專利名稱：：高溫誘導楊樹大孢子染色體加倍選育楊樹三倍體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種選育植物多倍體的方法，尤其涉及一種通過在大孢子母細胞減數(shù)分裂的特定階段進行高溫處理，以相對準確、高效的誘導楊樹大孢子染色體加倍進而選育楊樹三倍體植抹的方法，屬于植物遺傳育種領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：自然界植物多倍體的發(fā)生均來自于細胞核內(nèi)染色體組的倍數(shù)變異，即體細胞分裂過程中偶然發(fā)生的染色體加倍以及減數(shù)分裂過程中產(chǎn)生未減數(shù)配子。人工誘導染色體加倍可采f^火水仙堿溶液等化學誘導方法以及異常溫度等物理誘導方法。而人工獲得多倍體的途徑包括體細胞染色體加倍、不同倍性體間雜交、天然或人工未減數(shù)配子雜交、胚乳培養(yǎng)與細胞融合等。與利用2n花粉相比，由于利用2n雌配子不存在單倍性配子竟爭問題，受精后2n雌配子可100。/。形成三倍體，因此采用2n雌配子選育三倍體更具誘惑力。其中2n雌配子誘導包括大孢子染色體加倍和胚嚢染色體加倍。在誘導胚嚢染色體加倍選育三倍體研究方面，康向陽等(2004)(康向陽，張平冬，高鵬，趙芳.秋水仙堿誘導白楊三倍體新途徑的發(fā)現(xiàn)[J].北京林業(yè)大學學報，2004,26(1):1-4.)對授粉一定時期的毛新楊、銀腺楊雌花序進行秋水仙堿溶液處理，獲得了一批白楊三倍體植抹，三倍體誘導得率最高達57.1%;經(jīng)過細胞學觀察證明，授粉后施加秋水仙堿處理誘導銀腺楊等楊樹三倍體的細胞學機理是胚嚢染色體加倍。王君等(2004)(王君，康向陽，李代麗，楊偉光.授粉后施加秋水仙石成處理誘導青楊派異源三倍體.北京林業(yè)大學學報，2007，29(5):18-21,)通過秋水仙堿處理誘導胚嚢染色體加倍，在世界上首次獲得來源于雌配子人工染色體加倍的青楊雜種三倍體，三倍體誘導得率最高達66.7%。就誘導大孢子染色體加倍選育三倍體研究而言，Dwivedi等(1989)(DwivediNK，SuryanarayanaN,SikdarAK，SusheelammaBN，JollyMS.Cytomorphologicalstudiesintriploidmulberryevolvedbydiploidizaionoffemalegametecells[J].Cytologia,1989，54(1):13-19.)在桑樹上曾利用秋水仙堿成功誘導產(chǎn)生2n雌配子，并獲得了三倍體。李云等(2000)(李云，朱之悌，田硯亭，張志毅，康向陽.極端溫度處理白楊雌花芽培育三倍體植抹的研究[J].北京林業(yè)大學學報，2000,22(5):7-12.)利用極端溫度誘導2n雌配子在白楊上獲得了成功，將水培l(xiāng)-5d雌花枝放于高溫(40。C或44。C)或低溫(4。C或-2。C)處理一段時間，授粉雜交培育出三倍體。李云(200D(李云，朱之悌，田硯亭，張志毅，康向陽.秋水仙堿處理白楊雌花芽培育三倍體植株的研究[J].林業(yè)科學，2001，37(5):68-74.)報道采用0.25%-0.5%濃度的秋水仙堿處理水培l(xiāng)-5d的雌花芽，授以正?；ǚ郢@得了三倍體植才朱。但與花粉染色體加倍相比，由于大孢子母細胞減數(shù)分裂進程不能即時觀察，難以確定影響雌配子染色體加倍的減數(shù)分裂有效處理時期，因此，有關(guān)雌配子染色體加倍研究主要是通過對大批量材料的處理及篩選，工作量大，而三倍體得率卻較低，且可重復性較差，從而限制了2n雌配子誘導及其育種應用。李艷華等(李艷華，馬潔，康向陽.白楊大孢子母細胞減數(shù)分裂進程及其即時判別[J].北京林業(yè)大學學報，2005,27(2):70-74;李艷華，康向陽.誘導大孢子染色體加倍選育白楊雜種三倍體[J].北京林業(yè)大學學報，2007,29(5):22-25.)利用雌、雄花芽發(fā)育進程的時序性、相關(guān)性，以雄配子發(fā)育進程為參照，相對準確地解決了秋水仙^5威化學處理誘導白楊大孢子染色體加倍的有效處理時期即時判別的技術(shù)方法問題；并進一步采用雄配子發(fā)育進程為參照，在大孢子母細胞減數(shù)分裂粗線期適時進行秋水仙堿加倍處理，獲得了高達16.7%的三倍體誘導得率。但該方法在加倍楊樹缺少對照雄林時難以應用，而雌林與雄抹所處環(huán)境差異較大時的誤差也較大。由于花粉母細胞減數(shù)分裂進程可以即時觀察，一些高溫誘導植物2n配子主要集中在花粉染色體加倍方面。Mashkina等(1989)(MashkinaOS,BurdaevaLM，Belozerova畫，VyunovaLN.Methodofobtainingdiploidpollenofwoodyspecies[J].Lesovedenie,1989，1:19-25.)將花中，高溫處理誘導花粉染色體加倍，在楊樹中取得了高達94.4%的2n花粉，并用2n花粉雜交得到了三倍體。張志毅和李鳳蘭(1992)(張志毅，李鳳蘭.白楊染色體加倍技術(shù)研究及三倍體育種(I)一一花粉染色體加倍技術(shù)[J].北京林業(yè)大學學報，1992,14(增3):52-58.)用4(TC處理毛新楊雄花芽，獲得了高達66.25%的大花粉比率?？迪蜿柕?2000)(康向陽,朱之悌，張志毅.高溫誘導白楊2n花粉有效處理時期的研究[J].北京林業(yè)大學學報，2000,22(3):1-4.)研究發(fā)現(xiàn)高溫誘導楊樹2n花粉在花粉母細胞減數(shù)分裂終變期-中期I處理效果最好，最高可獲得87.6%的2n花粉，但花粉量較少。高鵬(2006)(高鵬.杜仲配子與合子染色體加倍技術(shù)研究[D].北京北京林業(yè)大學，2006.)在花粉母細胞減數(shù)分裂終變期-中期I用"樹木高溫加倍器，，高溫誘導杜仲花粉染色體加倍，獲得了較高比率的2n花粉。目前，高溫誘導植物大孢子染色體加倍選育三倍體的有效處理時期尚未揭示，在有效處理時期內(nèi)的高溫處理條件也尚未明確；而楊樹缺少參照雄林或雌抹與雄抹所處環(huán)境差異較大時的大孢子染色體加倍有效處理時期即時判別方法也未解決。因此，解決高溫誘導植物大孢子染色體加倍選育三倍體的有效減數(shù)分裂處理時期以及相關(guān)技術(shù)問題，形成有效的大孢子染色體加倍選育三倍體誘導技術(shù)支撐體系，對于實現(xiàn)高溫誘導植物大孢子染色體加倍選育三倍體的穩(wěn)定性和高效率，以及將該方法引入其它植物的三倍體誘導等具有重要的實際價值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是確定高溫處理誘導楊樹大孢子染色體加倍選育三倍體的有效處理時期以及處理條件，從而提供一種系統(tǒng)而高效的高溫誘導大孢子染色體加倍選育楊樹三倍體的方法，該方法在高溫處理誘導楊樹三倍體方面具有相對準確性、穩(wěn)定性、高效性。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種高溫處理誘導楊樹大孢子染色體加倍選育楊樹三倍體的方法，依次包括通過常規(guī)細胞學觀察解決楊樹母本雌花芽外部形態(tài)與大孢子母細胞減數(shù)分裂時期的對應關(guān)系，在雌花芽發(fā)育到一定時期用超出其正常生長的溫度進行處理，用楊樹父本的花粉進行雜交授粉，果序管理，收獲種子，播種育苗，對苗木進行染色體檢測，篩選出三倍體楊樹植4朱；其中，當楊樹雌花芽的外部形態(tài)處于與大孢子母細胞減數(shù)分裂雙線期到終變期相對應的形態(tài)時，對楊樹母本雌花芽用超出其正常生長時的溫度進行處理；為了達到更好的誘導效果，對楊樹雌花芽所施加處理的溫度優(yōu)選為38-44°C，更優(yōu)選為41-44°C，最優(yōu)選為44°C;所述的處理時間優(yōu)選為3-5小時，更優(yōu)選為5小時。本發(fā)明人通過試驗發(fā)現(xiàn)，當楊樹雌花芽的外部形態(tài)處于與大孢子母細胞減數(shù)分裂雙線期到終變期相對應的形態(tài)時，對楊樹雌花芽施加高溫處理誘導三倍體的效果最好(試驗證明此時哲引3號楊處理所獲得的三倍體植抹約占獲得雜種后代總數(shù)的65%)。其中，所述的楊樹母本優(yōu)選為哲引3號楊(P戸ewdo"/附om7x/|"/ya'Zheyin3#,),所述的楊樹父本優(yōu)選為北京楊(Px6ez)7wgera/s);本發(fā)明人結(jié)合組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，當楊樹雌花芽的大多數(shù)大孢子母細胞減數(shù)分裂的分裂相處于雙線期到終變期時，此時，楊樹雌花芽的所對應呈現(xiàn)的外部形態(tài)是芽鱗張開，花序微露。其中，所述的"大多數(shù)"是指占大孢子母細胞總數(shù)的百分比超過50%以上；本說明書附圖中給出了哲引3號楊雌花芽的外部形態(tài)處于芽鱗張開，花序微露的形態(tài)時的參考狀態(tài)圖(狀態(tài)m),該圖僅供本領(lǐng)域技術(shù)人員參考，而不是評價所有楊樹雌花芽處于大孢子母細胞減數(shù)分裂雙線期到終變期相對應的形態(tài)時的依據(jù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)楊樹雌花芽的外部形態(tài)并結(jié)合其大孢子母細胞減數(shù)分裂觀察(例如定時用FAA固定液固定植物若干雌花，結(jié)合常規(guī)切片觀察統(tǒng)計每一雌花發(fā)育形態(tài)下的大孢子母細胞減數(shù)分裂各時期的比率)來準確評判該種楊樹雌花芽處于大孢子母細胞減數(shù)分裂雙線期到終變期時的的外部形態(tài)。本發(fā)明方法可增加高溫處理誘導楊樹大孢子染色體加倍選育三倍體的準確性和穩(wěn)定性，提高了楊樹三倍體的誘導效率，并且還可以節(jié)約處理用的試驗材料和人力等。本發(fā)明的主要優(yōu)點如下1)明確了楊樹雌花芽的外部形態(tài)處于大孢子母細胞減數(shù)分裂雙線期到終變期時為高溫處理誘導植物大孢子染色體加倍選育三倍體的最佳處理時期，對大孢子染色體加倍有效處理時期做到了相對精確控制，可增加高溫處理誘導楊樹大孢子染色體加倍選育三倍體的準確性和穩(wěn)定性，提高楊樹三倍體的誘導效率，并且還可以有效節(jié)約處理用的試驗材料和人力等；2)本發(fā)明通過雌花芽形態(tài)發(fā)育確定大孢子母細胞減數(shù)分裂進程的技術(shù)方法，使本發(fā)明方法具有更強的可操作性，進一步節(jié)省了人力和物力，尤其對于缺少參照雄株時更為實用。圖l'哲引3號楊，高溫誘導大孢子染色體加倍各處理花芽形態(tài)；狀態(tài)I:花芽略膨大；狀態(tài)II:芽鱗微張，花序未露出；狀態(tài)III:芽鱗張開，花序微露；狀態(tài)IV:1/3花序露出芽鱗；狀態(tài)V:1/2花序露出芽鱗。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例用'哲引3號才為，(/wet^o-w'附om7xpw/gra'Zheyin3#，)等為母本,以'北京楊，(Px67"gera&)為父本，將雌花芽區(qū)分為5種狀態(tài)狀態(tài)I:花芽略膨大；狀態(tài)II:芽鱗微張，花序未露出；狀態(tài)III:芽鱗張開，花序微露；狀態(tài)IV:1/3花序露出芽鱗；狀態(tài)V:1/2花序露出芽鱗。該5種花芽發(fā)育狀態(tài)分別與一定的大孢子母細胞減數(shù)分裂時期相對應(圖l，表l)。對不同發(fā)育狀態(tài)下的雌花芽施加一定的超出植物發(fā)育時期內(nèi)正常溫度的38°C、41°C、44。C高溫進行處理，處理持續(xù)時間分別為3小時、5小時。由于'哲引3號楊，大孢子母細胞減數(shù)分裂進程的不同步性，各處理均能得到了一定數(shù)量的三倍體植林(表2)，其中尤以雌花芽處于狀態(tài)III時施加處理誘導三倍體的效果最好，在此花芽發(fā)育狀態(tài)下大部分大孢子母細胞減數(shù)分裂處于雙線期和終變期，并含有少量中期n分裂相。雌花芽處于狀態(tài)m時的全部處理獲得三倍體95林，約占獲得的三倍體總數(shù)的65%。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求1、一種高溫誘導楊樹大孢子染色體加倍選育楊樹三倍體的方法，該方法依次包括對發(fā)育到一定時期的楊樹母本雌花芽用超出其正常生長的溫度進行處理，用楊樹父本的花粉對雌花芽進行雜交授粉，果序管理，收獲種子，播種育苗，對苗木進行染色體檢測，篩選出三倍體楊樹植株；其特征在于當楊樹母本雌花芽的大多數(shù)大孢子母細胞減數(shù)分裂的分裂相處于雙線期到終變期時，對楊樹雌花芽用超出其正常生長的溫度進行處理。2、按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于當楊樹母本雌花芽的大多數(shù)大孢子母細胞減數(shù)分裂處于雙線期到終變期時，楊樹母本雌花芽所對應的外部形態(tài)是；芽鱗張開，花序微露。3、按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于當楊樹母本雌花芽的大多數(shù)大孢子母細胞減數(shù)分裂的分裂相處于雙線期到終變期時，對楊樹母本雌花芽所施加的處理溫度為38-44°C。4、按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于對楊樹母本雌花芽所施加的處理溫度為41-44°C。5、按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于對楊樹母本雌花芽所施加的處理溫度為44°C。6、按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于對楊樹母本雌花芽用超出其正常生長的溫度進行處理的時間為3-5小時。7、按照權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于對楊樹母本的雌花芽用超出其正常生長的溫度進行處理的時間為5小時。全文摘要本發(fā)明公開了一種高溫處理誘導楊樹大孢子染色體加倍選育楊樹三倍體的方法，該方法依次包括對發(fā)育到一定時期的楊樹母本雌花芽用超過其正常生長的溫度進行處理，用楊樹父本的花粉對雌花序進行雜交授粉，果序管理，收獲種子，播種育苗，對苗木進行染色體檢測，篩選出楊樹三倍體植株；其中，當楊樹母本雌花芽大多數(shù)的大孢子母細胞減數(shù)分裂的分裂相處于雙線期到終變期時，對楊樹雌花芽用超出其正常生長的溫度進行處理。本發(fā)明方法明確了高溫處理誘導楊樹大孢子染色體加倍的最佳處理時期和處理條件，對有效處理時期做到了相對精確控制，增加了選育楊樹三倍體的準確性和穩(wěn)定性，提高楊樹三倍體的誘導效率，節(jié)約了實驗材料和人力。文檔編號A01H1/02GK101595842SQ200910088728公開日2009年12月9日申請日期2009年7月10日優(yōu)先權(quán)日2009年7月10日發(fā)明者唐湫鑰,康向陽,李代麗,珺楊,君王,敏魯申請人:北京林業(yè)大學