專利名稱：色素萬壽菊的組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域的組織培養(yǎng)方法，具體是一種色素萬壽菊的組 織培養(yǎng)方法。
技術(shù)背景萬壽菊(Tagetes erecta)又名臭芙蓉，為菊科萬壽菊屬的一種，原產(chǎn)墨西哥 及美洲地區(qū),現(xiàn)世界各地均有栽培。按用途可將其分為觀賞萬壽菊和色素萬壽菊， 色素萬壽菊花瓣內(nèi)葉黃素含量極其豐富，是提取天然葉黃素的理想原料，葉黃素 可廣泛用于食品著色、醫(yī)藥及禽類詞料中，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來，國外萬壽菊品種選育方面取得了長足的進(jìn)展，而我國Fl代萬壽菊育 種尚處于起步階段， 一些涉及Fl制種技術(shù)如播種技術(shù)、育苗技術(shù)、親本識別方 法、授粉方法、父本和母本播種比例、種子采收時(shí)間及栽培范圍等雖己有報(bào)道， 但培育出與國外品種有競爭力的自主產(chǎn)權(quán)的品種還需時(shí)日，而通過常規(guī)的繁殖方 法如種子繁殖，則后代易發(fā)生變異；插扦繁殖則耗時(shí)長，短時(shí)期無論法獲得大量 種苗。我國被認(rèn)為是目前世界上最大的萬壽菊潛在消費(fèi)市場，對色素萬壽菊種子 的需求量大，除了加強(qiáng)制種技術(shù)的研制外，尋找及建立一種色素萬壽菊的快速繁 殖方法已成當(dāng)務(wù)之急，采用組織培養(yǎng)法對具有優(yōu)良品種特性的萬壽菊進(jìn)行快速繁 殖，在短期內(nèi)生產(chǎn)出大量整齊均勻的健壯種苗，建立一個(gè)高效的植株再生體系， 有利于種質(zhì)資源的保存和優(yōu)良品種的推廣，同時(shí)也為基因工程育種奠定了基礎(chǔ)。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，鄒永梅、黃雪芳在《江蘇林業(yè)科技》2005年32巻6期17 19頁發(fā)表了題 為"萬壽菊的組織培養(yǎng)和瓶苗開花研究"；蘇福才、錢國珍在《內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)學(xué) 院學(xué)報(bào)》1999年20巻3期第108 111頁發(fā)表了 "萬壽菊莖段組織培養(yǎng)"。但 兩學(xué)者所選取的外植體均為莖段，其取材范圍較窄；Marilyn M. Belarmino等在《.Japan. J. Breed》(日本育種雜志)1992 年42期第835 841頁發(fā)表了 " Callus induction and plant regeneration inAfrican Marigold (Tagetes erecta L.)"(非洲萬壽菊愈傷誘導(dǎo)與植物再生)一 文，該學(xué)者利用萬壽菊胚軸、葉片為外植體誘導(dǎo)植株再生，但利用葉片建立萬壽 菊再生體系未能成功；PratibhaMisra等在《In Vitro Cellular & Developmental Biology》 (離 體分子發(fā)育生物學(xué))2001年10期466發(fā)表了" Direct differentiation of shoot buds in leaf segments of white marigold (Tagetes erecta L).，，(白花萬壽 菊葉片直接誘導(dǎo)芽分化)一文，文中提到，利用白花萬壽菊葉片為外植體誘導(dǎo)了 植株再生，但可能由于品種基因型的差異，從預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果看，其結(jié)果不適宜用于F1色素萬壽菊植株再生；Pablo E, Vanegas等在《Plant Cell Tissue and Organ Culture》(植物 細(xì)胞組織與器官培養(yǎng))2002年69期第279 283頁發(fā)表了" Plant regeneration via organogenesis in marigold"(通過器官發(fā)生萬壽菊實(shí)現(xiàn)植株再生) 一文， 文中提到，利用萬壽菊葉片為外植體建立了再生體系，但是存在著不定芽誘導(dǎo)率 低的缺點(diǎn)(69.3%),同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在其條件下誘導(dǎo)植株再生，不定芽還存在著玻璃 化的傾向，不能發(fā)育成正常苗。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種色素萬壽菊的組織培養(yǎng)方 法。本發(fā)明的方法取材方便、可提供的材料充足，可高頻率地誘導(dǎo)出大量的萬壽 菊再生芽，再生植株成活率高，最高可達(dá)100%，而且具有再生植株變異小和遺 傳穩(wěn)定性較高的優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明為擴(kuò)大萬壽菊的繁殖系數(shù)、種質(zhì)保存及其遺傳轉(zhuǎn)化 奠定了良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，包括如下步驟-步驟一，取萬壽菊葉片，滅菌后誘導(dǎo)；誘導(dǎo)使用的分化培養(yǎng)基具體為MS基 本培養(yǎng)基，添加劑為3mg/L的6-BA， 3mg/L的IAA， 30g/L的蔗糖，6g/L的植 物凝膠；培養(yǎng)條件為溫度23 27。C，光照時(shí)間10h 20h / d，光照強(qiáng)度2000 30001ux，不定芽的誘導(dǎo)時(shí)間為9 14d;步驟二，將步驟一誘導(dǎo)得到的不定芽進(jìn)行繼代培養(yǎng)，使用的生長培養(yǎng)基與步 驟一中的分化培養(yǎng)基相同，培養(yǎng)條件為溫度23 27°C，光照時(shí)間10h 20h/d， 光照強(qiáng)度2000 30001ux，培養(yǎng)時(shí)間為30 50d;步驟三，將步驟二得到的分化伸長的芽進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)時(shí)間為30d，得到萬壽菊再生植株。步驟一中，所述滅菌具體為取生長45 60d萬壽菊植株的幼嫩葉片，用自 來水沖洗lmin，在超凈臺上用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精浸泡5 8s,用無菌水沖洗 3次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0°/。的次氯酸鈉溶液浸泡10s，再經(jīng)無菌水沖洗5次，將 消毒后的葉片切成0. 5cmX0. 5cm的小塊。步驟一中，所述培養(yǎng)條件具體為，光照時(shí)間為16h/d，光照強(qiáng)度為25001ux， 誘導(dǎo)時(shí)間為13d。步驟二中，所述培養(yǎng)條件具體為，光照時(shí)間為16h / d，光照強(qiáng)度為25001ux， 誘導(dǎo)時(shí)間為40d。本發(fā)明提供了一種萬壽菊組織培養(yǎng)方法，該方法是以葉片作為外植體，通過 器官發(fā)生途徑得到再生植株。本發(fā)明的方法取材方便、可提供的材料充足，可高頻率地誘導(dǎo)出大量的萬壽 菊再生芽，再生植株成活率高，最高可達(dá)100%，而且具有再生植株變異小和遺 傳穩(wěn)定性較高的優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明為擴(kuò)大萬壽菊的繁殖系數(shù)、種質(zhì)保存及其遺傳轉(zhuǎn)化 奠定了良好的基礎(chǔ)。


圖1為葉片外植體上誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽照片圖； 圖2為不定芽伸長30d后的植株照片圖； 圖3為萬壽菊再生苗照片圖。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案 為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于 下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件， 或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例本實(shí)施例的萬壽菊的組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟步驟一，取生長45 60d的萬壽菊植株(萬壽菊Fl代種子)的幼嫩葉片，用自 來水沖洗lmin，在超凈工作臺上用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精浸泡5 8、用無菌水 沖洗3次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 0%的次氯酸鈉溶液浸泡10s，再經(jīng)無菌水沖洗5次。 將消毒后的葉片切成0.5cmX0.5cm的小塊。之后進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)使用的分化培養(yǎng)基具體為MS基本培養(yǎng)基，添加劑為3mg/L的6-BA， 3mg/L的IAA， 30g/L 的蔗糖，6g/L的植物凝膠；培養(yǎng)條件為溫度23 27'C，光照時(shí)間為16h/d， 光照強(qiáng)度為25001ux，誘導(dǎo)時(shí)間為13d，誘導(dǎo)效果見圖l。其中，MS基本培養(yǎng)基 的配制可參照Murashige T， Skoog F.在《Physiol. Plant》(植物生理)1962 年15期473-497頁發(fā)表的《A revised medium for rapid grouth and bioassays with tobacco tissue cultures》(一種用于煙草組織培養(yǎng)中快速生長和生物測 定的優(yōu)化培養(yǎng)基) 一文，其配制方法相同。步驟二中，在超凈臺上將步驟一中誘導(dǎo)出的不定芽移至植物組織培養(yǎng)瓶中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，使用的生長培養(yǎng)基與步驟一中的分化培養(yǎng)基相同，培養(yǎng)條件為溫度23 27。C，光照時(shí)間為16h/d，光照強(qiáng)度為25001ux，誘導(dǎo)時(shí)間為40d，效果 見圖2。步驟三中，在超凈臺上將分化伸長的，已經(jīng)長出真葉，高約3cm植株轉(zhuǎn)移至 生根培養(yǎng)基上，即MS基本培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)條件具體為，光照時(shí)間為16h/d， 光照強(qiáng)度為25001ux， 30d后發(fā)育成完整植株，效果見圖3。對步驟三中經(jīng)生根培養(yǎng)后得到的再生苗進(jìn)行煉苗，待再生苗長出10 15片 真葉時(shí)，將其與空氣接觸，23 27'C下生長5 10d;然后用流水洗去再生苗根上的培養(yǎng)基，將其移栽到消毒栽培基質(zhì)(蛭石草炭=i : i，體積比)中培養(yǎng)，得到萬壽菊再生植株，成活率達(dá)100%。
權(quán)利要求
1、一種色素萬壽菊的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，取萬壽菊葉片，滅菌后誘導(dǎo)；誘導(dǎo)使用的分化培養(yǎng)基具體為MS基本培養(yǎng)基，添加劑為3mg/L的6-BA，3mg/L的IAA，30g/L的蔗糖，6g/L的植物凝膠；培養(yǎng)條件為溫度23～27℃，光照時(shí)間10h～20h/d，光照強(qiáng)度2000～30001ux，不定芽的誘導(dǎo)時(shí)間為9～14d；步驟二，將步驟一誘導(dǎo)得到的不定芽進(jìn)行繼代培養(yǎng)，使用的生長培養(yǎng)基與步驟一中的分化培養(yǎng)基相同，培養(yǎng)條件為溫度23～27℃，光照時(shí)間10h～20h/d，光照強(qiáng)度2000～30001ux，培養(yǎng)時(shí)間為30～50d；步驟三，將步驟二得到的分化伸長的芽進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)時(shí)間為30d，得到萬壽菊再生植株。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的色素萬壽菊的組織培養(yǎng)方法，其特征是，步驟一 中，所述滅菌具體為取生長45 60d萬壽菊植株的幼嫩葉片，用自來水沖洗 lmin，用體積分?jǐn)?shù)為75。/。的酒精浸泡5 8s，用無菌水沖洗3次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為1.0%的次氯酸鈉溶液浸泡10、再經(jīng)無菌水沖洗5次，將消毒后的葉片切成 0. 5cmX0. 5cm的小塊。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的色素萬壽菊的組織培養(yǎng)方法，其特征是，步驟一 中，所述培養(yǎng)條件具體為，光照時(shí)間為16h/d，光照強(qiáng)度為25001ux，誘導(dǎo)時(shí)間 為13d。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的色素萬壽菊的組織培養(yǎng)方法，其特征是，步驟二 中，所述培養(yǎng)條件具體為，光照時(shí)間為16h/d，光照強(qiáng)度為25001ux，誘導(dǎo)時(shí)間 為40d。
全文摘要
一種生物技術(shù)領(lǐng)域的色素萬壽菊的組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟取萬壽菊葉片，滅菌后誘導(dǎo)；誘導(dǎo)使用的分化培養(yǎng)基具體為MS基本培養(yǎng)基，添加劑為3mg/L的6-BA，3mg/L的IAA，30g/L的蔗糖，6g/L的植物凝膠；培養(yǎng)條件為溫度23～27℃，光照時(shí)間10h～20h/d，光照強(qiáng)度2000～3000lux，不定芽的誘導(dǎo)時(shí)間為9～14d；將分化出的不定芽繼代培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽生長培養(yǎng)基與步驟一中的分化培養(yǎng)基相同，培養(yǎng)條件為溫度23～27℃，光照時(shí)間10h～20h/d，光照強(qiáng)度2000～3000lux，培養(yǎng)時(shí)間為30～50d；將分化伸長的芽進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)時(shí)間為30d，得到萬壽菊再生植株。本發(fā)明的方法取材方便、可高頻率地誘導(dǎo)出大量的萬壽菊再生芽，再生植株成活率高，再生植株變異小和遺傳穩(wěn)定性較高。
文檔編號A01H4/00GK101543185SQ20091005045
公開日2009年9月30日 申請日期2009年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月30日
發(fā)明者唐克軒, 佳 孫, 張永強(qiáng), 麗 曾, 帆 楊, 趙子剛 申請人:上海交通大學(xué)