專利名稱：克服三葉草品種基因型障礙高頻體胚再生培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豆科牧草的高頻體胚再生培養(yǎng)方法，更具體的講涉及一種克服三 葉草品種基因型障礙高頻體胚再生培養(yǎng)方法，屬于植物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
三葉草(Clover)是一種世界性分布與栽培的優(yōu)良豆科牧草，是溫帶地區(qū)人工草 地建植的首選草種，也是各類觀賞性草坪和綠地的主要組分，它在城鎮(zhèn)的綠化、美化、果園 林木的固氮培肥地力、道路提壩的水土保持等方面均起著不可替代的重要作用。鑒于三葉 草的重要經(jīng)濟價值，許多發(fā)達國家紛紛利用生物技術(shù)方法來研究改良三葉草，解決三葉草 生產(chǎn)中存在的問題。三葉草是個異質(zhì)雜合體，自交不親和，目前世界各國應(yīng)用的品種80%以上為綜合 品種，品種內(nèi)基因型差異很大，三葉草一些重要的育種目標(biāo)很難通過常規(guī)育種方法達到，如 三葉草抗旱耐鹽、抗病抗蟲、提高種子及草產(chǎn)量、固氮能力等都達不到理想的效果，因此近 年來，人們試圖通過現(xiàn)代基因工程技術(shù)，即通過轉(zhuǎn)基因獲得抗性植株來培育三葉草新品種， 提高三葉草對各種生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)性，但作為這種技術(shù)能成功應(yīng)用的前提條件是三葉草在 其組織培養(yǎng)過程中具有高頻體胚再生能力，這一直是一個難以克服的問題。三葉草屬植物組織培養(yǎng)再生技術(shù)的研究始于20世紀70年代，已有的一些報道表 明，大部分三葉草的組織培養(yǎng)再生率都極低，只有1 %甚至更小，且再生過程較長，一般需 4 6個月左右，再生性和再生頻率易受基因型影響，這已經(jīng)成為限制不同基因型，尤其是 優(yōu)良品種轉(zhuǎn)基因的瓶頸。Nancy和Jerzy 1989年通過紅三葉葉柄愈傷組織的誘導(dǎo)，獲得了 70 81%的植株再生率；Quesenberry和Smithl993年報道了紅三葉再生技術(shù)的研究，大 約有4%的植株再生率比較高，若在這4%再生率高的植株中再進一步篩選和再生，植株的 再生力會提高到70%。三葉草再生體系的建立多是通過器官發(fā)生途徑，很少有從體細胞胚 胎發(fā)生途徑建立的報道，更未見有適宜于三葉草基因轉(zhuǎn)化的高頻率體細胞胚再生組織培養(yǎng) 技術(shù)體系的報道。由于體細胞胚是克隆起源的，體胚發(fā)生途徑更能保證轉(zhuǎn)基因植物的遺傳 一致性(不形成嵌合體)，使外源基因可通過花粉和配子傳遞給后代。所以，體胚再生技術(shù) 是植物組織培養(yǎng)中最有吸引力的方法，被廣泛應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化、體細胞變異系的篩選寸。先前的研究者大多只選擇了 1個種的1 3個品種為材料，由于研究的品種數(shù)量 少，不具代表性，這些研究均難以解決三葉草不同品種及基因型障礙的問題。因此，建立三 葉草不受品種及基因型限制的高頻體胚再生培養(yǎng)體系是獲得各類品種三葉草轉(zhuǎn)基因成功 的重要前提。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可有效提高體細胞胚發(fā)生 頻率和再生植株頻率的克服三葉草品種基因型障礙高頻體胚再生培養(yǎng)方法。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種克服三葉草品種基因型障礙高頻體胚再生培養(yǎng)方法，包括以下步驟(1)選材三葉草成熟種子經(jīng)沖洗、消毒殺菌、干燥后，在幼苗生長馴化培養(yǎng)基上 培養(yǎng)無菌苗，選取萌發(fā)后的無菌苗的上胚軸、下胚軸和再生植株葉片三種外植體；(2)胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)將上述選取的外植體接種于胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng) 基上，在白天室溫27 士 2 °C、夜晚室溫20 士 1 °C的條件下暗培養(yǎng)28 30天；(3)胚繼代形成培養(yǎng)將上述經(jīng)胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)后的外植體接種于胚 繼代形成培養(yǎng)基上，首先進行5天的4 6°C低溫人工氣候箱暗培養(yǎng)，然后在白天室溫 27 士 2°C、夜晚室溫20 士 1 °C的條件下暗培養(yǎng)30-35天；(4)胚成熟萌發(fā)成苗培養(yǎng)將上述經(jīng)胚繼代形成培養(yǎng)后的外植體接種于胚成熟萌 發(fā)成苗培養(yǎng)基上，在白天室溫27士2°C、夜晚20士 1°C、光照強度為1000 15001x的條件下 進行14h/d的光培養(yǎng)20 25天，形成幼苗；(5)壯苗生根培養(yǎng)將上述經(jīng)胚成熟萌發(fā)成苗培養(yǎng)后的幼苗轉(zhuǎn)接到幼苗生長馴化 培養(yǎng)基上進行壯苗生根培養(yǎng)，形成生根的再生植株；(6)生根的再生植株移栽、成活；所述的幼苗生長馴化培養(yǎng)基為1/2改良MS+20g/L白糖+0. 7%瓊脂；所述的胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良SH+8 12mg/L 2,4-D+O. 2 0. 5mg/ L 6-BA+30g/L 蔗糖+0. 3% phytagel ；所述的胚繼代形成培養(yǎng)基為改良SH+2 8mg/L 2,4-D+O. 2 0. 5mg/ L6-BA+50g/L 蔗糖 +0. 35% phytagel ；所述的胚成熟萌發(fā)成苗培養(yǎng)基為改良MS+30g/L白糖+0. 7%瓊脂。上述的改良SH包括常量營養(yǎng)元素、微量營養(yǎng)元素和有機試劑。其中常量營養(yǎng)元素的組分和其對應(yīng)的濃度如下硫酸銨463mg/L;硝酸鉀2830mg/L ；二水氯化鈣166mg/L七水硫酸鎂185mg/L無水磷酸二氫鉀400mg/L乙二胺四乙酸鐵鈉鹽1.4mg/L。微量營養(yǎng)元素的組分和其對應(yīng)的濃度如下一水硫酸錳10mg/L ；硫酸鋅1. Omg/L硼酸5. Omg/L碘化鉀1. Omg/L鉬酸鈉0. lmg/L硫酸銅0. 2mg/L氯化鈷0. lmg/L。有機試劑的組分和其對應(yīng)的濃度如下鹽酸硫胺素5. Omg/L ；
5
煙酸5. Omg/L ；鹽酸吡哆醇5. Omg/L。上述的改良MS培養(yǎng)基包括常量營養(yǎng)元素、微量營養(yǎng)元素和有機試劑。其中常量營養(yǎng)元素的組分和其對應(yīng)的濃度如下硫酸銨1650mg/L;硝酸鉀1900mg/L ；七水硫酸鎂370mg/L ；無水磷酸二氫鉀170mg/L ；二水氯化鈣440mg/L ；乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L;七水硫酸亞鐵27. 8mg/L。微量營養(yǎng)元素的組分和其對應(yīng)的濃度如下四水硫酸錳22. 3mg/L ；硫酸鋅8. 6mg/L ；硼酸6.2mg/L;碘化鉀0. 83mg/L ；鉬酸鈉0. 25mg/L ；硫酸銅0. 025mg/L ；氯化鈷0. 025mg/L。有機試劑的組分和其對應(yīng)的濃度如下鹽酸硫胺素1. Omg/L ；煙酸1. Omg/L ；鹽酸吡哆醇1. Omg/L ；肌醇100mg/L。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明通過選擇適宜外植體、改良基本培養(yǎng)基及成分、調(diào)整 培養(yǎng)條件等配套措施，有效地克服了三葉草高頻體胚再生培養(yǎng)中不同品種及基因型障礙問 題，大幅度提高體細胞胚發(fā)生頻率和再生植株頻率。建立三葉草高頻體胚再生技術(shù)體系是 保證三葉草體細胞誘導(dǎo)變異、高效穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化、獲得大量可供篩選的目標(biāo)植株的前提條 件，通過優(yōu)化簡化三葉草體細胞胚胎發(fā)生和植株再生培養(yǎng)基和技術(shù)體系，能有效的發(fā)揮轉(zhuǎn) 基因等生物技術(shù)在三葉草現(xiàn)代育種中的作用，提高育種效率。


圖1為三葉草外植體在胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的胚型細胞；圖2為雜三葉在 胚繼代形成培養(yǎng)基上發(fā)育的體細胞胚；圖3為紅三葉在胚繼代形成培養(yǎng)基上發(fā)育的體細胞胚；圖4為白三葉在胚繼代形成培養(yǎng)基上發(fā)育的體細胞胚；圖5為體細胞胚在胚成熟萌發(fā)成苗培養(yǎng)基上發(fā)育成的魚雷胚；圖6為體細胞胚在胚成熟萌發(fā)成苗培養(yǎng)基上發(fā)育成的子葉胚；圖7為魚雷胚繼代培養(yǎng)萌發(fā)成的分化小苗；
圖8為子葉胚繼代培養(yǎng)萌發(fā)成的分化小苗；圖9為魚雷胚的分化小苗發(fā)育成的幼苗；圖10為子葉胚的分化小苗發(fā)育成的幼苗。
具體實施例方式下面將結(jié)合附圖和具體實施例，詳細說明本發(fā)明的
具體實施例方式圖1為三葉草外植體在胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的胚型細胞；圖2為雜 三葉在胚繼代形成培養(yǎng)基上發(fā)育的體細胞胚；圖3為紅三葉在胚繼代形成培養(yǎng)基上發(fā)育的 體細胞胚；圖4為白三葉在胚繼代形成培養(yǎng)基上發(fā)育的體細胞胚；圖5為體細胞胚在胚成 熟萌發(fā)成苗培養(yǎng)基上發(fā)育成的魚雷胚；圖6為體細胞胚在胚成熟萌發(fā)成苗培養(yǎng)基上發(fā)育成 的子葉胚；圖7為魚雷胚繼代培養(yǎng)萌發(fā)成的分化小苗；圖8為子葉胚繼代培養(yǎng)萌發(fā)成的分 化小苗；圖9為魚雷胚的分化小苗發(fā)育成的幼苗；圖10為子葉胚的分化小苗發(fā)育成的幼田ο如圖1-圖10所示—種克服三葉草品種基因型障礙高頻體胚再生培養(yǎng)方法，包括以下步驟(1)選材選擇11個品種，即白三葉(包括鋪地、考拉、拉丁諾、飛毯、百霸、海發(fā)、 愛麗思、胡依阿、瑞文德9個品種)、紅三葉(瑞得)和雜三葉；用流水沖洗上述種子約1 2h，在無菌室用75%酒精消毒20 30秒，無菌水洗 3 5次，0. 1 %升汞消毒6 8分鐘，用無菌水沖洗5次，滅菌濾紙吸干水分，接種于幼苗生 長馴化培養(yǎng)基上；取上述萌發(fā)5-6天的無菌苗上、下胚軸剪成3 4mm長的小段，再生葉片在距葉基 部2/3處垂直主脈切割，帶葉柄部分，再垂直主脈橫切2刀，造成傷口，莖包括莖柄，這些材 料作為外植體(共360個)，接種于胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(2)胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)將上述選取的外植體接種于胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng) 基上，在白天室溫27 士 2 °C、夜晚室溫20 士 1 °C的條件下暗培養(yǎng)28 30天；(3)胚繼代形成培養(yǎng)將上述經(jīng)胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)后的外植體接種于胚 繼代形成培養(yǎng)基上，首先進行5天的4 6°C低溫人工氣候箱暗培養(yǎng)，然后在白天室溫 27 士 2°C、夜晚室溫20 士 1 °C的條件下暗培養(yǎng)30-35天；(4)胚成熟萌發(fā)成苗培養(yǎng)將上述經(jīng)胚繼代形成培養(yǎng)后的外植體接種于胚成熟萌 發(fā)成苗培養(yǎng)基上，在白天室溫27士2°C、夜晚20士 1°C、光照強度為1000 15001x的條件下 進行14h/d的光培養(yǎng)20 25天，形成幼苗；(5)壯苗生根培養(yǎng)將上述經(jīng)胚成熟萌發(fā)成苗培養(yǎng)后的幼苗轉(zhuǎn)接到幼苗生長馴化 培養(yǎng)基上進行壯苗生根培養(yǎng)，形成生根的再生植株；(6)將生根的再生植株移栽到溫室小花盆中，花盆中的土體的組分及重量百分比 泥炭土 園土 = 7 3，移栽后每天澆水1 2次，待苗成活后逐漸減少澆水次數(shù)；上述的幼苗生長馴化培養(yǎng)基為=IA改良MS+20g/L白糖+0. 7%瓊脂；上述的胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良SH+8 12mg/L 2，4-D+0. 2 0. 5mg/ L 6-BA+30g/L 蔗糖 +0. 3% phytagel ；上述的胚繼代形成培養(yǎng)基為改良SH+2 8mg/L 2，4-D+0. 2 0. 5mg/L6-BA+50g/L 蔗糖 +0. 35% phytagel ；
0087]
0088]
0089]
0090]
0091]
0092]
0093]
0094]
0095]
0096]
0097]
0098]
0099]
0100] 0101] 0102]
0103]
0104]
0105]
0106]
0107]
0108]
0109]
0110] 0111] 0112]
0113]
0114]
0115]
0116]
0117]
0118]
0119]
0120] 0121] 0122]
0123]
0124]
上述的胚成熟萌發(fā)成苗培養(yǎng)基為改良MS+30g/L白糖+0. 7%瓊脂, 上述的改良SH包括常量營養(yǎng)元素、微量營養(yǎng)元素和有機試劑。 其中常量營養(yǎng)元素的組分和其對應(yīng)的濃度如下
硫酸銨 硝酸鉀 二水氯化鈣 七水硫酸鎂 無水磷酸二氫鉀 乙二胺四乙酸鐵鈉鹽
463mg/L ； 2830mg/L ； 166mg/L 185mg/L 400mg/L 1. 4mg/L。
微量營養(yǎng)元素的組分和其對應(yīng)的濃度如下 一水硫酸錳10mg/L ；
硫酸鋅1. Omg/L
硼酸5. Omg/L
碘化鉀1. Omg/L
鉬酸鈉0. lmg/L
硫酸銅0. 2mg/L
氯化鈷0. lmg/L。
有機試劑的組分和其對應(yīng)的濃度如下 鹽酸硫胺素5. Omg/L ；
煙酸5. 0mg/L ；
鹽酸吡哆醇5. 0mg/L。
上述的改良MS培養(yǎng)基包括常量營養(yǎng)元素、微量營養(yǎng)元素和有機試劑。 其中常量營養(yǎng)元素的組分和其對應(yīng)的濃度如下
硫酸銨 硝酸鉀 七水硫酸鎂 無水磷酸二氫鉀 二水氯化鈣 乙二胺四乙酸二鈉 七水硫酸亞鐵
1650mg/L ； 1900mg/L ； 370mg/L 170mg/L 440mg/L 37. 3mg/L ； 27. 8mg/L。
微量營養(yǎng)元素的組分和其對應(yīng)的濃度如下
四水硫酸錳
硫酸鋅
硼酸
碘化鉀
鉬酸鈉
硫酸銅
氯化鈷
22. 3mg/L ； 8. 6mg/L ； 6. 2mg/L ； 0. 83mg/L ； 0. 25mg/L ； 0. 025mg/L ； 0. 025mg/Lo
有機試劑的組分和其對應(yīng)的濃度如下鹽酸硫胺素l.Omg/L;煙酸l.Omg/L; 鹽酸吡哆醇l.Omg/L;肌醇100mg/L。在具體的實施例中，植物生長調(diào)節(jié)劑的組合分別為實施例1A.胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(改良SH+8mg/L 2,4-D+O. 2mg/L 6_BA+30g/L蔗糖 +0. 3% phytagel)+B.胚繼代形成培養(yǎng)基(改良 SH+8mg/L 2,4-D+O. 2mg/L 6_BA+50g/L 蔗 糖+0.35% phytageD+C.胚成熟萌發(fā)成苗培養(yǎng)基(改良MS+30g/L白糖+0. 7 %瓊脂)+D. 幼苗生長馴化培養(yǎng)基(1/2改良MS+20g/L白糖+0.7%瓊脂)，上述所有培養(yǎng)基高壓滅菌后 pH在5. 8左右。實施例2A.胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(改良SH+8mg/L 2,4-D+O. 5mg/L 6_BA+30g/L蔗糖 +0. 3% phytagel)+B.胚繼代形成培養(yǎng)基(改良 SH+8mg/L 2,4-D+O. 5mg/L 6_BA+50g/L 蔗 糖+0.35% phytageD+C.胚成熟萌發(fā)成苗培養(yǎng)基(改良MS+30g/L白糖+0. 7 %瓊脂)+D. 幼苗生長馴化培養(yǎng)基(1/2改良MS+20g/L白糖+0.7%瓊脂)，上述所有培養(yǎng)基高壓滅菌后 pH在5. 8左右。實施例3A.胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(改良SH+10mg/L 2,4-D+O. 2mg/L 6_BA+30g/L蔗 糖 +0. 3% phytagel)+B.胚繼代形成培養(yǎng)基(改良 SH+5mg/L 2,4-D+O. 2mg/L 6_BA+50g/L 蔗糖+0. 35%phytagel)+C.胚成熟萌發(fā)成苗培養(yǎng)基(改良MS+30g/L白糖+0. 7%瓊脂)+D. 幼苗生長馴化培養(yǎng)基(1/2改良MS+20g/L白糖+0. 7%瓊脂)，上述所有培養(yǎng)基高壓滅菌后 pH在5. 8左右。實施例4A.胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(改良SH+10mg/L 2,4-D+O. 5mg/L 6_BA+30g/L蔗 糖 +0. 3% phytagel)+B.胚繼代形成培養(yǎng)基(改良 SH+5mg/L 2,4-D+O. 5mg/L 6_BA+50g/L 蔗糖+0. 35%phytagel)+C.胚成熟萌發(fā)成苗培養(yǎng)基(改良MS+30g/L白糖+0. 7%瓊脂)+D. 幼苗生長馴化培養(yǎng)基(1/2改良MS+20g/L白糖+0. 7%瓊脂)，上述所有培養(yǎng)基高壓滅菌后 pH在5. 8左右。實施例5A.胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(改良SH+12mg/L 2,4-D+O. 2mg/L 6_BA+30g/L蔗 糖 +0. 3% phytagel)+B.胚繼代形成培養(yǎng)基(改良 SH+2mg/L 2,4-D+O. 2mg/L 6_BA+50g/L 蔗糖+0. 35%phytagel)+C.胚成熟萌發(fā)成苗培養(yǎng)基(改良MS+30g/L白糖+0. 7%瓊脂)+D. 幼苗生長馴化培養(yǎng)基(1/2改良MS+20g/L白糖+0. 7%瓊脂)，上述所有培養(yǎng)基高壓滅菌后 pH在5. 8左右。實施例6A.胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(改良SH+12mg/L 2,4-D+O. 5mg/L 6_BA+30g/L蔗 糖 +0. 3% phytagel)+B.胚繼代形成培養(yǎng)基(改良 SH+2mg/L 2,4-D+O. 5mg/L 6_BA+50g/L蔗糖+0. 35%phytagel)+C.胚成熟萌發(fā)成苗培養(yǎng)基(改良MS+30g/L白糖+0. 7%瓊脂)+D. 幼苗生長馴化培養(yǎng)基(1/2改良MS+20g/L白糖+0. 7%瓊脂)，上述所有培養(yǎng)基高壓滅菌后 pH在5. 8左右。 將上述360個外植體分別在6個實施例所述的植物生長調(diào)節(jié)劑組合上進行胚發(fā)生 愈傷組織誘導(dǎo)、胚繼代形成培養(yǎng)、壯苗生根培養(yǎng)、再生植株移栽。如圖1所示在上述的胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)步驟，通過顯微觀察看到外植體的愈 傷組織表面形成一些突起，突起細胞質(zhì)濃，與周圍細胞分開，有明顯界限，說明這些分裂迅 速的細胞是胚性細胞，且在上述6種組合的胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)基的實施例中都能獲得胚 發(fā)生愈傷組織，但胚愈傷組織最高誘導(dǎo)率均是在含有合適濃度的植物生長素或合適比率植 物生長素/細胞激動素的培養(yǎng)基上發(fā)生，過高的植物生長素或不合適的植物生長素/細 胞激動素比率均會降低外植體胚愈傷組織發(fā)生率，胚發(fā)生愈傷組織最有效的組合是2，4-D 10mg/L和6-BAO. 2mg/L，此組合易于大多數(shù)基因型誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的胚發(fā)生愈傷組織，上胚 軸和下胚軸胚愈傷組織發(fā)生率平均提高21 %以上(見表1)，可見只有植物生長素/細胞激 動素配比合適，才能促進胚愈傷組織產(chǎn)生和形成。如圖2至圖4所示在上述的胚繼代形成培養(yǎng)步驟，本實驗通過設(shè)置低溫-常溫處 理發(fā)現(xiàn)，在胚繼代形成培養(yǎng)前期經(jīng)過一定時間的低溫處理有利于胚繼代成熟，胚繼代形成 培養(yǎng)基的特點為降低2，4_D濃度，提高蔗糖和phytagel濃度。6個實施例結(jié)果表明適當(dāng) 降低2，4-D濃度，有利于體細胞胚形成，降低次生體細胞胚產(chǎn)生。6個實施例中，最有效的組 合是2，4-D 5mg/L和6-BA 0. 2mg/L，能較大幅度提高體細胞胚成熟率，使上、下胚軸胚狀體 分化率平均提高了 23%以上(見表2)，胚愈傷組織也不再增大變淺或出現(xiàn)褐化，雜三葉胚 愈傷組織表面出現(xiàn)較軟淺黃色愈傷，紅三葉胚愈傷組織內(nèi)外鑲嵌著許多綠色小硬核，這些 綠色小硬核以后發(fā)育成單個小植株，白三葉胚愈傷組織表面發(fā)育成較硬的團狀顆粒，即球 形胚，這些綠色小硬核或團狀顆粒就是正在發(fā)育的體細胞胚，當(dāng)長得比較大時可將其分割 培養(yǎng)進一步發(fā)育成單個小植株。如圖5-圖10所示在胚成熟萌發(fā)成苗培養(yǎng)步驟，將上述體細胞胚經(jīng)過50g/L蔗糖 和0. 35 % phytagel的培養(yǎng)基脫水處理后，會促進80 %的球形胚發(fā)育成魚雷胚和子葉胚，轉(zhuǎn) 接到改良MS+30g/L白糖+0.7%瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，會觀察到大量分化小苗，每個分化小苗 是由體細胞胚萌發(fā)而成，體細胞胚的萌發(fā)還包括胚根、胚軸伸長，子葉和真葉形成，最后發(fā) 育為自由生長的幼苗。在體細胞胚發(fā)育過程中，又以球形胚為最高，子葉分化期胚、成熟胚、香蕉形胚依 次降低，而以梨形胚為最低。表1外植體在實施例5中的胚愈傷組織發(fā)生率比較 表2外植體在改良MS上胚狀體分化率比較 比較11個品種不同基因型不同部位胚愈傷組織發(fā)生率和胚狀體分化率。結(jié)果見表3和表4:表3三葉草不同部位胚愈傷組織發(fā)生率比較 表4三葉草不同部位胚狀體分化率比較 從表1和表2中看出雜三葉上、下胚軸胚愈傷組織發(fā)生率和胚狀體分化率均最 高，飛毯和拉丁諾次之，紅三葉瑞得比它們稍差，11個品種上胚軸胚愈傷組織發(fā)生率依次為 雜三葉>飛毯>拉丁諾>瑞得>鋪地>考拉>海發(fā)>胡依阿>愛麗思>百霸>瑞文德；下 胚軸胚愈傷組織發(fā)生率依次為雜三葉>拉丁諾>瑞得>飛毯>考拉>鋪地>海發(fā)>胡依 阿> 百霸 > 愛麗思 > 瑞文德；上胚軸胚狀體分化率依次為雜三葉> 飛毯 > 拉丁諾 > 瑞得> 鋪地 > 考拉 > 胡依阿 > 海發(fā) > 愛麗思 > 百霸 >瑞文德；下胚軸胚狀體分化率依次為雜三葉 >拉丁諾>飛毯>瑞得>鋪地>考拉>海發(fā)>胡依阿>百霸>愛麗思>瑞文德；再生葉不 同品種胚愈傷組織發(fā)生率和胚狀體分化率均很高，均在90%以上，不同品種間差異很小。上 述結(jié)果說明上、下胚軸不同品種及基因型由于遺傳背景的不同，對培養(yǎng)條件反應(yīng)有一定的 差異，但在相對一致的培養(yǎng)條件下均能得到胚愈傷組織和胚狀體分化苗。 在三種三葉草11個品種各360粒種子的試驗中，上胚軸胚愈傷組織發(fā)生率平均達 到39. 7% ；下胚軸平均達到35. 3% ；再生葉片胚愈傷組織發(fā)生率平均達到92. 8% ；上胚軸胚狀體分化率平均達到34. 9%，下胚軸平均達到31.7%，再生葉片胚狀體分化率平均達到 92.8%。所有參試的品種均能獲得再生植株。通過選擇適宜外植體、改良基本培養(yǎng)基及成分、調(diào)整培養(yǎng)條件等配套措施，有效地 克服了三葉草高頻體胚再生培養(yǎng)中不同品種及基因型障礙問題，大幅度提高體細胞胚發(fā)生 頻率和再生植株頻率。以上已以較佳實施例公開了本發(fā)明，然其并非用以限制本發(fā)明，凡采用等同替換 或者等效變換方式所獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種克服三葉草品種基因型障礙高頻體胚再生培養(yǎng)基，包括幼苗生長馴化培養(yǎng)基、胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、胚繼代形成培養(yǎng)基和胚成熟萌發(fā)成苗培養(yǎng)基，其特征在于所述的幼苗生長馴化培養(yǎng)基為1/2改良MS+20g/L白糖+0.7％瓊脂；所述的胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良SH+8～12mg/L 2，4-D+0.2～0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+0.3％ phytagel；所述的胚繼代形成培養(yǎng)基為改良SH+2～8mg/L 2，4-D+0.2～0.5mg/L6-BA+50g/L蔗糖+0.35％ phytagel；所述的胚成熟萌發(fā)成苗培養(yǎng)基為改良MS+30g/L白糖+0.7％瓊脂。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克服三葉草品種基因型障礙高頻體胚再生培養(yǎng)基，其特征在 于所述的改良SH包括常量營養(yǎng)元素、微量營養(yǎng)元素和有機試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的克服三葉草品種基因型障礙高頻體胚再生培養(yǎng)基，其特征在 于所述的常量營養(yǎng)元素的組分和其對應(yīng)的濃度如下硫酸銨463mg/L ；硝酸鉀2830mg/L ；二水氯化鈣166mg/L ；七水硫酸鎂185mg/L ；無水磷酸二氫鉀400mg/L ；乙二胺四乙酸鐵鈉鹽1.4mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的克服三葉革品種基因型障礙高頻體胚再生培養(yǎng)方基，其特征 在于所述的微量營養(yǎng)元素的組分和其對應(yīng)的濃度如下一水硫酸錳10mg/L ；硫酸鋅1. Omg/L ；硼酸5. Omg/L ；碘化鉀1. Omg/L ；鉬酸鈉0. lmg/L ；硫酸銅0. 2mg/L ；氯化鈷0. lmg/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的克服三葉草品種基因型障礙高頻體胚再生培養(yǎng)基，其特征在 于所述的有機試劑的組分和其對應(yīng)的濃度如下鹽酸硫胺素5. Omg/L ；煙酸5. 0mg/L ；鹽酸吡哆醇5. 0mg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克服三葉草品種基因型障礙高頻體胚再生培養(yǎng)基，其特征在 于所述的改良MS培養(yǎng)基包括常量營養(yǎng)元素、微量營養(yǎng)元素和有機試劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的克服三葉草品種基因型障礙高頻體胚再生培養(yǎng)基，其特征在 于所述的常量營養(yǎng)元素的組分和其對應(yīng)的濃度如下硫酸銨1650mg/L ；硝酸鉀1900mg/L ；七水硫酸鎂370mg/L ；無水磷酸二氫鉀 170mg/L ； 二水氯化鈣440mg/L ；乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L; 七水硫酸亞鐵 27. 8mg/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的克服三葉草品種基因型障礙高頻體胚再生培養(yǎng)基，其特征在 于所述的微量營養(yǎng)元素的組分和其對應(yīng)的濃度如下四水硫酸錳22. 3mg/L ；硫酸鋅8. 6mg/L ；硼酸6. 2mg/L ；碘化鉀0. 83mg/L ；鉬酸鈉0. 25mg/L ；硫酸銅0. 025mg/L ；氯化鈷0.025mg/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的克服三葉草品種基因型障礙高頻體胚再生培養(yǎng)方基，其特征 在于所述的有機試劑的組分和其對應(yīng)的濃度如下鹽酸硫胺素1. Omg/L ；煙酸1. Omg/L ；鹽酸吡哆醇1. Omg/L ；肌醇100mg/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種克服三葉草品種基因型障礙高頻體胚再生培養(yǎng)基，包括幼苗生長馴化培養(yǎng)基、胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、胚繼代形成培養(yǎng)基和胚成熟萌發(fā)成苗培養(yǎng)基，幼苗生長馴化培養(yǎng)基為1/2改良MS+20g/L白糖+0.7％瓊脂；胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良SH+8～12mg/L 2，4-D+0.2～0.5mg/L6-BA+30g/L蔗糖+0.3％phytagel；胚繼代形成培養(yǎng)基為改良SH+2～8mg/L 2，4-D+0.2～0.5mg/L 6-BA+50g/L蔗糖+0.35％phytagel；胚成熟萌發(fā)成苗培養(yǎng)基為改良MS+30g/L白糖+0.7％瓊脂。本發(fā)明可有效地克服三葉草高頻體胚再生培養(yǎng)中不同品種及基因型障礙問題，大幅度提高體細胞胚發(fā)生頻率和再生植株頻率，提高育種效率。
文檔編號A01H4/00GK101861831SQ20091003497
公開日2010年10月20日 申請日期2009年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月16日
發(fā)明者師尚禮, 梁慧敏, 湯容娣, 王小春, 王永平, 鮑容靜 申請人:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院