花期，根據(jù)花朵雄蕊退化的指示性狀，選擇雄性不育植株花莖 上著生的莖生葉片，切成邊長(zhǎng)為0.8 1.0厘米的小片作為離體培養(yǎng)的外植體;
2) 莖生葉片的分化誘導(dǎo)
把外植體接種到MS培養(yǎng)基上，在溫度25土rC，每天光照14 16h，光照強(qiáng)度2000 2500Lx條件下培養(yǎng)40 50天誘導(dǎo)出叢生芽；
叢生芽的繼代增殖將誘導(dǎo)產(chǎn)生的叢生芽切割成單芽轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中
培養(yǎng)25 30天誘導(dǎo)出叢生芽，再將叢生芽切割成單芽在MS培養(yǎng)基上繼代2
3代，芽的數(shù)量得到100倍以上增殖；
上述的MS培養(yǎng)基中含質(zhì)量百分比為3。/。蔗糖、0.8%瓊脂，1.0 2.0mg/L
的6-芐基腺嘌呤及0.1 0.2 mg/L的2,4-二氯化苯氧基乙酸；
3) 分化芽的生根誘導(dǎo)
待叢生芽生長(zhǎng)至2.0 4.0cm高，自單芽基部切下將其轉(zhuǎn)接至1/2MS培養(yǎng) 基上，在溫度25土rC,每天光照10h 12h,光照強(qiáng)度2000 2500Lx的條 件下培養(yǎng)15 20天誘導(dǎo)生根，獲得生根苗；
上述的1/2MS培養(yǎng)基中含質(zhì)量百分比為3。/。蔗糖、0.8。/。瓊脂，0.1 0.3mg/L 的a-萘乙酸、0.1 0.2mg/L剛哚乙酸；
4) 生根苗的移栽與定植
將生根苗鍛煉3 5天，移植到裝有土壤的塑料缽中促使其緩苗生長(zhǎng)，在 甘藍(lán)RGMS雄性不育系的適宜制種期將長(zhǎng)有6 8片真葉的再生苗定植。
與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明的保持甘藍(lán)RGMS雄性不育系的繁殖方法具 有以下優(yōu)點(diǎn)-
1 )首次選用甘藍(lán)RGMS雄性不育系生殖生長(zhǎng)期的開花植株的花莖葉片作 為外植體，接種到適宜的激素配比組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得 了具有高誘導(dǎo)率的再生苗，并保持了原RGMS雄性不育系遺傳特性，為實(shí)現(xiàn) 100%雜交率種子制種探索出新途徑。
2)采用本發(fā)明的繁殖方法提高了甘藍(lán)的育種效果，保證并擴(kuò)大了甘藍(lán)雄性不育性的正常繁育。
3)克服了甘藍(lán)雄性不育性田間正常繁育的繁瑣，不但保持了不育系，并 且大幅度提高了其繁殖系數(shù)，為大量制種提供了保證。


圖1是植株生殖生長(zhǎng)抽薹進(jìn)入初花期取外植體時(shí)的性狀； 圖2是在MS培養(yǎng)基上經(jīng)40 50天誘導(dǎo)出的叢生芽； 圖3是在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 30天誘導(dǎo)出叢生芽； 圖4是將叢生芽切割成單芽在MS培養(yǎng)基上繼代； 圖5不定芽在1/2MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根； 圖6生根苗移植到裝有土壤的塑料缽中培養(yǎng)。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合發(fā)明人給出的具體實(shí)施例，進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做一個(gè) 詳細(xì)說明。 實(shí)施例l:
本實(shí)施例選用甘藍(lán)雄性不育兩用系的成株(大株)中，依據(jù)開花花朵雄蕊 退化的指示性狀，選擇雄性不育株的花薹莖生葉片，即甘藍(lán)雜種一代新組合 "夏抗69"的母本——核雄性不育型RGMS雄性不育系RGMS05-632M5168的成株 (大株)抽薹植株花薹莖生葉片為材料。
1) RGMS雄性不育系成株(大株)抽薹植株的培養(yǎng)
將從RGMS05-632M5168系中不育植株上收獲的種子，于7月上旬露地播種育 苗，當(dāng)苗齡有6 7片真葉時(shí)，定植大田，正常栽培管理。到冬季上凍前(11 月上中旬)將結(jié)球緊實(shí)的RGMS05-632M5168系連根挖起，假植在提前準(zhǔn)備好的 土窖中，冬季覆蓋草簾防凍和覆蓋塑料薄膜防雨雪。翌年3月上旬從窖中取出結(jié)球緊實(shí)的RGMS05-632M5168系植株定植防蟲紗網(wǎng)棚中正常管理。
2) 外植體選擇
于4月中旬結(jié)球緊實(shí)的RGMS05-632M5168系的植株抽薹初期(圖l)，根據(jù)開 花花朵雄蕊退化的指示性狀，觀察植株花朵的育性，選擇生長(zhǎng)健壯優(yōu)良的雄 性不育植株的主花莖上著生的莖生葉片作為植株再生離體培養(yǎng)的外植體。
3) RGMS05-632M5168系再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng) 不定芽的誘導(dǎo)
選用RGMS05-632M5168系成株(大株)雄性不育株主花薹的花莖葉片，將 葉片切成lcn/左右的小方片，用75%酒精(40 50秒)、0. 1%升汞(8 10分) 消毒；接種于MS培養(yǎng)基中，其中含3%蔗糖(質(zhì)量比)、0.8%瓊脂(質(zhì)量比)、 2. 0mg/L的6-芐基腺嘌呤(6-BA)及O. lmg/L的2， 4-二氯化苯氧基乙酸(2， 4-D)。在溫度25。C，每天光照14h，光照強(qiáng)度2500Lx條件下培養(yǎng)，經(jīng)40天誘 導(dǎo)出不定芽(圖2)。根據(jù)秋季田間(露地)適宜定植時(shí)間(陜西定植時(shí)間為8 月下旬)，可繼代1 3代(圖3，圖4)，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。甘藍(lán)雄性不育系的莖 生葉誘芽率91. 5%，分化率135%。
上述誘芽率(％)=誘導(dǎo)出芽的外植體數(shù)/總外植體數(shù)乂100%;
分化率(％)=分化的總芽數(shù)/總外植體數(shù)乂100%。
② 不定根的誘導(dǎo)
待RGMS05-632M5168莖生葉片的不定芽生長(zhǎng)至2. 5cm高時(shí)，自不定芽基 部切下將其轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的生根培養(yǎng)基上，生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，其中含 3%蔗糖(質(zhì)量比)、0. 80/。瓊脂(質(zhì)量比)和0. 3mg/L的a -萘乙酸(NAA), O.lmg/L 口引哚乙酸(IAA)。在溫度25°C，每天光照12h，光照強(qiáng)度2500Lx的條件下 培養(yǎng)，經(jīng)20天誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)出生根苗，生根率100%。
③ 再生苗移栽將有再生苗的培養(yǎng)瓶口打開鍛煉3天，從培養(yǎng)瓶中取出再生苗，洗去根 部的培養(yǎng)基，移植到裝有營(yíng)養(yǎng)土的塑料缽中促使其緩苗生長(zhǎng)。在8月下旬， 當(dāng)再生苗有5 7片真葉時(shí)，適應(yīng)性煉苗7天后定植于田間(露地)。秧苗成 活率95%,以后管理同于常規(guī)田間(露地)管理。 實(shí)施例2:
本實(shí)施例選用雄性不育系的半成株不育株的花薹莖生葉片，即甘藍(lán)雜種一
代新組合"越夏王"的母本一核雄性不育型RGMS雄性不育系RGMS05-632M5168 的半成株抽薹植株花薹莖生葉片為材料。
1) RGMS雄性不育系半成株抽薹植株的培養(yǎng)
將從RGMS05-632M5168系中不育植株上收獲的種子，于8月中旬露地播種育 苗，當(dāng)苗齡有6 7片真葉時(shí)，9月中下旬定植大田，正常栽培管理；冬前對(duì)半 包球RGMS05-632M5168系的植株培土保溫、冬灌，植株露地越冬。翌年開春溫 度升高后，田間除草，植株上搭建防蟲紗網(wǎng)棚，追肥澆水，促其抽薹。
2) 外植體選擇
于4月上旬半包球的RGMS05-632M5168系的植株抽薹初期，觀察植株花朵的 育性，選擇生長(zhǎng)健壯優(yōu)良的雄性不育植株的主花莖上著生的莖生葉片作為植 株再生離體培養(yǎng)的外植體。
3) 再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng) ①不定芽的誘導(dǎo)
采集RGMS05-632M5168系半成株雄性不育株花薹莖生葉片后帶回實(shí)驗(yàn)室， 先用流水沖洗3次，再在超凈工作上用75%酒精浸泡50秒，0. 1%升汞消毒10分、 無菌水沖洗3遍，然后將葉片切成邊長(zhǎng)為lcm的正方形方塊后，葉背朝下，接 種于MS培養(yǎng)基中，其中含3%蔗糖(質(zhì)量比)、0.8%瓊脂(質(zhì)量比)、3.0mg/L的 6-芐基腺嘌呤(6-BA)及0.2 mg/L的2，4-二氯化苯氧基乙酸(2， 4_D)。在溫 度25X:，每天光照12h，光照強(qiáng)度2000Lx條件下培養(yǎng)，經(jīng)50天誘導(dǎo)出不定芽。根據(jù)秋季田間(露地)適宜定植時(shí)間(陜西定植時(shí)間為8月下旬)，可繼代1 3代，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。甘藍(lán)雄性不育系的莖生葉的誘芽率90.5%，分化率130%。
② 不定根的誘導(dǎo)
待RGMS05-632M5168莖生葉片的不定芽生長(zhǎng)至3. Ocm高時(shí)，自不定芽基 部切下將其轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的生根培養(yǎng)基上，生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，其中含 3%蔗糖(質(zhì)量比)、0. 8%瓊脂(質(zhì)量比)和0. 5 mg/L的a -萘乙酸(NAA)， 0.2mg/L 吲哚乙酸(IAA)。在溫度25°C，每天光照10h，光照強(qiáng)度2000Lx的條件下 培養(yǎng)，經(jīng)15天誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)出生根苗，生根率100%。
③ 生根苗移栽
將生根苗的培養(yǎng)瓶口打開鍛煉5天，從培養(yǎng)瓶中取出生根苗，移植到裝 有營(yíng)養(yǎng)土的塑料缽中促使其緩苗生長(zhǎng)。在8月下旬，當(dāng)生根苗有5 7片真葉 時(shí)，適應(yīng)性煉苗7天后定植于田間(露地)。秧苗成活率97%，以后管理同于 常規(guī)田間(露地)管理。
ii
權(quán)利要求
1.一種保持甘藍(lán)RGMS雄性不育系的繁殖方法，其特征在于，包括下列步驟1)外植體選擇以甘藍(lán)RGMS雄性不育系的不育株msms授可育株Msms花粉后收獲的種子，適宜時(shí)期播種育苗定植，秋季培養(yǎng)為成株或半成株，翌年植株生殖生長(zhǎng)抽薹進(jìn)入初花期，根據(jù)花朵雄蕊退化的指示性狀，選擇雄性不育植株花莖上著生的莖生葉片，切成邊長(zhǎng)為0.8～1.0厘米的小片作為離體培養(yǎng)的外植體；2)莖生葉片的分化誘導(dǎo)把外植體接種到MS培養(yǎng)基上，在溫度25±1℃，每天光照14～16h，光照強(qiáng)度2000～2500Lx條件下培養(yǎng)40～50天誘導(dǎo)出叢生芽；叢生芽的繼代增殖將誘導(dǎo)產(chǎn)生的叢生芽切割成單芽轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)25～30天誘導(dǎo)出叢生芽，再將叢生芽切割成單芽在MS培養(yǎng)基上繼代2～3代，芽的數(shù)量得到100倍以上增殖；上述的MS培養(yǎng)基中含質(zhì)量百分比為3％蔗糖、0.8％瓊脂，1.0～2.0mg/L的6-芐基腺嘌呤及0.1～0.2mg/L的2，4-二氯化苯氧基乙酸；3)分化芽的生根誘導(dǎo)待叢生芽生長(zhǎng)至2.0～4.0cm高，自單芽基部切下將其轉(zhuǎn)接至1/2MS培養(yǎng)基上，在溫度25±1℃，每天光照10h～12h，光照強(qiáng)度2000～2500Lx的條件下培養(yǎng)15～20天誘導(dǎo)生根，獲得生根苗；上述的1/2MS培養(yǎng)基中含質(zhì)量百分比為3％蔗糖、0.8％瓊脂，0.1～0.3mg/L的α-萘乙酸、0.1～0.2mg/L吲哚乙酸；4)生根苗的移栽與定植將生根苗鍛煉3～5天，移植到裝有土壤的塑料缽中促使其緩苗生長(zhǎng)，在甘藍(lán)RGMS雄性不育系的適宜制種期將長(zhǎng)有6～8片真葉的再生苗定植。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種保持甘藍(lán)RGMS雄性不育系的繁殖方法，選取甘藍(lán)雄性不育系花莖葉片，按照一定大小接種在不定芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，當(dāng)不定芽生長(zhǎng)至2.0～4.0cm高時(shí)，轉(zhuǎn)接到不定根分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得完整再生苗。隨后將再生苗移至培養(yǎng)土中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)幼苗生長(zhǎng)有6～8片真葉時(shí)，適應(yīng)性煉苗3～5天后定植于田間(露地)，秧苗成活率達(dá)95％以上。采用本發(fā)明方法能夠提高甘藍(lán)育種效果，保證并擴(kuò)大了甘藍(lán)雄性不育性的正常繁育?？朔烁仕{(lán)雄性不育性田間正常繁育的繁瑣，不但保持了不育系，并且大幅度提高了其繁殖系數(shù)，為大量制種提供了保證。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101564009SQ20091002281
公開日2009年10月28日 申請(qǐng)日期2009年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月3日
發(fā)明者輝 劉, 張恩慧, 張高翔, 楊安平, 王小艷, 程永安, 許忠民, 許念芳, 馬青山 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)