專利名稱：：一種豬源植物乳桿菌凍干制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物及其應(yīng)用領(lǐng)域，尤其涉及一種豬源物乳桿菌凍干制劑及其制備方法
背景技術(shù)：
：在動物體內(nèi)棲息著數(shù)百種的細(xì)菌，其數(shù)量超過百萬億個，其中對動物健康有益的叫益生菌，以乳酸菌、雙歧桿菌為代表，對人體和動物有害的叫有害菌。當(dāng)益生菌占優(yōu)勢時(占總數(shù)的80%以上)，動物保持健康狀態(tài)，否則處于亞健康或非健康狀態(tài)。長期以來，養(yǎng)殖者們往往只局限于眼前的經(jīng)濟效益，在飼料中盲目添加抗生素，這不僅殺滅了有害菌，同時也抑殺了有益菌，導(dǎo)致腸道微生態(tài)系統(tǒng)處于菌群失調(diào)狀態(tài)。近年來的科學(xué)研究結(jié)果證明，在飼料中添加益生菌制劑可以起到與抗生素完全相反的作用，它可以抑制有害菌的數(shù)量，增加有益菌的數(shù)量，起到維持腸道微生態(tài)系統(tǒng)平衡的作用。其中，以乳酸菌為代表的益生菌制劑是應(yīng)用最多、最為廣泛的一類，眾所周知，乳酸菌是動物必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，它們數(shù)量的多和少，直接影響動物的健康。目前已有大量研究報道這類益生菌制劑具有良好的生物學(xué)功能，被證實在臨床上能夠治療和預(yù)防動物的某些腸道疾病或者起保健作用，并已在飼料業(yè)中被廣泛應(yīng)用。植物乳桿菌aacto^cz7/wp/朋tor鵬)是普遍存在于人和動物腸道的有益乳酸桿菌，它屬于兼性異型乳酸發(fā)酵菌，是乳酸桿菌屬中重要的種群之一。研究表明植物乳桿菌可定植于動物腸道內(nèi)，代謝可產(chǎn)生乳酸、乙酸等物質(zhì)，有抑制腸道有害菌生長和繁殖的作用，能夠發(fā)酵多種碳水化合物，如單糖(葡萄糖、甘露糖、半乳糖等)、雙糖(蔗糖、乳糖、海藻糖等)、低聚糖(棉籽糖、松三糖等)，是我國農(nóng)業(yè)部允許使用的飼料級微生物菌種之一。目前市場上已經(jīng)涌現(xiàn)出大量此類益生菌產(chǎn)品，但由于新的乳酸菌產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)尚不完善，產(chǎn)品存在著質(zhì)量不穩(wěn)定，活菌數(shù)低、穩(wěn)定性差等問題，制成凍干制劑是將菌穩(wěn)定保存的一種有效的方法，由于乳酸菌在冷凍干燥過程中易造成部分細(xì)胞的損傷、死亡及某些酶蛋白分子的鈍化，許多研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌在凍干前加入適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)凍干保護劑可以減輕或防止冷凍和干燥兩個過程對細(xì)胞的損害，從而對菌體起到保護作用，由于乳酸菌具有種屬特異性，即使在相同的外部條件下，不同來源的同種菌在凍干過程中也可能表現(xiàn)出不同的特性，目前尚無效果優(yōu)良且適合添加到動物詞料的植物乳桿菌凍干制劑，有些凍干制劑配方雖然凍干后的細(xì)菌存活率高，但保存穩(wěn)定性差，在生產(chǎn)運輸包裝的過程中容易失活，導(dǎo)致添加到飼料中后難以發(fā)揮自身的優(yōu)異特性。有些研究凍干保護劑的報道如2008年李家鵬等人(《響應(yīng)面發(fā)優(yōu)化植物乳桿菌冷凍干燥保護劑配方的研究》，食品科學(xué)，2008，Vol.29，No.06)所公開的凍干保護劑的配方，能得到較高的菌存活率，但沒有報道其對于菌的保存穩(wěn)定性的效果，但凍干制劑的保存穩(wěn)定性非常重要，從制取凍干制劑到伺喂動物之前，凍干制劑中的活菌數(shù)取決于凍干保護劑提供的保存穩(wěn)定性，而活菌數(shù)是決定該菌的凍干制劑是否能發(fā)揮有益效果的關(guān)鍵。而且其配方的特性不適合于實際生產(chǎn)，實際生產(chǎn)中如中試水平以上的生產(chǎn)，所采用的配方既要保證菌存活率高、穩(wěn)定性好還要考慮到適應(yīng)生產(chǎn)設(shè)備、可操作性、產(chǎn)品得率等因素，該文獻提供的最優(yōu)配方采用海藻糖，需要的成本太高，因此也不適合生產(chǎn)成添加到詞料中的凍干制劑。上述諸多問題影響益生菌制劑在動物飼料中的應(yīng)用發(fā)展。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對上述領(lǐng)域的不足，提供一種豬源植物乳桿菌凍干制劑及其制備方法，該凍干制劑活菌數(shù)量高、保存穩(wěn)定性好，在直接飼喂及添加到飼料中都能充分發(fā)揮乳桿菌在動物體內(nèi)的生態(tài)平衡功能。一種豬源植物乳桿菌凍干制劑，其特征在丁-制備凍干制劑時所用的凍干保護劑的重量百分比為脫脂奶粉16%，谷氨酸鈉1.5%,L-半胱氨酸0.5%,乳糖2%，糊精10%，其余為水。所述豬源植物乳桿菌凍干制劑中活菌數(shù)^10'^fu/g。所述豬源植物乳桿菌來源于保育豬盲腸黏膜。上述的豬源植物乳桿菌凍干制劑的制備方法，步驟是將豬源植物乳桿菌菌液進行增菌培養(yǎng)，增菌培養(yǎng)液在6000rpra離心10min，取菌泥，加入凍干保護劑，凍干時間為20-28小時。所述凍干時間為26小時。所述增菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基重量百分比為胰蚩白胨0.5%，乳糖1%，酵母浸粉0.5%，乙酸鈉0.5%，磷酸氫二鉀0.2%，檸檬酸氫二銨0.2%，四水硫酸猛0.025%，七水硫酸鎂0.0058%，吐溫一800.1%，其余為水。所述增菌培養(yǎng)的參數(shù)為培養(yǎng)基的pH為6.46.5，植物乳桿菌接種量為1%，37"C培養(yǎng)24小時，轉(zhuǎn)速為100rpm。上述凍干制劑在動物詞料添加劑中的應(yīng)用。所述動物為豬。本發(fā)明為了使植物乳桿菌在動物飼料屮得到良好的應(yīng)用并充分發(fā)揮其益生菌的作用，提供一種凍干保護劑配方，將來源于豬的植物乳桿菌制成的凍干制劑添加到保育豬飼料中，進行33天的飼養(yǎng)試驗，證明0.3。/。植物乳桿菌+基礎(chǔ)日糧組表現(xiàn)出最好的效果，見表D，顯著超過詞用抗生素如金霉素的效果，說明在本發(fā)明提供的凍干保護劑中，植物乳桿菌有良好的存活率與保存穩(wěn)定性，能充分發(fā)揮降低豬腹瀉率、提高豬日增重和飼料利用率的功能。本發(fā)明通過大量實驗分析，從菌存活率與菌保存穩(wěn)定性兩方面綜合考察，獲得了一組使菌存活率高，且保存穩(wěn)定性高的凍干保護劑配方，其重量百分比為脫脂奶粉16%，谷氨酸鈉1.5%,L-半胱氨酸0.5%，乳糖2%，糊精10%，其余為水。選擇脫脂奶粉為懸浮物質(zhì)，脫脂奶粉能在菌體外形成蛋白膜，對細(xì)胞加以保護；乳糖是一種還原糖，它可以抑制質(zhì)膜的相變，對乳酸菌的凍干脫水其有顯著的保護作用，且成本低廉，適于實際生產(chǎn)使用研究表明，L-半胱氨酸對菌體的保護作用較好，可使細(xì)胞在冷凍前發(fā)生胞漿分離，并且在細(xì)胞壁與細(xì)胞膜間聚集而形成阻止冰晶形成的緩存帶，從而為細(xì)胞膜提供了機械保護；選用了易于溶于水的糊精，不需要加熱溶解，簡化了中試生產(chǎn)程序。屮試生產(chǎn)屮該凍干保護劑制得的凍干制劑中活菌數(shù)為10l2cfu/g，該凍干制劑在常溫保存12個月時其中活菌數(shù)仍然可以保持3.3X10^fu/g，良好的保存穩(wěn)定性以及適合的生產(chǎn)成本使其適于添加到常規(guī)生產(chǎn)的飼料中。本發(fā)明中增菌培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基采用專門的培養(yǎng)基，重量百分比優(yōu)選為胰蛋白胨0.5%，乳糖1%，酵母浸粉0.5%，乙酸鈉0.5%，磷酸氫二鉀0.2%，檸檬酸氫二銨0.2%，四水硫酸錳0.025%,七水硫酸鎂0.058%，吐溫一800.1%，其余為水，其增菌效果比普通MRS活菌數(shù)提高了2個數(shù)量級，見表8。由于本發(fā)明獲得的豬源植物乳桿菌凍干制劑的植物乳桿菌為普通動物腸道常見的益生菌，因此，該凍干制劑在動物飼料中都可以添加。由于本發(fā)明的植物乳桿菌來源為豬，因此優(yōu)選將該凍干制劑用于豬詞料中。綜h所述，本發(fā)明提供的豬源植物乳桿菌凍千制劑的凍干保護劑，能為植物乳桿菌提供良好的凍干保護，能得到較高的菌存活率與保存穩(wěn)定性，且生產(chǎn)工藝簡單，成本合理，使本發(fā)明的凍干制劑非常適于應(yīng)用到動物詞料中。具體實施例方式實施例1制備豬源植物乳桿菌凍干制劑步驟1豬源植物乳桿菌的分離鑒定無菌刮去健康保育豬腸道內(nèi)容物，以滅菌生理鹽水沖洗腸道，用載玻片刮取一定量的腸粘膜，稱取lg樣品，置于裝有99ml無菌生理鹽水的三角瓶中，將其分散均勻，吸取lml菌液于裝有9ml無菌生理鹽水的試管中此稀釋度為10—、重復(fù)以上過程，依次制成1(T2、IO一3、10—4、l(T5、10—6的菌液。選擇It)—4、IO-5、IO-6三個稀釋度，吸取O.lml菌液分別滴于MRS改良培養(yǎng)基平板上，采用燭缸法37t:培養(yǎng)2448h，挑取形態(tài)不同的菌落分別在其選擇培養(yǎng)基上劃線接種做純培養(yǎng)，而后置于4'C冰箱保存?zhèn)溆?。然后挑取純培養(yǎng)物進行染色，鏡檢；選取無芽孢革蘭氏陽性桿菌進行接觸酶、硝酸鹽還原、明膠液化等生化實驗，以及糖醇發(fā)酵試驗，結(jié)果與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》、《乳酸細(xì)菌分類及實驗方法》對照，確定菌種。然后送至中國工業(yè)微生物菌種保藏中心進行鑒定檢驗。分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明，該菌株與戊糖乳桿菌、植物乳桿菌相似性為99.7%，所依據(jù)基因序列見表l，進一歩進行生化鑒定其生化特性見表1最接近植物乳桿菌，確定該菌為植物乳桿菌。本發(fā)明所用的植物乳桿菌是豬盲腸粘膜上的常見菌，保存在北京市農(nóng)林科院畜牧所實驗室，可向公眾發(fā)放；采用常規(guī)方法或用歩驟一所述的方法分離并參照其生理生化特性進行鑒定也可獲得。表1植物乳桿茼分子生物學(xué)鑒定報告<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>751GGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAA801TGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTA851AGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTG901ACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGC951GAAAAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAAAGATTAGAC1001GTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCG1051TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATC1101GGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGC1151GGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGC1201TACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAA表2豬源植物乳桿菌生理生化特征試驗報告生理特征培養(yǎng)溫度rc)37°C需氧性厭氧耐鹽性INI)檸檬酸ND氧化酶一接觸酶_B引哚—硝酸鹽還原ND七葉靈水解+明膠液化—甘露醇+水楊苷+山梨醇+葡萄糖產(chǎn)氣ND葡萄糖+果糖+生化特征苦杏仁苷+乳糖+麥芽糖+蔗糖+甘露糖+棉籽糖+鼠李糖—阿拉伯糖+海藻糖+山梨糖一纖維二糖+核糖+木糖—松三糖+肝糖ND注表中"+"表7:^90%菌株呈陽性，"-"表示290%菌株呈陰性，"ND"表示未測定。步驟2豬源植物乳桿菌耐酸耐膽鹽特性將豬源植物乳桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，將菌液梯度稀釋，取10—5的稀釋液lml接種于含0.3%膽鹽的MRS平板和不含膽鹽的MRS平板涂板，置于37"培養(yǎng)48h，進行菌落計數(shù)，計算存活率。存活率(％)=(含0.3X膽鹽的MRS固體培養(yǎng)基中的活菌數(shù)/MRS固體培養(yǎng)基對照中的活菌數(shù))xlOO。以上試驗過程重復(fù)2次，結(jié)果取平均值。將豬源植物乳桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，以1%的接種量加入pH為3.0的MRS培養(yǎng)基中，做兩份，一份用滅菌生理鹽水梯度稀釋，取l(T5的稀釋液lml接種MRS平板涂板，置于37'C培養(yǎng)48h，進行菌落計數(shù)，即Oh的活菌數(shù)。另一份室溫處理lh后，再用滅菌生理鹽水梯度稀釋，取10—5的稀釋液lml接種MRS平板涂板，置于37'C培養(yǎng)48h，進行菌落計數(shù)，即lh的活菌數(shù)，并計算出乳酸菌的存活率。存活率(％)=(lh的活菌數(shù)/Oh的活菌數(shù))x100。以上試驗過程重復(fù)2次，結(jié)果取平均值。表3豬源植物乳桿菌耐膽鹽和耐酸試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>步驟3豬源植物乳桿菌的增菌培養(yǎng)增菌培養(yǎng)基氮源魚肉蛋白胨，胰蛋白胨，大豆蛋白胨；均為生化級試劑。碳源乳糖，蔗糖，葡萄糖；均為分析純試劑。生長因子維生素C，酵母浸出粉，牛肉浸膏。緩沖鹽類K2HP04、檸檬酸氫二銨、乙酸鈉、MgS04.7H20、MnS04.4H20;均為分析純試劑。3.1增菌培養(yǎng)基的配制增菌培養(yǎng)基的備選材料是以MRS培養(yǎng)基的營養(yǎng)組成為依據(jù)，參照食物成分表，經(jīng)預(yù)試驗確定。選擇氮源(A)、碳源(B)、生長因子(C)和(D)鹽類(鹽類包括無機鹽和緩沖鹽)為試驗因素，設(shè)計正交試驗獲取培養(yǎng)基的最佳組成。培養(yǎng)基氮源、碳源及其他營養(yǎng)成分之間可能存在協(xié)同作用，而D因素與其他三個因素間的差別大，因此可將其與其他因素的交互作用忽略不計。各營養(yǎng)成分的比例為氮源0.5%，碳源1%，生長因子0.5%，無機鹽和緩沖鹽類成分不變，其余為水。具體因素水平項目設(shè)計和乳酸菌增菌培養(yǎng)基配方如表4和表5所示。表4培養(yǎng)基正交試驗因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表5增菌培養(yǎng)基配方表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>增菌培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)液經(jīng)加熱沸煮，經(jīng)濾紙過濾，使增菌液呈完全澄清透明，以便于比色，增菌液經(jīng)105"滅菌15min。3.2菌液吸光值(OD600)的測定配制各種培養(yǎng)基后分別以1%的量接種，在37'C培養(yǎng)24h，用UV4802型紫外分光光度計在600nm條件下比色測定菌液吸光值。pH213型酸度計在室溫下測定菌液pH值。植物乳桿菌增菌培養(yǎng)基成分篩選正交試驗結(jié)果見表6，植物乳桿菌增菌培養(yǎng)基中指標(biāo)的極差分析結(jié)果見表7。表6豬源植物乳桿菌增菌培養(yǎng)基成分篩選正交試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表8增菌培養(yǎng)基與MRS培養(yǎng)基的活菌數(shù)比較培養(yǎng)基植物乳桿菌增菌培養(yǎng)基3.65X10'2cfu/mlMRS培養(yǎng)基1.82X10'0cfu/ml步驟4凍干保護劑配方的優(yōu)選材料乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘油、抗壞血酸、L一半胱氨酸、脫脂奶粉、谷氨酸鈉、L一谷氨酸、糊精。4.1凍干保護劑的配制選取8種保護劑，以脫脂奶粉為基礎(chǔ)，將8種保護劑按不同濃度隨機組合成10組保護劑配方如表9。植物乳桿菌在最佳增菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，6000r/min，離心10min棄上清，去菌泥，加入與菌泥等容積的保護劑制成菌懸液，取0.5ml菌懸液用生理鹽水稀釋至10—7，取10ul接種MRS培養(yǎng)基，計數(shù)。剩下的菌懸液分裝，并置于超低溫預(yù)凍2小時，迅速放入小型凍干機，真空冷凍干燥。表9不向保護劑對植物乳桿菌存活率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>計數(shù)培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基葡萄糖20.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g,酵母膏5.0g，乙酸鈉5.0g,擰檬酸二銨2.0g,吐溫(Tween)80l.OmL，K2HP042.0g，MgSQ4'7H200.58g，MnS04'4H200.25g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH為6.5，12rC滅菌15min。結(jié)果表明當(dāng)保護劑組合為16%脫脂奶粉+2%乳糖+10%糊精+0.5°/丄-半胱氨酸+1.5%谷氨酸鈉時，豬源植物乳桿菌凍千制劑的存活率最高，達(dá)88.89%，因此，確定為最佳凍干保護劑。4.2植物乳桿菌中試生產(chǎn)將植物乳桿菌采用增菌培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后，6000r/min，離心10min棄上清，取菌泥，采用最佳保護劑，制成菌懸液，取0.5ml菌懸液用生理鹽水稀釋至10—7，取10ul接種MRS培養(yǎng)基，計數(shù)。其余菌懸液分裝，置于中型凍干機中進行冷凍干燥，結(jié)果見表10。表10植物乳桿菌中試生產(chǎn)活菌數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4.3植物乳桿菌凍十菌粉貯存穩(wěn)定性測定將植物乳桿菌凍干菌粉用鋁箔袋包裝后，常溫保存6個月、9個月、12個月后，取菌粉，用無菌生理鹽水進行梯度稀釋后，采用MRS培養(yǎng)基測定活菌數(shù)。結(jié)果見表11。由表11可知，植物乳桿菌凍干菌粉常溫保存6個月后，活菌數(shù)仍可達(dá)到10nCfu/g，存活率達(dá)68.75%，常溫保存12個月，活菌數(shù)仍可達(dá)到109cfu/g。表ll植物乳桿菌貯存穩(wěn)定性測定<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>歩驟5豬源植物乳桿菌凍干制劑的制備植物乳桿菌增菌培養(yǎng)后，收取培養(yǎng)液，6000r/min，離心10min取菌泥，將菌泥加入到以最佳配比配置的凍干保護劑中，制成與離心前增菌培養(yǎng)液濃度相同的菌懸液。將菌懸液倒入中型凍十機的物料千燥盤中，抽真空開始進行凍十。凍干26小時后即得植物乳桿菌凍干產(chǎn)品，測定后活菌數(shù)為1.6xl012cfu/g。步驟6豬源植物乳桿菌凍干制劑的安全性能測定將豬源植物乳桿菌凍干制劑送至農(nóng)業(yè)部獸藥安全監(jiān)督檢驗測試中心進行了大、小鼠急性毒性LDso實驗，結(jié)果證明了豬源植物乳桿菌凍干制劑對于大、小鼠經(jīng)口LDso均大于5000mg/kg體重，證明了該凍干制劑屬安全性飼料添加劑。實施例2豬源植物乳桿菌凍干制劑的抑菌試驗表12為植物乳桿菌的抑菌試驗結(jié)果?？梢钥闯觯摼陮χ虏⌒源竽c桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌都有較強的抑制作用，均判定為中度敏感，其中對沙門氏菌的抑菌圈直徑最大，抑菌效果最好；大腸桿菌次之；金黃色葡萄球菌最差。間接證明，植物乳桿菌對大腸桿菌、沙門氏菌等易引起豬腸道感染、腹瀉的疾病有預(yù)防性作用。表12植物乳桿菌體外抑菌試驗結(jié)果病原菌抑菌圈直徑(mm)敏感性判定~大腸桿菌中度敏感沙門氏菌13.7中度敏感金黃色葡萄球菌11.7中度敏感實施例3豬源植物乳桿菌凍干制劑在保育豬生產(chǎn)中的應(yīng)用效果將凍干制劑按不同添加比例關(guān)系添加到28日齡保育豬飼料中，試驗隨機分成4組，每組16頭，試驗期33天。試驗分抗生素組、0.3%豬源植物乳桿菌凍干制劑組、0.5%豬源植物乳桿菌凍干制劑組、0.7%豬源植物乳桿菌凍干制劑組。保育豬在網(wǎng)床上飼養(yǎng)，舍溫保持在2527°C，粉料飼喂，自由來食，自由飲水。試驗結(jié)果見表12。表13豬源植物乳桿菌凍干制劑詞喂仔豬試驗組別試驗期(天)頭數(shù)(頭)試驗期內(nèi)口增重試驗期內(nèi)料肉試驗期內(nèi)死亡豬瘟抗體OD63。值(g/d)比率(％)(33天)對照(金霉素+3316393a1.98a00.41a基礎(chǔ)日糧)0.3%豬源植物乳桿菌凍干制3316405a1.95a00.78b齊U+基礎(chǔ)日糧0.5%豬源植物乳桿菌凍干制3316374b2.03b6.250.74h齊U+基礎(chǔ)日糧0.7%豬源植物乳桿菌凍干制3316364b2.10b12.500.72b齊U+基礎(chǔ)曰糧注縱向比較，數(shù)據(jù)的上標(biāo)字母不同者差異顯著(P<0.05)，上標(biāo)字母相同者差異不顯著(P>0.05)。由表13可見，伺喂豬源植物乳桿菌凍千制劑33天時，0.3%豬源植物乳桿菌凍干制劑+基礎(chǔ)日糧組的效果最好，日增重、料肉比、死亡率和豬瘟效價等指標(biāo)都是最佳的，并且超過飼用抗生素(金霉素)的同類效果。13附錄序列表<110>北京市農(nóng)林科學(xué)院<120>—種豬源植物乳桿菌凍干制劑及其制備方法<130>P09140/NLK<160>1<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211〉1239<212>DNA<213〉植物乳桿菌鑒定所依據(jù)的基因序列<400>1gatacatgcaagtcgaacgaactctggtattgattggtgcttgcatcatgattctactat60ttgagtgagtggcgaactggtgagtaacacgtgggaaacctgcccagaagcgggggataa120cacctggaaacagatgctaataccgcataacaacttggaccgcatggtccgagcttgaaa180gatggcttcggctatcacttttggatggtcccgcggcgtattagctagatggtggggtaa240cggctcaccatggcaatgatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggact300gagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgaaa360gtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaacaagggtttcggctcgtaaaactctgttgtt420aaagaagaacatatctgagagtaactgttcaggtattgacggtatttaaccagaaagcca480cggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggattta540ttgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccttcggctcaac600cgaagaagtgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatg660tgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggt720ctgtaactgacgctgaggctcgaaagtatgggtagcaaacaggattagataccctggtag780tccataccgtaaacgatgaatgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagc840taacgcattaagcattccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattg900acgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaaaaacctt960accaggtcttgacatactatgcaaatctaaaagattagacgttcccttcggggacatgga1020tacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaa1080cgagcgcaacccttattatcggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgcccctta1140tgacctgggcggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggc1200tacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgaa12391權(quán)利要求1.一種豬源植物乳桿菌凍干制劑，其特征在于制備凍干制劑時所用的凍干保護劑的重量百分比為脫脂奶粉16％，谷氨酸鈉1.5％，L-半胱氨酸0.5％，乳糖2％，糊精10％，其余為水。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬源植物乳桿菌凍干制劑，所述豬源植物乳桿菌凍干制劑中活菌數(shù)>1012cfu/g。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬源植物乳桿菌凍干制劑，所述豬源植物乳桿菌來源于保育豬盲腸黏膜。4.權(quán)利要求1至3任一所述的豬源植物乳桿菌凍干制劑的制備方法，步驟是將豬源植物乳桿菌菌液用增菌培養(yǎng)基進行增菌培養(yǎng)，增菌培養(yǎng)液在6000rpm離心10min，取菌泥，加入凍干保護劑，凍干時間為20-28小時。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，所述凍干時間為26小時。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，所述增菌培養(yǎng)基重量百分比為胰蛋白胨0.5%，乳糖1%，酵母浸粉0.5%，乙酸鈉0.5%，磷酸氫二鉀0.2%，檸檬酸氫二銨0.2%，四水硫酸錳0.025%,七水硫酸鎂0.058%，吐溫一800.1%，其余為水。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，所述增菌培養(yǎng)的參數(shù)為增菌培養(yǎng)基的pH為6.46.5，植物乳桿菌接種量為1%，37"C培養(yǎng)24小時，轉(zhuǎn)速為100rpm。8.權(quán)利要求1至3任一所述的豬源植物乳桿菌凍干制劑在動物飼料添加劑中的應(yīng)用。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述動物為豬。全文摘要本發(fā)明涉及“一種豬源植物乳桿菌凍干制劑及其制備方法”，屬于微生物應(yīng)用領(lǐng)域。一種豬源植物乳桿菌凍干制劑，其特征在于凍干制劑中凍干保護劑的重量百分比為脫脂奶粉16％，谷氨酸鈉1.5％，L-半胱氨酸0.5％，乳糖2％，糊精10％，其余為水，該凍干保護劑不僅使菌存活率高，且具有良好的保存穩(wěn)定性，使其非常適合添加到飼料中；將本發(fā)明的凍干制劑添加到保育豬飼料中，結(jié)果證明具有降低豬腹瀉率、提高豬日增重和飼料利用率的功能，顯著超過飼用抗生素(金霉素)的效果；本發(fā)明還提供了專門適合豬源植物乳桿菌的增菌培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基比普通MRS培養(yǎng)基增菌效果好，活菌數(shù)提高2個數(shù)量級。文檔編號A23K1/16GK101548716SQ20091008244公開日2009年10月7日申請日期2009年4月17日優(yōu)先權(quán)日2009年4月17日發(fā)明者單達(dá)聰,季海峰,張董燕,王四新,王雅民,蘇布敦格日樂申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院