專利名稱：一種植物基因工程雄性不育系的創(chuàng)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物育種技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種通過內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能重建 獲得新型基因工程雄性不育系的方法。
背景技術(shù)：
雜種優(yōu)勢育種是近代植物育種中成就最為突出的領(lǐng)域之一，而雄性不育系的利用則是 雜種優(yōu)勢育種最重要的途徑之一。其中，基因工程雄性不育系的利用被作為最具前景的育 種途徑，成為當(dāng)今世界范圍內(nèi)研究、開發(fā)和利用的熱點。目前，基因工程核不育系的創(chuàng)建 一般通過特異抑制或擾亂雄配子的正常發(fā)育得以實現(xiàn)。如將^sr/7a^細(xì)胞毒蛋白基因在絨 氈層特異啟動子的驅(qū)動下導(dǎo)入植物獲得基因工程核不育系或利用反義RNA技術(shù)特異關(guān)閉雄 配子發(fā)育關(guān)鍵基因獲得基因工程核不育系等。上述方式所獲得的基因工程核不育系的保持 可通過兩個途徑進(jìn)行，途徑之一是利用組織培養(yǎng)技術(shù)，但該方式技術(shù)性強(qiáng)，在大規(guī)模種子 生產(chǎn)中很難應(yīng)用；途徑之二是與對應(yīng)非轉(zhuǎn)基因保持系雜交，但該途徑保持后會出現(xiàn)50%的 可育株，解決的辦法通常是將導(dǎo)致不育的基因與抗除草劑基因(如Bar基因)緊密連鎖， 然后用除草劑將50%的可育植株在不育系移栽入制種田前殺除。另外，對于以收獲果實或 種子為栽培目的的經(jīng)濟(jì)植物來說，通過該方式獲得的雄性不育系還需建立相應(yīng)的工程恢復(fù) 系。目前巳公開報道的利用不同途徑所創(chuàng)建的基因工程核不育系由于導(dǎo)致不育的機(jī)理具有 較大的差異，恢復(fù)其育性需要建立特定的、針對性的工程恢復(fù)系，該特點大大加大了基因 工程雄性不育系的應(yīng)用難度。因此，找到一種創(chuàng)建基因工程雄性不育系的新方法和途徑， 并實現(xiàn)育性的簡便恢復(fù)是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種獲得新型植物基因工程雄性不育系的方法，通過該方法 所獲得的工程不育系具有能夠被任意可育系恢復(fù)育性的特點。
來自解淀粉芽孢桿菌的Barnase RNA酶具有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性，其在特定細(xì)胞中的表達(dá) 將造成細(xì)胞的凋亡，因而被廣泛應(yīng)用于植物基因工程雄性不育系的創(chuàng)建、抗病性的提高以 及無籽果實的產(chǎn)生等領(lǐng)域。但將Barnase蛋白在第36位Val(纈氨酸)處分拆為N端(1-35 位氨基酸)和C端(36-110位氨基酸)兩條肽鏈并單獨表達(dá)時，肽鏈均無任何細(xì)胞毒性。 而內(nèi)含肽是存在于蛋白翻譯產(chǎn)物(前體蛋白)閱讀框架內(nèi)的一段氨基酸序列，在前體蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓鞍椎倪^程中，通過反式剪接，內(nèi)含肽自身被剪切釋放游離于成熟蛋白之 外。該反式剪接過程不需要特定的細(xì)胞環(huán)境以及任何輔助因子的參與，并可在體外進(jìn)行。 來自5y朋c力oc/s"s sp. PCC6803 (集胞藻)的Ssp DnaE內(nèi)含肽的N端(123個氨基酸 Int-N)和C端(36個氨基酸Int-C)剪接結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)被750Kb的基因組序列分開， 但這兩個分別含有內(nèi)含肽N端(DnaE-N/Int-N)和C端(Int-C /DnaE-C)剪接結(jié)構(gòu)域的 蛋白翻譯產(chǎn)物仍可以通過Int-N和Int-C內(nèi)含肽片段間的識別完成外蛋白子DnaE-N和 DnaE-C間的拼接而形成完整的DnaE蛋白?；谠撎匦裕琒sp DnaE內(nèi)含肽在蛋白質(zhì)相互 作用檢測、環(huán)化蛋白構(gòu)建以及酶功能重建等方面得到了廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明即利用該特 點，將Ssp DnaE內(nèi)含肽N端和C端分別與Barnase蛋白分拆后無毒性的N端和C端分 別融合獲得嵌合基因，嵌合基因在煙草絨氈層TA29啟動子驅(qū)動下分別轉(zhuǎn)化植物后獲得 可育的A系和B系，A系和B系均可自交繁殖保持。在繁殖不育系時，將A系和B系進(jìn) 行雜交，獲得的雜交植株開花時，分拆后的Barnase蛋白N端和C端兩條肽鏈在Ssp DnaE 內(nèi)含肽介導(dǎo)下，在絨氈層細(xì)胞中重新連接成為野生型的Barnase蛋白，導(dǎo)致絨氈層細(xì)胞 凋亡而表現(xiàn)雄性不育，由此建立一種新型的雄性不育系。將該不育系與任意可育父本系 雜交獲得F1代，F(xiàn)l代僅含任一Barnase基因N端和C端基因，育性得以恢復(fù)。 本發(fā)明依次通過下列步驟實現(xiàn)
(1) 利用PCR方法將Barnase毒蛋白的N端BR-N與Ssp DnaE內(nèi)含肽的N端Int-N 嵌合，獲得的嵌合基因再與煙草絨氈層特異表達(dá)啟動子TA29融合實現(xiàn)其在絨氈層細(xì)胞 的特異表達(dá)；同時，將草甘膦抗性基因EPSPS與組成性表達(dá)啟動子CaMV35S融合獲得對 除草劑草甘膦的抗性，將含有上述兩個表達(dá)元件的載體轉(zhuǎn)化植物，轉(zhuǎn)基因植株自交純合 后獲得抗除草劑草甘膦的A系，其基因型為BR-N/ Int-N : : BR- N/Int-N，自交繁殖 保持；
(2) 將SspDnaE內(nèi)含肽的C端Int-C與Barnase毒蛋白的C端BR-C嵌合，獲得 的嵌合基因再與煙草絨氈層特異表達(dá)啟動子TA29融合實現(xiàn)其在絨氈層細(xì)胞的特異表 達(dá)；同時，將草丁膦抗性基因Bar與組成性表達(dá)啟動子CaMV35S融合獲得對除草劑Basta 的抗性，將含有上述兩個表達(dá)元件的載體轉(zhuǎn)化植物，轉(zhuǎn)基因植株自交純合后獲得抗除草 劑Basta的B系，其基因型為Int-C/BR-C : : Int-C/BR-C,自交繁殖保持；
(3) 將純合A系與純合B系通過人工或自然授粉方法雜交，雜交后代植株在苗期 用除草劑草甘膦和草丁膦Basta處理2-3次，殺除自交植株，留下基因型為BR-N/ Int-N : : Int-C/服-C的雙抗植株，雙抗植株在雄配子發(fā)育時，Barnase蛋白N端的BR-N
4和Barnase蛋白C端的BR-C多肽在Ssp DnaE內(nèi)含肽的介導(dǎo)下在絨氈層細(xì)胞中剪接， Barnase毒蛋白的結(jié)構(gòu)與功能被恢復(fù)，影響花粉的發(fā)育而表現(xiàn)雄性不育；
U)上述雄性不育植株在制種時與可育父本進(jìn)行雜交，獲得的F1植株出現(xiàn)BR-N/ Int-N與Int-C/BR-C位點之間的分離，植株正常開花結(jié)子，育性恢復(fù)。
上述方法步驟(1) 、 (2)中
BR-N : Barnase毒蛋白的N端1-35位氨基酸；
BR-C : Barnase毒蛋白的C端36-110位氨基酸；
Int-N : Ssp DnaE內(nèi)含肽N端的123個氨基酸殘基；
Int-C : Ssp DnaE內(nèi)含肽C端36個氨基酸殘基；
CaMV35S:花椰菜花葉病毒啟動子。
本發(fā)明方法所涉及的PCR技術(shù)、植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)等均為公知技術(shù)，其中的Barnase 基因編碼序列、煙草絨氈層TA29啟動子序列、CaMV35S啟動子序列、草甘膦抗性基因 EPSPS序列、草丁膦抗性基因Bar序列、Ssp DnaE內(nèi)含肽編碼序列等為公知信息，均可 在Genebank數(shù)據(jù)庫以及NEB公司公開的內(nèi)含肽數(shù)據(jù)庫中免費查閱。
本發(fā)明的優(yōu)點是結(jié)合5"印DnaE intein內(nèi)含肽、Barnase毒蛋白結(jié)構(gòu)功能特點，構(gòu) 建能自我繁殖的A系以及B系，通過A系與B系的之間的雜交使雜交后代表現(xiàn)不育。該不 育系與任意非轉(zhuǎn)基因可育系雜交后，雜交后代育性被恢復(fù)，解決了利用常規(guī)基因工程方法 獲得的不育系缺少通用簡單方法恢復(fù)育性的問題。
具體實施例方式
實施例1:甘藍(lán)新型基因工程雄性不育系的建立及應(yīng)用
(1) 將Barnase毒蛋白的N端BR-N與Ssp DnaE內(nèi)含肽的N端Int-N嵌合獲得BR-N/ Int-N嵌合基因并與TA29啟動子融合，獲得的表達(dá)盒再與CaMV35S啟動子驅(qū)動下的草甘 膦抗性基因EPSPS表達(dá)盒串聯(lián)，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將其導(dǎo)入甘藍(lán)自交系，自交后獲得抗 除草劑草甘膦的BR-N/ Int-N轉(zhuǎn)基因純系作為A系；
(2) 將Ssp DnaE內(nèi)含肽的C端Int-C與Barnase毒蛋白的C端BR-C嵌合獲得Int-C /BR-C嵌合基因并與TA29啟動子融合，獲得的表達(dá)盒再與CaMV35S啟動子驅(qū)動下的草丁 膦抗性基因Bar表達(dá)盒串聯(lián)，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其導(dǎo)入步驟(l)同一甘藍(lán)自交系，自交 后獲得抗除草劑草丁膦的Int-C/BR-C轉(zhuǎn)基因純系作為B系；
(3) 甘藍(lán)轉(zhuǎn)基因A系與B系的繁殖將A系與B系在隔離區(qū)內(nèi)分別自交繁殖保持；
(4) 不育系的獲得將甘藍(lán)轉(zhuǎn)基因A系與B系在不育系繁殖區(qū)內(nèi)通過蕾期人工授粉
5雜交(轉(zhuǎn)基因系為自交不親和系時)或自然授粉雜交(轉(zhuǎn)基因系為自交親和系時)，雜交 種子混合采收，雜交種子在播種出苗或移栽制種田之前用除草劑草甘膦和草丁膦噴灑2 次，殺除自交植株，留下除草劑雙抗不育植株；
(5)雜交種子生產(chǎn)將抗除草劑草甘膦和草丁膦不育植株與選育的父本系按2: 1 比例種植于Fl種子生產(chǎn)田，從不育植株上收獲Fl甘藍(lán)種子。 實施例2:水稻新型基因工程雄性不育系的建立及應(yīng)用
(1 )將Barnase毒蛋白的N端BR-N與Ssp DnaE內(nèi)含肽的N端Int-N嵌合獲得BR-N/ Int-N嵌合基因并與TA29啟動子融合，獲得的表達(dá)盒再與CaMV35S啟動子驅(qū)動下的草甘 膦抗性基因EPSPS表達(dá)盒串聯(lián)，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將其導(dǎo)入水稻自交系，自交后獲得抗 除草劑草甘膦的BR-N/ Int-N轉(zhuǎn)基因純系作為A系；
(2) 將Ssp DnaE內(nèi)含肽的C端Int-C與Barnase毒蛋白的C端BR-C嵌合獲得Int-C /BR-C嵌合基因并與TA29啟動子融合，獲得的表達(dá)盒再與CaMV35S啟動子驅(qū)動下的草丁 膦抗性基因Bar表達(dá)盒串聯(lián)，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其導(dǎo)入步驟(l)同一水稻自交系，自交 后獲得抗除草劑草丁膦的Int-C/BR-C轉(zhuǎn)基因純系作為B系；
(3) 水稻轉(zhuǎn)基因A系與B系的繁殖將A系與B系在隔離區(qū)內(nèi)分別自交繁殖保持；
(4) 不育系的獲得不育系繁殖區(qū)內(nèi)的水稻轉(zhuǎn)基因A系與B系按1: l的比例栽植， 開花時用竹竿趕粉方式進(jìn)行相互雜交，種子混合采收；獲得的雜交種子在播種出苗后用除 草劑草甘膦和草丁膦噴灑3次，殺除自交植株，留下除草劑雙抗不育植株；
(5) 水稻雜交種子生產(chǎn)將抗除草劑草甘膦和草丁膦不育植株與選育的非轉(zhuǎn)基因父 本自交系按2: 1比例種植于F1種子生產(chǎn)田，開花時用竹竿趕粉方式進(jìn)行雜交，從不育系 上收獲的種子為完全可育的Fl種子。
實施例3:油菜新型基因工程雄性不育系的建立及應(yīng)用
(1 )將Barnase毒蛋白的N端BR-N與Ssp DnaE內(nèi)含肽的N端Int-N嵌合獲得BR-N/ Int-N嵌合基因并與TA29啟動子融合，獲得的表達(dá)盒再與CaMV35S啟動子驅(qū)動下的草甘 膦抗性基因EPSPS表達(dá)盒串聯(lián)，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將其導(dǎo)入油菜自交系，自交后獲得抗 除草劑草甘膦的BR-N/ Int-N轉(zhuǎn)基因純系作為A系；
(2 )將Ssp DnaE內(nèi)含月太的C端Int-C與Barnase毒蛋白的C端BR-C嵌合獲得Int-C /BR-C嵌合基因并與TA29啟動子融合，獲得的表達(dá)盒再與CaMV35S啟動子驅(qū)動下的草丁 膦抗性基因Bar表達(dá)盒串聯(lián)，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其導(dǎo)入步驟(l)同一油菜自交系，自交 后獲得抗除草劑草丁膦的Int-C/BR-C轉(zhuǎn)基因純系作為B系；(3) 油菜轉(zhuǎn)基因A系與B系的繁殖將A系與B系在隔離區(qū)內(nèi)分別自交繁殖保持
(4) 油菜不育系的獲得將油菜轉(zhuǎn)基因A系與B系在不育系繁殖區(qū)內(nèi)雜交，種子混 合采收；雜交種子在播種出苗后用除草劑草甘膦和草丁膦噴灑3次，殺除自交植株，留 下除草劑雙抗不育植株；
(5) 油菜雜交種子生產(chǎn)將抗除草劑草甘膦和草丁膦植株與選育的非轉(zhuǎn)基因父本自
交系按2: 1比例種植于F1種子生產(chǎn)田，任其自由授粉，從不育植株上收獲的種子為可育
的F1種子。
權(quán)利要求
1、一種植物基因工程雄性不育系的創(chuàng)建方法，其特征在于依次通過下列步驟實現(xiàn)(1)利用PCR方法將Barnase毒蛋白的N端BR-N與Ssp DnaE內(nèi)含肽的N端Int-N嵌合，獲得的嵌合基因再與煙草絨氈層特異表達(dá)啟動子TA29融合實現(xiàn)其在絨氈層細(xì)胞的特異表達(dá)；同時，將草甘膦抗性基因EPSPS與組成性表達(dá)啟動子CaMV35S融合獲得對除草劑草甘膦的抗性，將含有上述兩個表達(dá)元件的載體轉(zhuǎn)化植物，轉(zhuǎn)基因植株自交純合后獲得抗除草劑草甘膦的A系，其基因型為BR-N/Int-N::BR-N/Int-N，自交繁殖保持；(2)將Ssp DnaE內(nèi)含肽的C端Int-C與Barnase毒蛋白的C端BR-C嵌合，獲得的嵌合基因再與煙草絨氈層特異表達(dá)啟動子TA29融合實現(xiàn)其在絨氈層細(xì)胞的特異表達(dá)；同時，將草丁膦抗性基因Bar與組成性表達(dá)啟動子CaMV35S融合獲得對除草劑Basta的抗性，將含有上述兩個表達(dá)元件的載體轉(zhuǎn)化植物，轉(zhuǎn)基因植株自交純合后獲得抗除草劑Basta的B系，其基因型為Int-C/BR-C::Int-C/BR-C，自交繁殖保持；(3)將純合A系與純合B系通過人工或自然授粉方法雜交，雜交后代植株在苗期用除草劑草甘膦和草丁膦Basta處理2-3次，殺除自交植株，留下基因型為BR-N/Int-N::Int-C/BR-C的雙抗植株，雙抗植株在雄配子發(fā)育時，Barnase蛋白N端的BR-N和Barnase蛋白C端的BR-C多肽在Ssp DnaE內(nèi)含肽的介導(dǎo)下在絨氈層細(xì)胞中剪接，Barnase毒蛋白的結(jié)構(gòu)與功能被恢復(fù)，影響花粉的發(fā)育而表現(xiàn)雄性不育；(4)上述雄性不育植株在制種時與可育父本進(jìn)行雜交，獲得的F1植株出現(xiàn)BR-N/Int-N與Int-C/BR-C位點之間的分離，植株正常開花結(jié)子，育性恢復(fù)。上述方法步驟(1)、(2)中BR-NBarnase毒蛋白的N端1-35位氨基酸；BR-CBarnase毒蛋白的C端36-110位氨基酸；Int-NSsp DnaE內(nèi)含肽N端的123個氨基酸殘基；Int-CSsp DnaE內(nèi)含肽C端36個氨基酸殘基；CaMV35S花椰菜花葉病毒啟動子。
全文摘要
一種植物基因工程雄性不育系的創(chuàng)建方法，結(jié)合Ssp DnaE intein內(nèi)含肽、Barnase毒蛋白結(jié)構(gòu)功能特點，構(gòu)建能自我繁殖的A系以及B系，通過A系與B系的之間的雜交使雜交后代表現(xiàn)不育。該不育系與任意非轉(zhuǎn)基因可育系雜交后，雜交后代育性被恢復(fù)，解決了利用常規(guī)基因工程方法獲得的不育系缺少通用簡單方法恢復(fù)育性的問題。
文檔編號A01H1/02GK101491210SQ20091010325
公開日2009年7月29日 申請日期2009年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月25日
發(fā)明者任雪松, 軍 司, 明 宋, 宋洪元, 李成瓊 申請人:西南大學(xué)