專利名稱：：細菌殺昆蟲蛋白的制作方法細菌殺昆蟲蛋白
背景技術(shù)：
：1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及從細菌菌林，優(yōu)選短芽孢桿菌(Brevibacillus)菌抹，最優(yōu)選側(cè)孢短小芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)菌抹分離的、新的殺昆蟲分泌蛋白("ISP")及編碼該蛋白的DNA，當所述蛋白與ISP-支助蛋白(ISP-complimentaryprotein),如本發(fā)明的另一種ISP蛋白組合被昆蟲才l^v后即可殺昆蟲。這些蛋白可用于防止或減少田地里昆蟲，特別是玉米根蟲對植物的損害。本發(fā)明還涉及植物，特別是玉米植物，所述植物通過在其細胞中表#發(fā)明的ISP蛋白而具有殺昆蟲能力，優(yōu)選殺鞘翅目昆蟲特別是葉甲屬(Diabrotica)、馬鈴薯葉甲屬(Leptinotarsa)和花象屬(Anthonomus)種的昆蟲。本發(fā)明還涉及通過使下述的昆蟲才IIX本發(fā)明的ISP蛋白，特別是具有SEQIDNo.2，4，8或10之任一項的^酸序列的蛋白，或其中具有殺昆蟲活性的片段來控制由葉甲屬(Diabrotica)、馬鈴薯葉甲屬(Leptinotarsa)或花象屬(Anthonomus)種昆蟲，優(yōu)選葉甲屬(Diabrotica)種昆蟲害蟲，特別是玉米才艮蟲引起的損失的方法。2.現(xiàn)有纟支術(shù)的描述已發(fā)現(xiàn)一些最具石皮壞性的害蟲屬于Diabroticinebeetles,在北美，人們i人為三種重要的玉米才艮蟲，玉米才艮葉曱(Diabroticavirgifera)(西部玉米根蟲)、Diabroticabarberi(北部玉米根蟲)和黃瓜十一星葉曱食根亞種(Diabroticaundecimpunctatahowardi)(南部玉米根蟲)是需要花費最昂貴資金來控制的病蟲害。(Metcalf，1986，F(xiàn)oreword，"MethodsfortheStudyofPestDiabrotica"，pp.vii-xv，編者Krysan，J丄.和Miller,T.A.，Springer國Verlag，紐約)。玉米根葉甲(Diabroticavirgifera)和Diabroticabarberi被i人為是美國和加拿大主要生產(chǎn)玉米的州中最為嚴重的玉米病蟲害(Levine和Oloumi-Sadeghi，1991，Annu.Rev.Entomol.36，229-55)。其幼蟲以玉米根為食，從而對玉米的生長和收獲造成直接的損害。控制幼蟲損害玉米根系的土壤殺昆蟲劑和減少曱蟲損害玉米穗的空氣噴霧劑的費用，加上玉米的虧損每年有將近十億美圓(Metcalf，1986，參見上文)。最近，在美國的一些州發(fā)現(xiàn)在種植玉米后種植大豆的輪作方式失去了作用，這是由于玉米根蟲已經(jīng)適應(yīng)了這種情況。對玉米根蟲具有毒性的細菌菌林和/或基因在美國專利6,023,013;6，015，553;6，001，637;5，卯6，818和5，645，831中已有描述。另夕卜，PCT出版物、VO00/09697，WO99/57282，WO98/18932,WO97/40162，和WO00/26378也涉及到可從芽孢桿菌(Bacillus)或其它細菌種獲得的毒素和基因，其中的一些被ial^對玉米根蟲具有毒性。WO98/44137，WO94/21795和WO96/10083涉及以在營養(yǎng)生長過程中產(chǎn)生的殺昆蟲蛋白和輔助蛋白為特征的殺昆蟲芽孢桿菌(Bacillus)菌林，并描述了其中的一些對玉米根蟲具有毒性。美國專利5,055,293描述了一種通過向土it裏中接種形成伴胞晶體的側(cè)孢芽孢桿菌(Bacilluslaterosporus)來控制玉米才艮蟲的方法。Orlova等(1998，AppliedEnvironmentalMicrobiol.64，2723)報道了在有晶體形成的側(cè)孢芽孢桿菌(Bacilluslaterosporus)中與蛋白晶體相關(guān)的殺蚊蟲活性。發(fā)明目的M明簡述本發(fā)明的目的在于提供對昆蟲，優(yōu)選葉曱屬(Diabrotica)種昆蟲,特別是玉米根蟲具有顯著毒性的新的蛋白和編碼該蛋白的DNA序列。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了包含SEQIDNo.2中最小活性毒素蛋白的M酸序列的蛋白，其中所述最小活性毒素a)是SEQIDNo.2所示蛋白的片段，且b)當與SEQIDNo.4中51到457位^J^,列所示的蛋白組合被玉米根葉甲(Diabroticavirgifera)幼蟲才l^^能夠?qū)⑺鲇紫x殺死。還提供了包含SEQIDNo.4中最小活性毒素蛋白的絲,列的蛋白，其中所述的最小活性毒素a)是SEQIDNo.4所示蛋白的片段，且b)當與SEQIDNo,2中38到871位M,列所示的蛋白組合被玉米根葉甲(Diabroticavirgifera)幼蟲損Uv后能夠?qū)⑺鲇紫x殺死。特別優(yōu)選的是以包含SEQIDNo.2中38到768或781位的^J^,列為特征的蛋白，優(yōu)選以SEQIDNo.2或SEQIDNo.lO的^J^酸序列為特征的蛋白；和以含有SEQIDNo.4從第51位M酸到第449或457位綠酸的序列為特征的蛋白，優(yōu)選以SEQIDNo.4或SEQIDNo.8的^J^崎列為特征的蛋白。本發(fā)明的另一個目的是提供一種蛋白質(zhì)，其包含isplADNA所編碼蛋白的蛋白酶消化片段的氨基酸序列，所述的isplADNA保藏于BCCM-LMBP，保藏號為LMBP4009，其中所述蛋白酶消化片段當與SEQID.No.4中第51位到第457位M酸組成的蛋白組合施用時對玉米根葉甲(Diabroticavirgifera)具有殺昆蟲作用;以及一種包含isp2ADNA所編碼蛋白的蛋白酶消化片段的M^列的蛋白，所述的isp2ADNA保藏于BCCM-LMBP,保藏號為LMBP4009,所述蛋白酶消化片段當與SEQID.No.2中第38位到第871位M酸組成的蛋白組合施用時對玉米根葉甲(Diabroticavirgifera)具有殺昆蟲作用;具體地說，其中所述的蛋白酶消化片段可經(jīng)鞘翅目昆蟲消化液處理得到。本發(fā)明還提供編碼上述蛋白的DNA序列，特別是含有與天然存在的DNA序列相比所使用的密碼子不同但編碼的蛋白序列相同的人工DNA序列的DNA，該DNA優(yōu)選包含在嵌合基因中可操作地與能在植物中表達的啟動子區(qū)域(即適合用于植物細胞中的表達的啟動子區(qū)域，其可來源于細菌，病8毒或植物也可以是人工制備的)，尤其是優(yōu)先在根組織中具有活性的啟動子區(qū)域相連接。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述嵌合基因中的啟動子包含SEQIDNo.5或6的DNA序列或者可在嚴緊M下與其雜交的DNA。在本發(fā)明另一實施方案中，所述的嵌合基因還包含用于從細胞中向外分泌或靶向細胞器的信號肽，特別是葉綠體轉(zhuǎn)運肽。本發(fā)明還提供如下植物細胞、植物或種子，特別是玉米細胞、植物或種子，它們包含整合到其細胞中的上述任一嵌合基因，特別是編碼ISP1A或其具有殺昆蟲活性的片段的嵌合基因與編碼ISP2A或其具有殺昆蟲活性的片段的嵌合基因的組合。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了經(jīng)轉(zhuǎn)化而含有上述任意一種DNA序列的擺t生物。本發(fā)明還提^^控制昆蟲的方法，特別是使植物抗鞘翅目昆蟲的方法，該方法包括在植物細胞中表達任意一種本發(fā)明的ISP蛋白，再從所述的抗昆蟲性細胞再生出轉(zhuǎn)化植物。在這一方法中所述的昆蟲優(yōu)選選自根蟲，象甲，馬鈴薯甲蟲，葉甲屬(Diabrotica)種，花象屬(Antho翻us)種，馬鈴薯葉甲屬(Leptinotarsa)種，楊樹瑩葉甲(Agelasticaalni)，紫油苜蓿葉象(Hyperapostica)，埃及苜蓿葉象(Hyperabmimeipetmis)，Halticatombacina,墨西哥棉鈴象(Anthonomusgrandis)，黃粉蟲(Tenebriomolitor)，赤才以谷盜(Triboleumcastaneum)，7JC稻4失甲(Dicladispa水稻負泥蟲(Oulemaoryzae)，葡萄肖葉甲(Colaspisbrunnea)，稻7JC象甲(LissorhorDtrusoryzophilus)，蘿卜菜跳甲(Phyllotretacruciferae)，黃曲條菜跳曱(Phyllotretastriolata)，忽布跳甲(Psylliodespunctulata)，美洲油菜葉甲(Entomoscdisamericana)，油菜露尾曱(Mdigcthcs狄ncus),龜象屬(Ceutorynchus)種，油菜金頭跳甲(Psylliodeschrysocephala)，豌豆細腳匕曱(Phyllotretaundulata)，馬鈴薯葉曱(Leptinotarsadecemli腦ta)，黃瓜十一星葉曱亞種(Diabroticaundecimpunctataundedmpunctata,)黃瓜十一星葉甲食根亞種(Diabroticaundecimpunctatahowardi)，Diabroticabarberi，和玉米根葉甲(Diabroticavirgifera)。本發(fā)明的另一個目的是提供使植物抗鞘翅目昆蟲的方法以及控制鞘翅目昆蟲的方法，所述的方法包括4吏用編碼本發(fā)明的ISP蛋白的DNA序列轉(zhuǎn)化植物，特別是玉米，然后大田種植、播種或栽培所述植物。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的ISP蛋白與其它殺昆蟲蛋白或蛋白組合，優(yōu)選對玉米根蟲具有毒性的蛋白相聯(lián)合。本發(fā)明還提供ISP1A或ISP2A的等價物，其優(yōu)選來自側(cè)孢短小芽M菌(Brevibacilluslaterosporus)菌林，特別是來自不形成晶狀包含體的側(cè)孢短小芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)菌林。利用適當?shù)姆肿恿繕擞浽跇藴实?-10%SDS-PAGE^^電泳中確定，這類等價物的分子量優(yōu)選地為ISP1A等價物約95到約100kD,ISP2A等價物約45到約50kD。本發(fā)明優(yōu)選實施方案的詳細描述依照本發(fā)明，我們分離并表征了新的細菌毒素和編碼它們的DNA序列。所述的新蛋白命名為ISP1A和ISP2A，編碼它們的DNA序列分別為isplA和isp2A。依照本發(fā)明，"ISP1A蛋白"是指包含當與適宜的ISP-支助蛋白，特別是ISP2A成熟蛋白組合被昆蟲攝入后仍保持殺昆蟲活性的SEQIDNo.2氨基,列中的最小蛋白片段的任何蛋白，所述殺昆蟲活性特別是對鞘翅目昆蟲，更特別是對玉米根蟲、棉鈴象甲和馬鈴薯甲蟲，優(yōu)選對葉甲屬(Diabrotica)種，尤其是對南部、西部和北部玉米根蟲，特別是對玉米根葉甲(Diabroticavirgifera)的殺昆蟲活性。這包括任何具有下述^^*列的蛋白，所述的氨基酸序列包含SEQIDNo.2中從第32或38位優(yōu)選第38位氮基酸到第768位至871位氨基酸中的一個位置的M酸序列；特別是任何具有下述M酸序列的蛋白，所述的M酸序列包含至少SEQIDNo.2中從第38到第768位氨基酸的序列。這也包括通過從SEQIDNo.2的氨基酸序列中切除部分或全部N-末端信號肽序列所獲得的蛋白，或者其中的信號肽被另一(如植物的)引導(dǎo)肽、甲硫氨酸或甲硫氨酸-丙氨酸二肽替換的蛋白。具體地，這包括含有原核或真核(如細菌或植物)的N-末端分泌或靶向信號肽的蛋白。這還包括含有上述最小毒性蛋白片段的雜合或嵌合蛋白，如本發(fā)明的ISP2A蛋白和ISP1A蛋白之間的雜合體。而且，用昆蟲消化液處理后獲得的保持了殺昆蟲活性的ISP1A蛋白的蛋白酶抗性片段也包含在此處所用到的名稱"ISP1A"中，所述的昆蟲消化液優(yōu)選是鞘翅目昆蟲消化液，特別是鞘翅目昆蟲腸道蛋白酶，優(yōu)選玉米根蟲蛋白酶，如半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。具體說來，所述的鞘翅目昆蟲選自玉米根蟲，棉鈴象甲和馬鈴薯曱蟲，葉甲屬(Diabrotica)種，玉米才艮葉甲(Diabroticavirgifera)，Diabroticabarberi，黃瓜十一星葉甲(Diabroticaundeeimpuncata)，馬鈴著葉甲(Leptinotarsadecemlineata)和墨西哥棉鈴象(Anthonomusgrandis)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，在不同時或相繼提供ISP支助蛋白，如ISP2A蛋白的情況下，根據(jù)本發(fā)明的ISP1A蛋白被單獨才l^v時沒有殺昆蟲活性。依照本發(fā)明，"ISP2A蛋白"是指包含當與適宜的ISP-支助蛋白，特氨基^列中的最小蛋白片段的任何蛋白，所述殺昆蟲活性特別是對鞘翅目昆蟲，更特別是對玉米根蟲、棉鈴象曱和馬鈴薯曱蟲，優(yōu)選對葉曱屬(Di3brotk3)種，尤其是對玉米才艮葉甲(Diabroticavirgifera)，Diabroticabarberi，黃瓜十一星葉甲(Diabroticaundecimpuncata)的殺昆蟲活性。這包括任何具有下述M酸序列的蛋白，所述的M酸序列包含SEQIDNo.4中從第43或51位優(yōu)選第51位氨基酸到第449位至457位氨基酸中的一個位置的M酸序列；特別是任何具有下述氨基酸序列的蛋白，所述的氨基酸序列包含至少SEQIDNo.4中從第51到第449位氬基酸的序列。這也包括從SEQIDNo.4的氨基酸序列中切除該蛋白的部分或全部N-末端信號肽序列所獲得的蛋白，以及其中的信號肽被另一(如植物的)引導(dǎo)肽、甲硫氨酸或曱硫氨酸-丙氨酸二肽替換的蛋白。具體地，這包括含有原核或真核(如細菌或植物)的N-末端分泌或耙向信號肽的蛋白。這還包括含有上述最小毒性蛋白片段的雜合或嵌合蛋白，如本發(fā)明的ISP2A蛋白和ISP1A蛋白之間的雜合體。而且，用昆蟲消化液處理后獲得的保持了殺昆蟲活性的ISP2A蛋白中的蛋白酶抗性片段也包含在此處所用到的名稱"ISP2A"中，所述的昆蟲消化液優(yōu)選是鞘翅目昆蟲消化液，特別是鞘翅目昆蟲腸道蛋白酶，如半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，在不同時或相繼提供ISP支助蛋白，如ISP1A蛋白的情況下，根據(jù)本發(fā)明的ISP2A蛋白被單獨攝入時沒有殺昆蟲活性。此處所用的"ISP-支助蛋白"是指當與一種本發(fā)明的ISP蛋白組合,皮昆蟲特別是鞘翅目昆蟲損k后具有殺昆蟲活性的蛋白，其包括但不限于成熟的ISP1A或ISP2A蛋白，所述的昆蟲優(yōu)選是玉米根蟲、棉鈴象甲或馬鈴薯甲蟲，尤其是玉米根葉甲(Diabroticavirgifera)，Diabroticabarberi，黃瓜十一星葉甲(Diabroticaimdecimp獄ata)或墨西哥棉鈴象(Anthonomusgrandis)。具體地，WO98/44137，WO94/21795和WO96/10083中所述的V1P蛋白及其活性片段，尤其是切除了信號序列的成熟VIP蛋白也是本發(fā)明的ISP-支助蛋白。ISP1A蛋白的理想ISP-支助蛋白是ISP2A蛋白或者美國專利5，990，383中所描述的VIP2Aa或VIP2Ab蛋白或其活性片段(例如去除了信號序列的成熟蛋白)，或與ISP2或VIP2蛋白之任一種具有至少50%、優(yōu)選至少75。/。、特別是至少85%序列同一性且與成熟的ISP1A蛋白組合被昆蟲，優(yōu)選鞘翅目昆蟲，特別是玉米根蟲攝入后具有殺昆蟲活性的任何細菌分泌蛋白。ISP2A蛋白的理想ISP-支助蛋白是成熟的ISP1A蛋白或如美國專利5，9卯，383中所描述的VIPlAa或VIPlAb蛋白或其活性片段(例如去除了信號序列的成熟蛋白)，或與ISP1或VIP1蛋白之任一種具有至少50%、優(yōu)選至少75%、特別是至少85%序列同一性且與成熟的ISP2A蛋白組合被昆蟲，優(yōu)選鞘翅目昆蟲，特別是玉米根蟲才聶入后具有殺昆蟲活性的任何細菌分泌蛋白。為避免混淆，ISP-支助蛋白和ISP蛋白總是指不同的蛋白。12在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，當在標準昆蟲食物上進行表面污染試驗時，本發(fā)明的ISP蛋白或其等價物以如下濃度單獨使用時(即不存在任何ISP支助蛋白)優(yōu)選對玉米根蟲幼蟲特別是玉米根葉甲(Diabroticavirgifera)不表現(xiàn)明顯的殺昆蟲活性，所述濃度為這些蛋白的組合(每一種蛋白均以此濃度應(yīng)用)可以導(dǎo)致玉米根蟲幼蟲，尤其是玉米根葉甲(Diabroticavirgifera)100%死亡率的濃度。具體地i兌，在使用標準的玉米根蟲食物的表面污染試驗中以70ng/cn^的濃度單獨應(yīng)用ISP1蛋白時，本發(fā)明的ISP1蛋白并不引起玉米根葉曱(Diabroticavirgifera)幼蟲的明顯死亡(即，與僅使用緩沖液的對照沒有區(qū)別)，在使用標準的玉米根蟲食物的表面污染試驗中以36ng/cm2的濃度單獨應(yīng)用ISP2蛋白時，本發(fā)明的ISP2蛋白并不引起玉米根葉甲(Diabroticavirgifera)幼蟲的明顯死亡(即，與僅使用緩沖液的對照沒有明顯的區(qū)別)，而在這些濃度下將ISPl和ISP2—起使用在同種類型的試驗中可以使這些幼蟲的死亡率達到100%。此處所用到的"ISP1A等價物"或"ISP2A等價物"是指這樣的蛋白，當將其與ISP-支助蛋白二元組合應(yīng)用于耙昆蟲時，優(yōu)選被這樣的昆蟲^聶取時其對靶昆蟲的毒性分別與ISP1A或ISP2A蛋白對耙昆蟲的毒性相同或基本相同，而且其分別與ISP1A或ISP2A蛋白具有基本相同的氨基,列。按標準8-10%SDS-PAGE^!^電泳確定的分子量分別為約45到約50kD和約95到約100kD且在組合而非單獨使用時對玉米根蟲幼蟲有明顯的殺昆蟲活性的細菌蛋白，優(yōu)選來自側(cè)孢短小芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)，特別是不產(chǎn)生晶狀包含體的側(cè)孢短'J、芽孢桿菌(Brevibacilluslat園porus)的該細菌蛋白也包含在ISP1A或ISP2A等價物的定義內(nèi)。在提及對靶昆蟲施用ISP蛋白(或其等價物)和ISP-支助蛋白以取得殺昆蟲效果時，所使用的術(shù)語"組合"包括同時施用(即，在相同的銅料，細胞或組織中同時施用于昆蟲或由昆蟲攝入)和分開地相繼施用(即，施用一個之后再施用另外一個，但不是同時施用或攝入)本發(fā)明的ISP蛋白(或其等價物)和ISP-支助蛋白，只要能如期在昆蟲的消化道中同時發(fā)現(xiàn)這些蛋白即可。因此，本發(fā)明的ISP1A蛋白可以在植物根部的某種細胞類型或某個區(qū)域表達，而本發(fā)明的ISP2A蛋白可以在同一植物根部的另一種細胞類型或另一區(qū)域表達，以致只有當根物質(zhì)被攝入后上述蛋白才能相互作用。ISP蛋白或其等價物在植物，特別是玉米根部的表達及ISP-支助蛋白在與才M目關(guān)的細菌如根瘤菌(rhizobacteria)菌林中的表達(或反過來)也包括于此。此處所用到的有關(guān)ISP蛋白和ISP等價物蛋白"對靶昆蟲的相同毒性，，是指，在適宜的ISP支助蛋白存在時1SP蛋白引起的平均死亡率與在同樣的適宜1SP支助蛋白存在時ISP等價物引起的平均死亡率沒有明顯的差異。具體說來，這是指ISP蛋白的LC50的95%置信界限(在適宜的ISP支助蛋白存在下進行試驗時)與ISP等價物的LC50的95%置信界限(在適宜的ISP支助蛋白存在下進行試驗時)相重疊的情況。此處所用到的有關(guān)1SP蛋白和1SP等價物蛋白"對靶昆蟲的基本相同的毒性"是指優(yōu)選當這些蛋白在植物中表達時，由ISP和ISP等價物蛋白引起的乾昆蟲的平均死亡率水平有明顯的差異，但這些死亡率仍處于可用于控制或殺死相關(guān)靶昆蟲的殺昆蟲活性范圍內(nèi)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，當在相同的實驗條件下相同的(重復(fù)的)體外實驗中這些蛋白對靶昆蟲的LC50值相差2到100,優(yōu)選2到50,特別是2到20，最優(yōu)選2到10倍時，所述蛋白對乾昆蟲具有基本相同的毒性。同樣，可以用功能類似的氨基酸替換ISP1A或ISP2A蛋白中的某些氨基酸以獲得ISP1A或ISP2A等價物。例如，所述序列中的一個或多個J^酸可用具有相似極性的其它M酸作為功能等價物進行替代，導(dǎo)致就所述蛋白功能而言的沉默改變。序列中的氨基酸的替代物可以選自該氨基酸所屬類型中的其它氨基酸。例如，非極性的(疏水的)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲疏氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸，賴氨酸和組氨酸。帶負電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。用上述相同類型中的氨基酸進行保守M酸替換所得的、與原始蛋白相比對靶昆蟲保持了基本相同的殺昆蟲活性的蛋白也包含于此作為本發(fā)明的ISP蛋白的等價物。此處所用的與ISP1A蛋白有"基本上相同的M,列"的蛋白是指與ISP1A蛋白具有至少90%,尤其是至少95%,優(yōu)選至少97%序列同一性的蛋白，其中序列同一性百分數(shù)是用WisconsinGCG軟件包(Madison，Wisconsin,USA)10.0版(用GCG缺省值)中的GAP程序里的blosum62評分矩陣確定的。在本申請中沿用的"序列同一性，，當涉及蛋白時是指用此指定的分析方法得到的同一氨基酸的百分數(shù)。此處所用的"序列同一性"當涉及DNA序列時是用WisconsinGCG軟件包(Madison,Wisconsin,USA)IO.O版(用GCG缺省值)中的GAP程序里的nwsgapdna評分矩陣確定的。此處所用的"ISP蛋白"或"本發(fā)明的ISP蛋白，，是指本發(fā)明中的任意一種新蛋白，此處表示為ISP1A或ISP2A蛋白或它們的等價物。"ISP原毒素"是指由天然存在的細菌DNA序列編碼的包括信號肽在內(nèi)的全長1SP1A或1SP2A蛋白。"ISP毒素，，是指其中的殺昆蟲片段，特別是其最小毒性片段或已去除了信號肽的成熟蛋白。此處所用的"成熟的ISP"是指由天然的細菌宿主細胞分泌出的本發(fā)明的ISP蛋白，其與ISP-支助蛋白(沒有N末端細菌信號肽序列)組合具有殺昆蟲活性。成熟的ISP蛋白可以具有完整的天然C末端也可以是C-末端截短的蛋白。由細菌，優(yōu)選非蘇云金芽孢桿菌(B.Thuringiensis)或蠟狀芽M茵(B.ccrcus)的細菌，特別是側(cè)孢短小芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)分泌的、成熟形式的表觀分子量為約95到約100kD、且特征在于當與下述第二蛋白或其具有殺昆蟲活性的片段相組合時具有顯著的殺昆蟲活性的第一蛋白，或所述第一蛋白中具有殺昆蟲活性的片段也作為ISP蛋白包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其中所述的第二蛋白是由細菌，優(yōu)選不是蘇云金芽孢桿菌(B.Thurindensis)或蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)細菌，特別是側(cè)孢短小芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)分泌的、成熟形式的表爿見分子量為約45到約50kD，優(yōu)選約45kD的蛋白，其中所述第一和所述第二蛋白或它們的殺昆蟲片段的組合在被昆蟲攝入后對馬鈴薯甲蟲、西部玉米根蟲、南部玉米根蟲和北部玉米根蟲的幼蟲具有明顯的殺昆蟲活性，但所述蛋白組合被玉米螟(Ostrinianubilalis)、草地粘蟲(Spodopterafrugiperda)、煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)、美洲棉鈴蟲(Hclicovcrpazcb)和Sesamianonagroides賴Uv后沒有明顯的殺昆蟲活性，且其中所述的第一蛋白單獨被昆蟲損k后也沒有明顯的殺昆蟲活性。與上述第一蛋白組合被昆蟲摘入后具有殺昆蟲活性的上述第二蛋白也包括在本發(fā)明內(nèi)。此處所用到的"^Jf見分子量，，是以分子量標準為參照通過SDS-PAGE分析顯示的分子量。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道這一分子量是近似確定的分子量，與基于M酸序列確定的分子量相比可以有約10-15%的差異。此處所用的術(shù)語"isplADNA"或"isp2ADNA"是指分別編碼以上定義的ISP1A或ISP2A蛋白的DNA序列。這包括編碼以上定義的新分離蛋白或其片段的天然、人工的或合成的DNA序列，特別是經(jīng)修飾后具有與植物中的密碼子使用更為匹配的密碼子使用的DNA序列。編碼ISP1A和ISP2A蛋白的人工DNA序列的例子分別如SEQIDNos.9和7(由這些DNA序列編碼的ISP蛋白在此處定義為ISP1A-1和ISP2A-1)所示。編碼殺昆蟲蛋白并與SEQIDNo.1,3，7或9DNA序列足夠相似以致于能夠與這些DNA序列在嚴緊條件下雜交(即，有這種能力)的DNA序列也包含于此。此處所用到的"嚴緊雜交條件"特別是指在其中仍可獲得雜交的下述條件將第一DNA序列固定在濾膜上，于50%甲酰胺，5%SSPE，2xDenhardt氏試劑和0.1%SDS中于42。C預(yù)雜交l到2小時，或在6xSSC，2xDenhardt氏試劑和0.1%SDS中于68°C下預(yù)雜交1到2小時。然后將變性的放射性標記的第二DNA直接加到預(yù)雜交液中，在任意一個以上選擇的溫度下溫育16到24小時。溫育后將上述濾膜在室溫下用lxSSC，O.l。/。SDS洗20分鐘，然后在68。C下用0.2xSSC和0.1%SDS洗3次，各20分鐘。使用增感屏將上述的濾膜對X-光片(KodakXAR-2或其等價物)于-70。C曝光24到48小時得到放射自顯影像。當然，上述過程中也可以使用等價的條件和參數(shù)而仍能保持所需的嚴緊雜交條件。此處16所用到的嚴緊雜交優(yōu)選出現(xiàn)于至少有90%到95%，優(yōu)選至少97%，特別是99%序列同一性的DNA序列之間。包含在"isplDNA"定義中的還有編碼下述蛋白的所有DNA序列，所述的蛋白與SEQID.No.2的蛋白具有至少卯％，優(yōu)選至少95%，特別是至少97%，最優(yōu)選至少99%的序列同一性，而且其與SEQID.No.2所示蛋白具有基^目同，優(yōu)選相同的殺昆蟲活性，其中所述蛋白序列同一性是用WisconsinGCG軟件包(Madison，Wisconsin,USA)10.0版(用GCG缺省值)中的GAP程序里的blosum62評分矩陣確定的。包含在"isp2DNA，，定義中的還有編碼下述蛋白的所有DNA序列，所述的蛋白與SEQID.No.4的蛋白有至少90%,優(yōu)選至少95%，特別是至少97%,最優(yōu)選至少99%的序列同一性，并且其與SEQID.No.4所示蛋白具有基本相同，優(yōu)選相同的殺昆蟲活性，其中所述蛋白序列同一性是用WisconsinGCG軟件包(Madison，Wisconsin,USA)10.0版(用GCG缺省值)中的(;AP程序里的blosum62評分矩陣確定的。此處所用的"^j2基因"或"1^EDNA"是編碼本發(fā)明的ISP蛋白的DNA序列，指4壬何一種上述定義的isplA或isp2ADNA序列。此處所用到的"i^DNA等價物"或"i^基因等價物"是編碼上述定義的ISP等價物蛋白的DNA。此處所用到的術(shù)語"含序列X的DNA/蛋白"和"具有含序列X的序列的DNA/蛋白"是指在其核香酸序列或氨基酸序列中包括或含有至少序列X的DNA或蛋白，因此可以在5，(或N-末端)和/或3，(或C-末端)端包括其它核苷酸或^J^酸序列，例如N-末端轉(zhuǎn)運肽或信號肽。此處所用的術(shù)語"包含"是一種開放式的表述，是"包括"的意思，指不是特指元件的其它元件也可以存在。此處所用術(shù)語"由…組成"是一種封閉式的表述，即僅存在那些特指元件。此處所用的術(shù)語"編碼含序列X的蛋白的DNA"指含有下述編碼序列的DNA，所述的編碼序列經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯后形成至少包含氨基酸序列X的蛋白。編碼蛋白的DNA無需是天然存在的DNA，可以是半合成的，全合成的或人工DNA，并可以包括內(nèi)含子和5，和/或3，側(cè)翼區(qū)。此處所用的術(shù)語"核苷酸序列"指DNA或RNA分子的序列，所述分子可以是單鏈或雙鏈形式。此處所用的術(shù)語"基因"指側(cè)翼帶有可使能翻譯成蛋白的RNA得以轉(zhuǎn)錄的5，和/或3，調(diào)節(jié)序列的DNA編碼區(qū)，典型地，所述的調(diào)節(jié)序列至少包含啟動子區(qū)。對于本發(fā)明的J5fiDNA,"嵌合基因"是指具有不同于在天然的宿主細胞中驅(qū)動ISP蛋白表達的天然細菌5，和/或3，調(diào)節(jié)序列的5，和/或3'調(diào)節(jié)序列的j^DNA序列。此處所用到的"殺昆蟲活性"或"殺昆蟲作用"當指本發(fā)明的ISP蛋白或其等價物時是指當昆蟲，優(yōu)選鞘翅目昆蟲，特別是玉米根蟲，尤其是玉米根葉甲(Diabroticavirgifera)才"ISP蛋白與ISP支助蛋白如第二ISP蛋白后，ISP蛋白殺死昆蟲的能力比相同的實驗條件下對照處理的殺昆蟲水平高。優(yōu)選地，所述的第二ISP蛋白是由與第一ISP蛋白相同的細菌操縱子編碼的另一蛋白或其具殺昆蟲活性的片段或其等價物，從而當昆蟲攝入此蛋白組合時能獲得最佳的昆蟲死亡率。ISP蛋白的"昆蟲控制量"是指在與ISP-支助蛋白組合應(yīng)用這樣的ISP蛋白時，足以將以該植物為食的昆蟲對所述植物的損害限制在商業(yè)上可接受的水平的ISP蛋白的量，所述限制可以通過例如殺死昆蟲或抑制昆蟲的發(fā)育或生長從而降低它們對植物的損害且對植物的產(chǎn)量不造成明顯的負面影響的方式來實現(xiàn)，其中所述的1SP-支助蛋白是例如另一種ISP蛋白，優(yōu)選由與第一ISP蛋白相同的操縱子編碼的另一蛋白或其具有殺昆蟲活性的片段。此處所用到的"有殺昆蟲作用的ISP片段"是指本發(fā)明的ISP蛋白的片段，其在與ISP支助蛋白，如另一種ISP蛋白，優(yōu)選由與第一ISP蛋白相同的操縱子編碼的另一ISP蛋白組合施用時保持殺昆蟲活性。在上述涉及殺昆蟲活性的定義中，所述的昆蟲優(yōu)選地是處于任何幼蟲階段的幼蟲。本申請中會提到"I^DNA和其具有殺昆蟲活性的片段或等價物"，在此種情況下所述的殺昆蟲活性顯然是指由所述DNA編碼的蛋白的活性，而非DNA本身的殺昆蟲活性。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的ISP蛋白及其等價物，尤其是成熟的ISP1A和ISP2A蛋白對選自煙芽夜蛾(Hdiothisviresceiis)，美洲棉鈴蟲(Helicoverpazea)，煙草天蛾(Manducasexta)，棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)，?；页嵋苟?Spodopteralittoralis)，草地粘蟲(Spodopterafrugiperda),Sesamianonagroides和玉米螺(Ostrinianubilalis)的蜂翅目昆蟲沒有明顯的殺昆蟲活性。依照本發(fā)明，通過使編碼ISP蛋白的DNA序列在轉(zhuǎn)基因植物中表達，可使對本發(fā)明的ISP蛋白或其等價物敏感的靶昆蟲與昆蟲控制量，優(yōu)選殺昆蟲量的上述蛋白相接觸。只有當所述的靶昆蟲才聶入植物組織時，其才受這些殺昆蟲蛋白的影響。因此，本發(fā)明的另一個目的是提^H吏植物具有殺鞘翅目昆蟲活性的方法以^^控制鞘翅目昆蟲的方法，所述的方法包括在田地里種植、播種或栽培用編碼本發(fā)明的ISP蛋白的DNA序列轉(zhuǎn)化的植物，特別是玉米?？梢酝╥t^領(lǐng)域已知的方法去除或修飾本發(fā)明的ISP蛋白的信號肽，參見例如已發(fā)表的PCT專利申請WO96/10083，或者可以用下述的肽替換所述的信號肽，所述肽為將所述蛋白轉(zhuǎn)運到葉綠體的葉綠體轉(zhuǎn)運肽(例如,VanDenBroeck等，1985，Nature313,358，或優(yōu)選美國專利5，510,471中的經(jīng)修飾的葉綠體轉(zhuǎn)運肽)、分泌信號肽或使所述蛋白單巴向其它質(zhì)體、線粒體、ER或另一種細胞器的肽，或者可以用甲硫氨酸或甲疏氨酸-丙氨酸二肽替換ISP蛋白的信號肽。使蛋白靶向胞內(nèi)細胞器或分泌到植物細胞外或細胞壁的信號序列存在于天然存在的耙向或分泌蛋白中，優(yōu)選在下述文獻中描述的那些K16sgen等(1989,Mol,Gen.Genet.217，155-161)，K16sgen和Weil(1991，Mol.Gen.Genet.225，297-304)，Neuhaus&Rogers(1998,PlantMol.Biol.38，127-144)，Bih等(1999，J,Biol.Chem.274，2288422894)，Morris等(1999，Biochem.Biophys.Res.Commun.255，328-333)，Hesse等(1989，EMBO丄82453-2461),Tavladoraki等(1998，F(xiàn)EBSLett.426,62-66),Terashima等(1999,Appl.Microbiol.Biotechnol.52，516-523)，Park等(1997,J.Biol.Chem.272，6876-6881)，Shcherban等(1995，Proc.Natl.Acad.SciUSA92，9245-9249)(所有這些文獻引A^文作為參考)，尤其是來自玉米的靶向或分泌蛋白的信號肽序列。盡管可以將編碼這類植物信號肽的DNA序列插入到編碼ISP1A的嵌合基因中和編碼ISP2A的嵌合基因中用于在植物中表達，但在本發(fā)明的一個實施方案中，編碼這類信號肽的DNA序列僅被插入到嵌合的ISP2A基因中，而嵌合的ISP1A基因中缺少信號肽或者由甲疏氨酸或曱疏氨酸-丙氨酸二肽替代了所述的信號肽。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，如Gleba等(1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA25，5973-5977)和Borisjuk等，1999(Nat.Biotechn.17，466-469)中所述，用強的根優(yōu)先啟動子(特別是來自玉米的強的根優(yōu)先啟動子)和使蛋白從根細胞向外分泌的N-末端信號肽(優(yōu)選來自玉米的信號肽，特別是分泌蛋白的信號肽，優(yōu)選選自青霉殺菌素、a-淀粉酶、多胺氧化酶、細胞分裂素氧化酶、內(nèi)切木聚糖酶的玉米分泌蛋白的信號肽)，使所述的蛋白從根分泌出來。包含在本發(fā)明范圍內(nèi)的植物有玉米，棉花，大豆，豌豆，蠶豆，兵豆,馬鈴薯，番癡，煙草，萵苣，蕓苔科植物，甘蔗，稻，油菜籽，芥菜，蘆夢，小麥，大麥，咖啡，茶，葡萄，橡膠植物，甜菜，草皮草，高粱，燕麥，黑麥，洋蔥，胡蘿卜，韭菜，黃瓜，南瓜，甜瓜，向曰葵，特別是易受鞘翅目昆蟲損害的任何植物，最優(yōu)選玉米，所述的鞘翅目昆蟲優(yōu)選玉米根蟲、馬鈴薯甲蟲或象曱，特別是葉曱屬(Diabrotica)或馬鈴薯葉曱屬(Leptinotarsa)種的昆蟲，最優(yōu)選選自下組的任何昆蟲玉米根葉曱(Diabroticavirgifera),Diabroticabarberi，黃瓜十一星葉甲(Diabroticaundecimpuncata)，馬鈴薯葉甲(Leptinotarsadecemlineata)和墨西哥棉鈴象(Anthonomusgrandis)。此處所用到的"玉米"指所有的玉蜀黍(Zea呵s)種的植物、及各種玉蜀黍的種子、根或谷粒、或包含玉米細胞或直接由玉米細胞產(chǎn)生的其它材料，所述玉蜀黍包括但不限于飼料玉米、甜玉米、雜交玉米、白玉米和臼齒形玉米，其既可是雜交系也可是近交系。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的玉米是產(chǎn)生雜交玉米的適宜親M系，最優(yōu)選的是它們已經(jīng)具有內(nèi)源或轉(zhuǎn)基因抗昆蟲性，這4吏它們可以抗主要的玉米鱗翅目病蟲害，其包括但不限于玉米螟(Ostrinianubilalis)。本發(fā)明的ISP1A和ISP2A蛋白可以按常規(guī)的方式從依照布達佩斯條約的規(guī)定于2000年1月11日保藏在BCCM-LMBP(比利時微生物協(xié)調(diào)保藏中心-分子生物學(xué)實驗室-普拉斯米得科萊特(LMBP)，根特大學(xué),K丄.萊德甘克街35，B-9000根特，比利時(BelgianCoordinatedCollectionsofMicroorganisms-LaboratoriumvoorMoleculaireBiologie-Plasmidencollectie,UniversityofGent,K丄.Ledeganckstraat35,B-9000Gent,Belgium)、保藏號為LMBP4009的大腸桿菌菌林中分離出來，或更優(yōu)選地，上述蛋白可以從如下芽孢桿菌(Bacillus)菌抹的上清液中分離，所述的芽孢桿菌優(yōu)選是用含有質(zhì)粒pUCIB120/ISP(保藏號為LMBP4009)中的約7kbA^"I-EcoRI片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的無晶體蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)。所述的ISP蛋白可用于通過常規(guī)的方法制備特異的單克隆或多克隆抗體(H6fte等，1988，Appl.Environm.Microbiol.54，2010)。所述的ISP蛋白可以用蛋白酶，如半胱氨酸蛋白酶處理，以獲得ISP蛋白的蛋白酶抗性片段。編碼ISP蛋白的DNA序列可由常規(guī)的方法從所保藏的菌林中分離也可以在所編碼的M酸序列的基礎(chǔ)上合成。編碼本發(fā)明的其它ISP蛋白的DNA序列可通過下述方式鑒定用限制性酶消化由分離菌林獲得的總DNA;按大小分級分離由此產(chǎn)生的DNA片段，得到5到10Kb,優(yōu)選7到10Kb的DNA斷片；將這些斷片與克隆載體相連接；用下述DNA探針篩選由所述克隆載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，所述的DNA探針為由已知的ISP蛋白基因的區(qū)域構(gòu)建的DNA探針，或基于通過相應(yīng)于已知isp蛋白基因的某個區(qū)域的引物從Medna產(chǎn)生的特定PCR片段的DNA探針。與本發(fā)明的ISP蛋白類似，根據(jù)本發(fā)明分離的這種"其它ISP蛋白"以任一個或4^P，優(yōu)選全部下迷特性為特征a)當這種所謂的其它ISP蛋白與ISP-支助蛋白，優(yōu)選本發(fā)明的成熟ISP1A或ISP2A蛋白被昆蟲攝入后，它們對南部玉米根蟲、黃瓜十一星葉甲的幼蟲和馬鈴薯甲蟲、馬鈴薯葉甲(Leptinotarsadecemlineata)的幼蟲具有明顯的殺昆蟲活性；b)當這種所謂的其它ISP蛋白與ISP-支助蛋白，優(yōu)選本發(fā)明的成熟ISPlA或ISP2A蛋白被昆蟲才t7v后，它們對鱗翅目昆蟲，優(yōu)選玉米螟(Ostrinianubilalis)不具有明顯的殺昆蟲活性；c)其成熟形式(不21含信號肽)的表觀分子量為約lOOkD或約45kD;d)它們存在于細菌培養(yǎng)物的上清液中，所述的細菌不是蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)或蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus);和e)在無ISP-支助蛋白存在的情況下被昆蟲4IUV后，它們對玉米根蟲，優(yōu)選玉米根葉甲(Diabroticavirgifera)沒有明顯的毒性。當然，可以根據(jù)特定的目的構(gòu)建出在密碼子使用上存在差異，但編碼相同蛋白或具有基本上相同的殺昆蟲活性的類似蛋白的任何其它DNA序列。已有報道在一些原核和真核表達系統(tǒng)中將密碼子使用改變?yōu)樗拗鞯拿艽a子使用對于基因在外源宿主中的表達是理想的(Bennetzen&Hall，1982，J.Biol.Chem.257,3026;Itakura,1977，Science198，1056-1063)。密碼子使用表可以從文獻(Wada等，1990，Nucl.AcidsRes.18，2367-1411;Murray等，1989，NucleicAcidsResearch17，477-498)和主要的DNA序列數(shù)據(jù)庫中獲得。由此可以構(gòu)建合成的DNA序列以產(chǎn)生相同或基本上相同的蛋白。顯然，當本發(fā)明的ISP蛋白的^J^酸序列已知時可以設(shè)計幾種DNA序列。這樣的其它DNA序列包括經(jīng)改變以^J^因中的某些位點失活的合成的或半合成的DNA序列，所述改變可通過例如選擇性滅活存在于天然序列中的某些隱藏的調(diào)節(jié)或加工元件、或通過調(diào)節(jié)全部的密碼子使用使之適應(yīng)更相關(guān)的宿主生物(優(yōu)選需要在其中表達所述DNA序列的宿主生物)的密碼子使用來進行。合成的DNA序列也可以按EP0385962，EP0618967或EP0682115所描述的方法產(chǎn)生。對DNA序列進行的小修飾如上述的小修飾可以通過PCR介導(dǎo)的誘變常規(guī)進行(Ho等，1989，Gene77，51-59;White等，1989，TrendsinGenet.5，185-189)。新的合成的或半合成的基因可通過自動DNA合成然后連接所得的DNA片段來制備。為阻止或延遲鞘翅目昆蟲，特別是玉米根蟲、棉鈴象甲或馬鈴薯曱蟲，優(yōu)選馬鈴薯葉甲(Leptinotarsadecemlineata)、Diabroticabarberi、Diabroticaundecimpuncata、墨西哥棉鈴象(Anthonomusgrandis)或玉米根葉甲(Diabroticavirgifera)對表達本發(fā)明的ISP蛋白或其等價物的轉(zhuǎn)基因宿主(特別是植物)產(chǎn)生抗性，優(yōu)選在相同的宿主(優(yōu)選轉(zhuǎn)基因植物)中再表達另一種當其在轉(zhuǎn)基因宿主(優(yōu)選植物)中產(chǎn)生后以不同的作用方式對上述第一種毒素或毒素復(fù)合物所靶向的同種昆蟲產(chǎn)生高毒性的蛋白或蛋白復(fù)合物。適合與本發(fā)明的ISP1A和ISP2A相組合的侯選蛋白包括與PCT出版物WO96/10083中的成熟VIP2Aa或VIP2Ab蛋白組合的成熟VIPlAa蛋白，條件是這些VIP蛋白與所述的ISP蛋白相比具有不同的作用方式；Photorhabdus或致病桿菌屬(Xenorhabdus)種的玉米根蟲毒素，例如發(fā)光桿菌(Photorhabdusluminescens)W-14的殺昆蟲蛋白(Guo等，1999，丄Biol.Chem.274，9836-9842);WO00/26378中的CryET70蛋白；WO97/40162中所描述的Bt菌林PS80JJ1，PS149B1和PS167H2產(chǎn)生的殺昆蟲蛋白，特別是Bt菌林PS149B1的約14kD和約44kD蛋白；美國專利6,023,013中的Cry3Bb蛋白；蛋白酶抑制劑，例如大豆N2和Rl半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Zhao等，1996，PlantPhysiol.111，1299-1306)，或oryzastatine如水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Genbank登錄號S49967),玉米半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Genbank登錄號D38130，D10622,D63342)例如Irie等(1996，PlantMol.Biol.30，149-157)描述的在植物中表達的玉米半胱氨酸蛋白酶抑制劑。上述蛋白的所有等價物和變異體，如保持殺昆蟲活性的截短蛋白也包括在此中。這種組合表達可以通過如下方式實現(xiàn)對經(jīng)轉(zhuǎn)化已表達玉米根蟲毒素蛋白或蛋白復(fù)合物的植物進行轉(zhuǎn)化，或使經(jīng)轉(zhuǎn)化表達不同玉米根蟲毒素蛋白的植物雜交?；蛘撸梢栽谟衩赘x幼蟲攝食根組織時誘導(dǎo)本發(fā)明的ISP蛋白在根中表達，例如用損傷誘導(dǎo)型啟動子區(qū)域，優(yōu)選損傷誘導(dǎo)型根優(yōu)先的啟動子區(qū)域來進行誘導(dǎo)?？梢詫谋景l(fā)明isp基因的總DNA制備的5到10，優(yōu)選7到10Kb的片段與合適的表達載體相連然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，再用針對ISP蛋白的單克隆或多克隆抗體通過常規(guī)的菌落免疫探測方法(French等，1986，Anal.Biochem.156，417-423)篩選表達所述毒素的克隆。還可以將由本發(fā)明的細菌菌林的總DNA制備的5到10Kb的片段與合適的Bt穿梭栽體(Lereclus等，1992，Bio/Technology10,418)相連接，然后轉(zhuǎn)化無晶體Bt突變體。之后篩選產(chǎn)生ISP蛋白的克隆(通過SDS-PAGE，Western印跡和/或昆蟲實驗)。編碼本發(fā)明的ISP蛋白的基因可以通過常規(guī)的方法測序(Maxam和Gilbert,1980,MethodsinEnzymol,65，499-560;Sanger,1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-5467)以獲得其DNA序列。序列比較顯示所述的基因與以前描述的芽孢桿菌或其它細菌菌種在營養(yǎng)生長階段分泌的蛋白的編碼基因以及具有抗鞘翅目昆蟲活性的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)晶體蛋白的編碼基因均不同(Crickmore,等，1998，MicrobiologyandMolecularBiologyReviewsVol62:807-813;WO98/44137，WO94/21795,WO96/10083，WO00/09697，WO9957282和WO9746105)。為了在大腸桿菌、其它細菌菌林或植物中表達編碼本發(fā)明ISP蛋白的DNA序列的全部或有殺昆蟲活性的部分，可以在所述DNA序列的兩側(cè)引入合適的限制性位點。這可以通過已知的方法(例如，Stanssens等，1989，NucleicAcidsResearch12，4441-4454;White等，1989，同上)由定點誘變完成。為能在植物中表達，本發(fā)明的j^DNA或其等價物通常包含于兩測帶有5'和3'調(diào)節(jié)序列的嵌合基因中，所述的調(diào)節(jié)序列包括在植物中可表達的啟動子區(qū)域和在植物細胞中有活性的3'轉(zhuǎn)錄終止以及多腺苦酸化序列。為增強在植物中的表達，可對本發(fā)明的j^DNA或其等價物的密碼子使用進行修飾以形成等價的、修飾的或人工的基因或部分基因，或者，可以將所述的DNA或其有殺昆蟲作用的部分插入到葉綠體基因組中并利用在葉綠體中有活性的啟動子使之在其中表達(例如，McBride等，1995，Bio/Technology13，362)。為了增強在單子葉植物，如玉米中的表達，也可以向嵌合基因中加入單子葉植物內(nèi)含子，并且i5EDNA或其有殺昆蟲作用的部分可以進一步以翻譯上中性的方式改變，通過定點內(nèi)含子插入和/性DNA序列，例如在不明顯改變所編碼的M酸序列的情況下調(diào)整密碼24子使用使之對特定的植物而言是最優(yōu)選的(Murray等，1989，見上)。編碼ISP蛋白的有殺昆蟲作用的kfiDNA或其等價物，優(yōu)選l^fi嵌合基因可以通過常規(guī)的方法穩(wěn)定地插入到單一植物細胞的核基因組中，由此轉(zhuǎn)化的植物細胞可通過常規(guī)的方法用于產(chǎn)生抗昆蟲的轉(zhuǎn)化植物。在這一方面，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)中含有具殺昆蟲作用的isp基因部分的卸曱(disarmed)Ti質(zhì)?？梢杂糜谵D(zhuǎn)化植物細胞，其后可以用下述文獻中描述的方法從該轉(zhuǎn)化的植物細胞再生轉(zhuǎn)化植物，所述文獻例如EPO116718，EP0270822，PCT出版物WO84/02913和已7〉開的歐洲專利申請("EP")0242246和Gould等(1991，PlantPhysiol.95，426-434)。優(yōu)選的Ti-質(zhì)粒栽體均包含位于Ti-質(zhì)粒的T-DNA邊界序列之間或至少定位于右邊界序列的左側(cè)的有殺昆蟲活性的J5￡嵌合基因序列。當然，應(yīng)用下述方法，其它類型的栽體也可以用于轉(zhuǎn)化植物細胞，所述的方法如直接基因轉(zhuǎn)移(如EP0233247中所描述)，花粉介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(如EP0270356,PCT出版物WO85/01856,和美國專利4，684，611中的描述)，植物RNA病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(如EPO067553和美國專利4,407,956中所描述的)，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(如美國專利4,536,475中所描述的)，以及其它的方法例如用于轉(zhuǎn)化某些玉米林系(Fromm等，1990，Bio/Technology8，833-839;Gordon-Kamm等，1990，ThePlantCell2，603-618,US專利5，767，367)和水稻林系的方法(Shimamoto等，1989，Nature338，274-276;Datta等，1990，Bio/Technology8，736-740)和最近公開的一般用于轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法(PCT出版物WO92/09696)。為實現(xiàn)兩種ISP蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的組合表達可以應(yīng)用不同的常規(guī)方法，小結(jié)如下I.通過嵌合基因構(gòu)建體^f吏兩個ISPDNA序列和標記基因作為單一的一段DNA轉(zhuǎn)移到植物基因組中，并且插入到基因組的單一位點中。la.改造所述的基因使之處于受不同啟動子控制的不同轉(zhuǎn)錄單元中。為使兩個ISP蛋白和標記蛋白作為分離的轉(zhuǎn)錄單元表達，如上所述可以應(yīng)用在植物細胞中指導(dǎo)表達的幾個啟動子片段。對于一個ISP基因的嵌合構(gòu)建體，上述啟動子均可以組合在其中。在本發(fā)明的每一嵌合基因中的ISP編碼區(qū)可以是完整的基因，或優(yōu)選是完整ie基因中具有殺昆蟲活性的部分。依照標準的方法(例如，EP0193259)將各個嵌合基因克隆到同一質(zhì)粒載體中。Ib.可以將兩個基因(例如，和標記基因或兩個j^E基因)或更多個基因組合在同一個轉(zhuǎn)錄單元中。為在相同的轉(zhuǎn)錄單元中表達兩個基因，能夠區(qū)分出下述的情況在第一種情況中，可以將其中一個基因的編碼區(qū)按符合讀框的方式與另一基因的編碼區(qū)融合的雜合基因置于單一啟動子的控制之下?？梢允筳^基因和標記基因融合，也可以使兩個isp基因融合。而且，在兩個編碼ISP或其具有殺昆蟲活性的片段的基因之間可以包含一段編碼對蛋白酶(例如，胰蛋白酶，半胱氨酸或絲氨酸蛋白酶)敏感的蛋白部分的基因片段，例如編碼可通過靶昆蟲中腸酶的激活作用而去除或裂開的ISP蛋白部分的基因片段?；蛘?，在兩個編碼ISP或其具有殺昆蟲活性的片段的基因之間可以包含一段編碼具有約16到20個氛基酸、無須酶反應(yīng)即能介導(dǎo)在自身C末端裂解的肽的基因片段(Halpin等，1999，PlantJ.17,453-459，US專利5,846,767),或編碼接頭肽序列的基因片段，所述的接頭肽使得可以產(chǎn)生對靶昆蟲具有顯著毒性的重組細胞。在第二種情況下，可以將兩個isp基因的相應(yīng)編碼區(qū)組合于一個啟動子控制下的雙順反子單元中。兩個isP基因的編碼區(qū)彼此前后排列，中間有規(guī)定長度的基因間序列。產(chǎn)生單一的信使RNA分子，而翻譯成兩個分離的基因產(chǎn)物?；诮?jīng)修飾的掃描模型(Kozak，1987,Mol.Cell.Biol.7，3438-3445)，翻譯再起始的概念已被接受，條件是具有上游ATG的框內(nèi)的終止密碼子在下游的ATG之前。實驗數(shù)據(jù)也顯示植物的翻譯機器能由多順反子mRNA合成幾個多肽(Angenon等，1989,Mol.CellBiol.9，5676-5684)?；诜g的內(nèi)部起始機制(Jackson和Kaminski，1995，RNA1，985-1000)，第二個基因翻譯的起始是通過43S前起始復(fù)合物與特定的基因間序列(內(nèi)部核糖體ii^序列；IRES)結(jié)合而出現(xiàn)的。實驗數(shù)據(jù)也顯示植物的翻譯機器能由含基因間IRES元件的多順反子mRNA合成幾個多肽(Hefferon等，1997，JGenVirol78，3051-3059;Skulachev等，1999，Virology263，139-154;PCT專利出版物WO98/54342)。II.將帶有一個1§￡_基因的嵌合構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到已有一個1^_基因轉(zhuǎn)化到其中的植物的基因組中可在連續(xù)轉(zhuǎn)化步驟(再轉(zhuǎn)化)過程中將幾個基因引入到植物細胞中，條件是對于第二輪轉(zhuǎn)化有可供選擇的篩選轉(zhuǎn)化體的系統(tǒng)，或者選擇標記基因可通過DNA重組技術(shù)從植物基因組中切除(例如，已^Hf的PCT申請WO94/17176和WO91/09957中所描述的)。這種再轉(zhuǎn)化導(dǎo)致被引入到基因組中多個位點的isp基因的組合表達。優(yōu)選地，在兩個連續(xù)的轉(zhuǎn)化步驟中使用兩個不同的選擇標記基因。第一個選擇標記用于在第一次轉(zhuǎn)化中選擇轉(zhuǎn)化細胞，笫二個選擇標記用于在第二輪轉(zhuǎn)化中選擇轉(zhuǎn)化體。利用卡那霉素和潮霉素的連續(xù)轉(zhuǎn)化步驟已有報道，例如Sandler等(1988，PlantMol.Biol.11，301-310)和Delauney等(1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85，4300-4304)的描述。in.帶有^基因的嵌合構(gòu)建體通過獨立的轉(zhuǎn)化事件分別轉(zhuǎn)移到不同的植物核基因組中，然后通過雜交結(jié)合到單一的植物基因組中。第一植物應(yīng)當是用第一isP基因轉(zhuǎn)化的植物或通過自花授粉從該植物衍生的Fl植物(優(yōu)選具有純合isp基因的Fl植物)。第二植物應(yīng)當是用第二isP基因轉(zhuǎn)化的植物或通過自花授粉從該植物衍生的Fl植物(優(yōu)選具有純合的第二j^基因的Fl植物)。篩選由此雜交獲得的植物以獲得在其基因組中存在這兩個isp基因(如，Southern印跡)并表達這兩個ISP(例如，對免疫學(xué)上不同的ISP的單獨的ELISA檢測)的植物。這是從用不同的i^基因轉(zhuǎn)化的兩親本林系產(chǎn)生雜交變體的有用策略，并是通過來自相同近交系的兩個獨立轉(zhuǎn)化體(或它們的Fl自花授粉子代)的雜交產(chǎn)生包含兩個不同i^基因的近交系的有用策略。IV.將帶有一個或多個j^基因的嵌合構(gòu)建體通過同一個轉(zhuǎn)化實驗分別單獨地轉(zhuǎn)移到一個植物的基因組中，由此導(dǎo)致各個嵌合基因插在相同或不同的位點。共轉(zhuǎn)化涉及用兩個不同的表達載體同時轉(zhuǎn)化一^^t物，所述的表達載體一個包含第一i^基因，另一個包含第二1基因。伴隨每個|^_基因使用不同的標記基因，這樣可以利用兩個標記同時篩選。或者，可以使用一個標記，然后可以篩選足夠大量的備選植物以獲得具有兩個i^基因(例如，通過Southern印跡)并表達兩個蛋白(例如，通過ELISA的方式)的植物。用不只一個T-DNA進行的共轉(zhuǎn)染可以同時用各帶有不同的Ti質(zhì)粒的兩個不同的農(nóng)桿菌菌林來完成(Depicker等，1985，Mol.Gen.Genet.201，477-484)，或用包含兩個位于不同的質(zhì)粒上的T-DNA的一個農(nóng)桿菌來完成(deFramond等，1986，Mol.Gen.Genet.202,125-131)。用兩種質(zhì)?；蚱淦蔚幕旌衔镞M行的直接基因轉(zhuǎn)移也可以用于可選擇的基因和不可選擇的基因向植物細胞的共轉(zhuǎn)化(Schocher等，1986，Bio/technology4，1093-1096)。所得的轉(zhuǎn)化植物可以在常規(guī)的植物育種方案中應(yīng)用，以產(chǎn)生更多具有相同特征的轉(zhuǎn)化植物或?qū)⒕哂袣⒗ハx活性的isP基因引入到相同或相關(guān)植物種的其它變體中。從所述轉(zhuǎn)化植物收獲的種子包含穩(wěn)定地插入到其基因組中的殺昆蟲性isp基因。可以用常規(guī)的方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)化植物的細胞以產(chǎn)生具有殺昆蟲活性的ISP蛋白部分，可以回收該部分，將其用于常規(guī)的殺昆蟲組合物中。當然，上述在植物中組合產(chǎn)生ISP蛋白的可能方案對本發(fā)明的ISP蛋白活性片段和ISP等價物同樣適用。將具有殺昆蟲活性的i^基因插入到植物細胞基因組中，使所插入的基因可操作地連接到可指導(dǎo)所述基因在植物細胞中表達的啟動子的下游(即3，端)。優(yōu)選地這通過向植物細胞基因組，特別是細胞核或葉綠體基因組中插入嵌合的isp基因來完成。優(yōu)選的啟動子包括隔離群CM1841(Gardner等，1981，Nucl.AcidsRes.9,2871-2887)，CabbB-S(Franck等，1980,Cell21，285-294)和CabbB-JI(Hull和Howell,1987，Virology86，482-493)的花椰菜花葉病毒(CaMV)強組成型35S啟動子("35S啟動子")；遍在蛋白家族的啟動子(例如，Christensen等，1992，PlantMol.Biol.18，675-689中描述的玉米遍在蛋白啟動子；也可參見Cornejo等，1993，PlantMol.Biol.23，567-581)，gos2啟動子(dePater等，1992，PlantJ.2，837-844)，emu啟動子(Last等，1990，Theor.Appl.Genet.81，581-588)，水稻肌動蛋白啟動子，例如Zhang等(1991，ThePlantCell3，1155-1165)描述的啟動子；和分別驅(qū)動T-DNA中l(wèi)，和2'基因表達的TR1'啟動子以及TR2，啟動子(分別為"TRl'啟動子"和"TR2，啟動子")(Velten等，1984，EMBOJ3，2723-2730)?；蛘?，可以使用非組成型但對植物的一個或多個組織或器官(例如葉和/或根)具有特異性的啟動子，由此使所插入的1^2基因僅在特定的組織或器官的細胞中表達。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，通過將具有殺昆蟲活性的i^基因部分置于才艮優(yōu)先的啟動子(即，在植物的根組織中最活躍的啟動子，優(yōu)選在非根組織，例如花粉、葉和莖中不或幾乎不轉(zhuǎn)錄的啟動子，更優(yōu)選只在根中進行可檢測的轉(zhuǎn)錄的啟動子)的控制之下，使具有殺昆蟲活性的isp基因在植物，優(yōu)選玉米的根中選擇性地表達。根優(yōu)先的啟動子并不需，在根中具有活性。本發(fā)明的根優(yōu)先的啟動子包括但不限于緊M于相應(yīng)于根特異的cDNA的DNA序列上游的啟動子，優(yōu)選來自玉米；美國專利5,837,876，已公開的PCT專利申請WO00/29594，WO00〃3474，WO01/00833,或美國專利6,008,436中的啟動子；美國專利5,633,363和Held等(1997，PlantMol.Biol.35，367-375，Genbank登錄號U38790)中的ZRP2啟動子；美國專利5，817，502中的啟動子；deFramond(1991，F(xiàn)EBS290:103-106;EP0452269)描述的啟動子，來自小麥的過氧化物酶基因POX1的根特異性啟動子(Hertig等，1991,PlantMolec.Biol.16,171-174)，美國專利5,837,848中的啟動子，PCT出版物WO015662中的啟動子，Goddemeier等(1998，PlantMol.Biol.36，799-802)所述的啟動子?？蓜幼親irel等，1992,PlantMol.Biol.20，207;Keller和Baumgartner，1991，ThePlantCell3，1051-1061;Sanger等，1990，PlantMol.Biol.14,433-443;Miao等，1991，ThePlantCell3，11-22;Bogusz等，1990，ThePlantCell,2，633-641;Leach和Aoyagi，1991，PlantScience79，69-76;Teeri等，1989，EMBOJournal8，343-350，所有這些引入本文作為參考。如美國專利5,254,799中所述可以通過利用植物本身或其它植物例如豌豆的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基基因的啟動子來實現(xiàn)在植物葉中的表達。另一可供選擇的方案是使用可誘導(dǎo)(例如，通過溫度或化學(xué)因子)表達的啟動子。而且，對于玉米，特別當玉米根蟲成蟲出現(xiàn)在帶玉米根蟲的地里時，利用可在玉米花粉中表達的啟動子區(qū)，如在已公開的PCT申請WO93/25695和WO01/12799中描述的啟動子在花粉中進行表達是優(yōu)選的。將具有殺昆蟲活性的isp基因插入到植物基因組中，使所述的插入基因位于合適的3'端轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)信號(即，轉(zhuǎn)錄本形成和多腺苷酸化信號)的上游(即，5，)。這優(yōu)選通過將i^嵌合基因插入到植物細胞基因組中而完成。在本發(fā)明嵌合基因中3'調(diào)節(jié)序列的選擇并不是關(guān)鍵性的。有些情況下，嵌合基因中不存在這樣的區(qū)域也可以獲得很好的表達，這是因為插入位點處的DNA序列可以充當3'調(diào)節(jié)序列。優(yōu)選的多腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄本形成信號包括CaMV35S(Mogen等，1990，ThePlantCell2，1261-1272)，章魚肉堿合酶基因(Gielen等，1984，EMBOJ3，835-845),胭脂堿合酶基因(Depicker等，1982,J.Mol.Appl.Genet.1，p.561),和T-DNA基因7(Velten和Schdl，1985，NucleicAcidsResearch13，6981-6998)的這些信號，其可在轉(zhuǎn)化的植物細胞中充當3，-非翻譯DNA序列。任選地，具有殺昆蟲活性的i^基因可作為與標記基因，如編碼卡那霉素抗性的nco.基因(EP0242236)共用同一個啟動子的雜合基因(US專利5,254,799;Vaeck等，1987，Nature327，33-37)選擇性地插入到植物基因組中，以使所述植物表達融合蛋白。還可用全部或部分isp基因轉(zhuǎn)化其它細菌，如對鞘翅目或鱗翅目昆蟲具有殺昆蟲活性的蘇云金芽孢桿菌、或定居于根的細菌如定居于根的惡臭30假單孢菌(Pseudomonasputida)(Vilchez等，J.Bacteriol.182，91-99)。由此可產(chǎn)生對殺滅昆蟲有用的并可影響多種鞘翅目和鱗翅目昆蟲害蟲的轉(zhuǎn)化細菌?？梢杂谜系胶线m的克隆載體上的全部或部分isp基因進行細菌轉(zhuǎn)化，所述的細菌:^口土壤桿菌屬(Agrobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)或埃希氏菌屬(Escherichia)細菌，所述的轉(zhuǎn)化可以通過常規(guī)的方式如熱激轉(zhuǎn)化(Bergmans等，1981，J.Bacteriol146，564-570)或如Mahillon等(1989，F(xiàn)EMSMicrobiol.Letters60,205-210)和PCT專利出版物WO90/06999中所描迷的電穿孔技術(shù)來進行。含有本發(fā)明kEL基因的轉(zhuǎn)化細菌菌林如芽孢桿菌屬種菌林，優(yōu)選蘇云金芽孢桿菌可以通過常規(guī)的方法發(fā)酵(Dulmage，1981，"制備用于生物控制昆蟲的細菌，，，BiologicalControlinCropProduction,編者Paparizas，D.C.，OsmunPublishers,Totowa,N.J.，USA,pp.129-141;Bernhard和Utz，1993，"制備實驗用和商用的蘇云金芽孢桿菌殺昆蟲劑"，Bacillusthuringiensis,AnEnvironmentalBiopesticide:TheoryandPractice,pp.255-267，編者Entwistle，P.F.，Cory,J.S.，Bailey,M丄和Higgs，S.，JohnWileyandSons,紐約)以提供高產(chǎn)量的細胞。本發(fā)明的殺昆蟲劑，特別是抗鞘翅目(優(yōu)選抗玉米根蟲)組合物可按常規(guī)的方式利用經(jīng)isp基因轉(zhuǎn)化的微生物或優(yōu)選地它們各自的ISP蛋白或其具有殺昆蟲活性的部分作為活性成份，與合適的載體、稀釋劑、乳化劑和/或分歉劑一起配制(例如，參見Bernhard和Utz,1993，同上)。這種殺昆蟲組合物可以配制成可濕性粉末、小球、顆?；蚍蹌?，或者用水性或非水性的溶劑配制的成液體制劑，泡沫，凝膠，懸液或濃縮液等。已知的微生物包括假單孢菌(Pse油mo腿)或其它細菌細胞，這些細胞使蛋白在用于昆蟲之前被包封在穩(wěn)定的環(huán)境中。包含本發(fā)明的ISP1A和ISP2A蛋白作為組合制劑用以同時、分開或連續(xù)使用以保護玉米不受玉米根蟲侵害的的產(chǎn)品也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，具體說來，所述的產(chǎn)品是殺昆蟲組合物或轉(zhuǎn)基因玉米。本發(fā)明的控制昆蟲，特別是鞘翅目昆蟲的方法包括向待保護的場所(區(qū)域)施用(例如，噴灑)殺昆蟲量的ISP蛋白或用本發(fā)明的i^E基因轉(zhuǎn)化的宿主細胞。待保護的場所包括例如昆蟲害蟲棲息地或生長中的植物或?qū)⒎N植植物的區(qū)域。為獲得ISP蛋白，可以按常規(guī)的方式在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)表達ISP蛋白的重組宿主細胞，再通過常規(guī)的方式從培養(yǎng)基中收獲蛋白。然后通過標準的技術(shù)如層析，抽提，電泳等分離純化ISP蛋白。再用如半胱氨酸蛋白酶或絲氨酸蛋白酶消化所得的蛋白以獲得抗蛋白酶形式的毒素。檢測殺昆蟲活性的生物試驗是本領(lǐng)域熟知的。在Marrone等(1985，J.Econ.Entomol.78，2卯-293)中描述了一種玉米根蟲試驗方法，許多其它利用人工食物或轉(zhuǎn)基因植物檢測昆蟲的方法也是已知的，例如美國專利5，9卯，383。在適宜的生物試驗中包括適當?shù)膶φ找詸z測背景死亡率。下面所給出的實施例用以舉例說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明或其保護范圍的限制。這些實施例的許多改變形式和等價形式均是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員基于本發(fā)明的教導(dǎo)和公知常識所能作到或設(shè)想出的。本申請中提及的序列表(其作為本發(fā)明的一部分，附于其后)如下序列表SEQIDNo.1-ISP1A蛋白和DNA的^i^斷列和DNA序列SEQIDNo.2-ISP1A蛋白的^J^,列SEQIDNo.3—ISP2A蛋白和DNA的氨基斷列和DNA序列SEQIDNo.4—ISP2A蛋白的氨基^列SEQIDNo.5-短zrp2啟動子片段的DNA序列(11=4壬意核苦酸)SEQIDNo.6-長zrp2啟動子片段的DNA序列(n=任意核苦酸)SEQIDNo.7—編碼ISP2A-1蛋白的DNA序列SEQIDNo.8畫ISP2A-1蛋白的^J^斷列SEQIDNo.9-編碼ISP1A-1蛋白片段的DNA序列SEQIDNo.10-ISP1A-1蛋白的^J^^^列在實施例中如不另外指出，所有產(chǎn)生和操作重組DNA的步驟均依照如Sambrook等，MolecularCloning-ALaboratoryManual,SecondEd.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY(1989)，和Ausubel等(1994)CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols,USA第1、2巻中所述的標準方法進行。植物分子生物學(xué)操作的標準材料和方法參見PlantMolecularBiologyLabfax(1993),R.R.D.Croy編，BIOSScientificPublicationsLtd(UK)和BlackwellScientificPublications(UK)聯(lián)合出版。PCR技術(shù)的操作見M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.Sninsky和T.J.White等編寫的"PCRprotocols:aguidetomethodsandapplications"(AcademicPress,Inc.,1990)中所述。實施例實施例1:菌林IB120-A的特征此處命名為IB120-A的細菌菌林是在墨西哥Morelos洲的田地里發(fā)現(xiàn)的。將該菌林在LB瓊脂平板(添加1.5%瓊脂的LB培養(yǎng)基；LB培養(yǎng)基:IOg/1胰蛋白胨，10g/1NaCl，5g/I酵母抽提物，pH7.3)上于28。C下培養(yǎng)過夜。為進行小規(guī)模的培養(yǎng)，接種20mlTB培養(yǎng)基(Terrific液體培養(yǎng)基12g/1胰蛋白胨，24g/1酵母抽提物，3.8g/1KH2P04,12.5g/1K2HP04，5ml/1甘油，pH7.1)并在約70轉(zhuǎn)每分鐘的旋轉(zhuǎn)平臺上于28。C下培養(yǎng)65小時。65小時后，向培養(yǎng)物中添加蛋白酶抑制劑混合物。此雞尾酒混合物具有如下成分(所給體積為需要加入一份20ml的培養(yǎng)物中的體積)20(Hi1PMSF(100mM)，200^1苯甲脒.HCl(lOOmM)和s-i^-正-己酸(500mM)的混合物，400nlEGTA(0.5M),40^1抗蛋白酶(0.5mg/ml)/亮抑蛋白酶肽(0.5mg/ml)和20plP-巰基乙醇(14M)。將已加入蛋白酶抑制劑混合物的培養(yǎng)物3000rpm離心20分鐘。某些情況下，將上清液用CentriprepYM-10離心過濾裝置(MilliporeCat,No.4305)濃縮4倍。為長期保存，將一環(huán)產(chǎn)孢子的細胞加到0.5ml25%或50%甘油中，渦懸振蕩后于-70。C下恭萍。產(chǎn)孢子的細胞是通過將所述菌株于LB瓊脂平板上培養(yǎng)直到形成孢子(在光學(xué)顯微鏡下清晰可見)而獲得的。將單細胞菌落在LB瓊脂平板上培養(yǎng)后，對EB120-A菌沐涪養(yǎng)物的顯微鏡分析結(jié)果顯示存在桿狀可移動的單個營養(yǎng)細胞和含有卵形孢子的膨脹孢子嚢。在IB120-A菌抹培養(yǎng)物中沒有檢測到伴孢晶體。在人工食物(Sutter等(1971，J.Econ.Entomol.64，65-67)描述的食物)上進行的表面污染分析中，IB120-A菌林的上清液表現(xiàn)出對玉米根葉甲(Diabroticavirgifera)幼蟲(此后稱作"Dv")的強烈毒性。上述分析是在24孔0^31"板中于24。((+/-1。(:)下進行的，50微升毒素溶液每孔(2cm2)，對每個樣品用6個孔(每孔4個Ll(一齡)幼蟲)進行分析(7天后作評價)。篩選在起始培養(yǎng)后7，24，30，48和120小時收獲的上清液，顯示在48小時對Dv有最強的毒性，在第7小時的時候沒有發(fā)現(xiàn)明顯的毒性。在第48小時，將上清液(總蛋白濃度214ng/ml)以1/1024稀釋后仍可觀察到50-60%的死亡率。在開始培養(yǎng)后48,65和144小時收獲的IB120-A上清液(稀釋比例為1/1到1/8)經(jīng)熱處理后喪失活性，但經(jīng)疏酸銨沉淀后活性仍保留，M明所述的毒性化合物可能是一種蛋白質(zhì)。利用旋轉(zhuǎn)酶B基因(Yamada等，1999，Appl.Environm.Microbiol.65，1483-1490)的PCR引物對IB120-A菌林的初步表征提示其不是蘇云金、炭疽(Bacillusanthracis)或蠟狀芽孢桿菌亞種。用特異表征Paenibacillus屬16SRNA序列的引物所進行的PCR也沒有得到擴增產(chǎn)物，上述引物也識別緩病芽孢桿菌(Bacilluslentimorbus)和日本甲蟲芽孢桿菌(Bacillus。opilliae)(Pettersson等，1999，IntJSystBacteriol.49(2),531-540)。在NB(營養(yǎng)肉湯3g/l細菌培養(yǎng)用牛肉膏，5g/1細菌培養(yǎng)用蛋白胨，pH6.8)培養(yǎng)基中的生長表明該新菌林不是幼蟲芽孢桿菌(Bacilluslarvae)種。因此這一IB120-A菌抹看來不同于目前已分離的已知產(chǎn)生不包含于晶體中的分泌型殺昆蟲蛋白的芽M菌(Bacillus)菌林?；跅U狀形狀和需氧生長，該菌林可能是芽孢桿菌屬(Bacillus)種的菌林。在用一組針對蘇云金芽孢桿菌cry3基因的一般和特異引物分析菌株IB-120A時沒有發(fā)現(xiàn)擴增產(chǎn)物。用標準的微生物鑒定技術(shù)對IB120-A菌林進行詳細地分析，包括脂肪酸分析和結(jié)合API20E試驗的API50CHB試驗，表明這一菌林是側(cè)孢短小芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)種的菌林實施例2.ispl和isp2DNA/蛋白的分離和表征為分離IB120-A中與毒性相關(guān)的基因，提取該菌林的總DNA并用Sau3A進行部分酶切。經(jīng)消化的DNA用蔗糖梯度按大小分級分離，將在7kb到10kb范圍的片段連接到用BamHI-消化及TsAP(熱敏感的堿性磷酸酶)處理的克隆載體pUC19(Yannisch-Perron等，1985，Gene33，103-119.)上。將連接混合物通過電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-Blue細胞中。將轉(zhuǎn)化體涂布在含Xgal和IPTG的LB-triacillin平板上，選擇白色克隆用于濾膜雜交實驗。用如下制備的DIG標記探針篩選含有所述載體的重組大腸桿菌克隆。首先，以IB120-A菌林細胞為模板進行PCR。所得的擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化后用作二次PCR反應(yīng)的模板，所述的二次PCR使用DIG標記的dNTP和與第一次PCR反應(yīng)相同的引物。將適當量的擴增產(chǎn)物用于雜^A應(yīng)。鑒定了含帶有全長1^_基因的質(zhì)粒的陽性菌落后，利用染料末端標記方法和PerkinElmerAB1Prism-377DNA測序儀確定這些基因的序列。在陽性菌落中的克隆DNA片段上的兩個開放閱讀框的序列如SEQIDNo.1和3所示。發(fā)現(xiàn)這些DNA序列祐:組織在一個操縱子中并編碼新蛋白ISP1A(SEQIDNo.2)和ISP2A(SEQIDNo.4),正是由于這兩個蛋白的原因使我們觀察到高殺昆蟲活性。含帶有毒性有關(guān)基因的pUC-衍生質(zhì)粒(質(zhì)粒pUCIB120/ISP)的陽性菌落已按布達佩斯條約的規(guī)定于2000年l月11日提交了保藏，作為保藏號為LMBP4009的大腸桿菌XLlBlue。從陽性菌^^取質(zhì)粒，用和Ec"RI酶切(得到約7Kb的片段)，再將其連接到經(jīng)同樣限制性酶切的穿梭載體pSL40上。獲得質(zhì)粒pSLIB120/ISP。將該pSLIB120/ISP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入不產(chǎn)生晶體的蘇云金芽孢桿菌菌林中。這一重組Bt菌林的上清液依如下方式獲得。將所述菌林在含紅霉素(20jug/ml)的LB瓊脂平板上于28。C下培養(yǎng)過夜。為進行小規(guī)模的培養(yǎng)，接種20ml含紅霉素(20照/ml)的TB培養(yǎng)基并在約70轉(zhuǎn)每分鐘的旋轉(zhuǎn)平臺上于28。C下生長65小時。65小時后，向培養(yǎng)物中添加蛋白酶抑制劑混合物。此雞尾酒混合物具有如下成分(所給體積為需要加入一份20ml培養(yǎng)物中的體積)200^1PMSF(100mM)，200jlU苯甲脒.HCI(100mM)和s-氨基-正-己酸(500mM)的混合物，40(VilEGTA(0.5M),40jil抗蛋白酶(0.5mg/ml)/亮抑蛋白酶肽(0.5mg/ml)和(3-巰基乙醇(14M)。將已加入蛋白酶抑制劑混合物的培養(yǎng)物3000rpm離心20分鐘。某些情況下，將上清液用Centripr印YM-10離心過濾裝置(MilliporeCat.No.4305)濃縮約4倍。在上述的Dv表面污染分析中，含pSLIB120/ISP質(zhì)粒的重組Bt菌林的培養(yǎng)物上清液在起始培養(yǎng)后第48小時經(jīng)1/1024稀釋后仍表現(xiàn)出明顯死亡率，在60%范圍內(nèi)，而對照(對照包含未經(jīng)轉(zhuǎn)化的Bt菌林的上清液)的死亡率為0%。it^明此分離的DNA編碼IB120-A菌林中的殺昆蟲組分，當其轉(zhuǎn)移到其它細菌中后，該殺昆蟲組分也可以表達并分泌到培養(yǎng)基中。使用以pSLIB120/ISP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的另一個獨立的不產(chǎn)生晶體的Bt菌抹進行的毒性分析也確證了，與未經(jīng)轉(zhuǎn)化的對照相比轉(zhuǎn)化菌林的上清液表現(xiàn)出高殺昆蟲活性。通過上述用Dv幼蟲進行的表面污染分析，發(fā)現(xiàn)表達兩種ISP蛋白的Bt菌林的上清液的LC50值在4天后為3.5ng/cm2(基于上清液中的總蛋白濃度)。關(guān)于表達ISP1A和ISP2A蛋白的重組Bt菌林的上清液對所選擇的鞘翅目昆蟲的毒性的詳細分析結(jié)果列于下表l中。本發(fā)明的ISP蛋白對西、北和南部玉米根蟲幼蟲以及馬鈴薯甲蟲和棉鈴象甲幼蟲均具有顯著的殺昆蟲活性。成熟的ISP1和ISP2蛋白經(jīng)硫酸銨沉淀再經(jīng)過不同的色i瞽柱純化到近似均質(zhì)。色鐠分析表明ISP1A和ISP2A蛋白以等克分子比例存在于上清液中。發(fā)現(xiàn)ISP1A蛋白相當疏水而ISP2A相當親水。對不產(chǎn)生晶體的重組Bt菌抹中產(chǎn)生的成熟ISP1A和ISP2A蛋白進行的M末端序列測定結(jié)果表明對于ISP1ASEQIDNo.2的第38位氨基酸和對于ISP2ASEQIDNo.4的第51位M^^存在于轉(zhuǎn)化的Bt菌林上清液中的活性蛋白的N-末端氨基酸。ISP1A的N末端為IATTTQASKD,ISP2A的N末端為LVKTTNNTED，其與所分離的DNA序列的^J^酸序列完全匹配。用37，50，75，100和150kD分子量標記，通過8%SDS-PAGE凝膠電泳確定，純的成熟ISP1A蛋白的表觀分子量為約100kD，通過10%SDS-PAGE皿電泳確定，純的成熟ISP2A蛋白的^J見分子量為約45kD。由重組菌林產(chǎn)生的成熟ISP1A和ISP2A蛋白的活性針對幾種昆蟲進行了評估，對于所選擇的鞘翅目昆蟲的結(jié)果列于下表l。表1:ISP1A-ISP2A對鞘翅目昆蟲的活性<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>對表1的注釋Dv:玉米才艮葉甲(Diabroticavirgifera)，西部玉米才艮蟲；Db:Diabroticabarberi，北部玉米根蟲；Du:黃瓜十一星葉甲食根亞種(Diabroticaundecimpunctatahowardi)，西部玉米+艮蟲；Ld:馬鈴薯葉甲(Leptinotarsadecemlineata)，馬鈴著甲蟲；Ag:墨西哥棉鈴象(Anthoiiomusgrandis)，棉鈴象甲；Ll:第一幼蟲階段；L2:第二幼蟲階段；L3:第三幼蟲階段;Ll+2d:孵4匕2天后；*:^%CL(CI^置信界限，LC50:殺死50%昆蟲的上清液中的總蛋白濃度)。所用的生物測定Dv，Db，Du:以25pi/cm2的比例利用人工食物進行表面污染分析(參見上述)，7天后作評價；Ld:用馬鈴薯葉進行浸泡試驗(切下馬鈴薯的葉，浸于毒性溶液中，晾干后置于盛有IO條幼蟲的平皿(直徑9cm)中；1天后，向平皿中加入未經(jīng)處理的葉，5天后作評價)；Ag:人工食物捧入試驗如Moore和Whisnant,HandbookofInsectRearing,Vol.I，PritahSingh和R.F.Moore;Elsevier,Amsterdam,1985，p.217中描述的食物;測定每25ml食物中摻入2ml毒素溶液，在24多孔Costar平板中(約1ml/孑L)進行，每孔1個卵，每個樣品20個孔，14U作評價)。在表1報道的測定結(jié)果中，對照(未處理的食物，在此食物中添加了未經(jīng)轉(zhuǎn)化的無晶體Bt菌林的上清液或水)導(dǎo)致上述所有昆蟲的死亡率不高于20%(根據(jù)幼蟲階段和昆蟲種類的不同，對照死亡率在5到20%之間變化(20。/。值對應(yīng)于Dv的第三幼蟲階段))。當從重組的Bt菌林上清液中純化出ISP1A和ISP2A蛋白后，在聯(lián)合施用等摩爾的上述蛋白時，通過上述的生物試驗獲得的針對玉米根葉甲(Diabroticavirgifera)幼蟲的LC50值與上述所得值沒有顯著的區(qū)別。在標準表面污染試驗中生物測定成熟的1SP1A和ISP2A蛋白的混合物對選擇的鱗翅目昆蟲(歐洲玉米螟(Ostrinianubilialis),煙芽^M(Heliothisvirescens)，美洲棉鈴蟲(Helkoverpaze3)，草地粘蟲(Spodopterafrugiperda),Sesamianonagrioides,海灰翅^M(Spodopteralittoralis)，棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)，和煙草天蛾(Manducasexta))的作用，結(jié)果表明與對照相比本發(fā)明的ISP蛋白在這些昆蟲中并沒有引起較高死亡率。這證實了本發(fā)明蛋白的鞘翅目昆蟲特異性性質(zhì)。用兩蚜蟲種所進行的初步生物試驗也表明ISP1A和ISP2A蛋白的混合物并不在這些昆蟲中引起明顯的死亡率。為確定是i^E基因的哪個片WL以編碼對葉甲(Diabrotica)幼蟲具有毒性的ISP蛋白復(fù)合物，通過向i§2基因的ORF中的不同位置插入終止密碼子(由此形成不同的3，基因截短)以獲得一系列的C-末端截短ISP蛋白。所述的終止密碼子通過GenomePrimingSystem(GPS，NewEnglandBiolabs，catalog#7100)插入在隨機的位置。利用這一系統(tǒng)，1.7kb轉(zhuǎn)座子(在全部三個開放閱讀框和2個與特異引物支助的序列中均包含終止密碼子)被隨機地插入到"耙，，DNA中，但只插入一次。這樣可以通過基因特異性的引物和轉(zhuǎn)座子特異性的引物由PCR篩選估計，或通過測序精確地確定插入的位置和由此造成的截短。然后用一組在一個j^基因的不同位置帶有轉(zhuǎn)座子的構(gòu)建體分別單獨轉(zhuǎn)化無晶體的股菌林，并通過上述的試驗測定西部玉米根蟲幼蟲對這些重組Bt菌林上清液的敏感性。為使亟基因截短，用必WBI和切下質(zhì)粒pSLIB120/ISP上含所述基因的片段。在GPS反應(yīng)之后，將這一片段連接到經(jīng)同樣酶切的pSLlB120/ISP栽體上。通過PCR篩選重組的^M桿菌菌落以估計轉(zhuǎn)座子的插入位點。選出一組在M基因的第二半部分(3，半部分)中的不同位置帶有轉(zhuǎn)座子的10個克隆。將這些克隆中的質(zhì)粒轉(zhuǎn)4^到dcm和dam曱基化酶陰性的大腸桿菌菌林GM2163中。再將從這一菌林中分離出的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到無晶體的Bt菌林中。制備上清液進行生物分析，以用pSLIB120/ISP轉(zhuǎn)化的Bt菌林的上清液作為陽性對照，用無晶體的Bt菌林的上清液作為陰性對照。為截短i^i基因用P附A和￡V:oRI從pSLIB120/ISP上切下一個片段。所用的方法與截短M基因所用的方法類似。轉(zhuǎn)座子插入分析的結(jié)果表明在isp2A基因3，末端相對大片段的截短會使毒性遭到破壞，這表明在ISP2A蛋白中不允許C-末端截短或只允許相對短的C-末端截短。測序后，發(fā)現(xiàn)在本研究中在與ISP1A蛋白組合測定時仍保留毒性的最短C-末端截短ISP2A毒素片段截止到SEQIDNo.4中第449這些分析的結(jié)果表明，在ISP1A蛋白3，末端進行大片段的截短是可能的序列測定顯示帶有最大的C-末端截短的毒性片段截止到SEQIDNo.2中的第768位氨基酸。這樣，在不喪失毒性的前提下ISP1A編碼區(qū)可在3，端缺失約300bp。上述研究#明在沒有功能性的ISP1A蛋白產(chǎn)生時，殺昆蟲活性下降到背景水平，這確證了本發(fā)明的ISP蛋白的二元本質(zhì)。因此，SEQIDNo.4中第51位到449位^J^酸的ISP2A蛋白和SEQIDNo.2中第38位到第768位M酸的ISP1A蛋白是ISP蛋白的有用殺昆蟲片段。而且，我們使含融合了ISP1A和ISP2A基因的DNA的嵌合基因在無晶體的蘇云金芽孢桿菌berliner1715菌林中表達。在編碼ISP2A和ISP1A蛋白(ISP2A仍保留其N端信號肽，而ISPIA的信號肽缺失)的開放閱讀框之間有編碼Arg-Lys接頭(RKRKRK)的DNA序列或編碼Gly接頭(GGGGGG)的DNA序列，因此可以產(chǎn)生可翻譯的融合蛋白，即其中有指定的接頭將ISP2A蛋白(作為N-末端融^分)連接到ISP1A蛋白(作為C-末端融合部分)上的融合蛋白。已證明重組Bt菌林可使玉米根葉曱(Diabroticavirgifera)的死亡率明顯高于未轉(zhuǎn)〗t的對照菌林(即無晶體的Bt1715菌林)引起的死亡率。it^明可用單嵌合基因使本發(fā)明的ISP蛋白作為融合蛋白在重組的宿主細胞中產(chǎn)生。顯然，如本說明書中所描述的，可以用多種不同的方法在重組細胞，如才直物細胞中產(chǎn)生融合蛋白。實施例3:在植物中生產(chǎn)ISP蛋白為在植物中獲得理想的表達，可修飾天然的isplA和isp2A基因以產(chǎn)生編碼ISP1A和ISP2A蛋白的1務(wù)飾DNA序列。編碼其信號狀:陂曱石克氨酸和丙氨酸替換的ISP1A-1和ISP2A-1蛋白的理想DNA序列分別如SEQIDNo.9和7所示。通過標準的技術(shù)插入到嵌合基因中的編碼區(qū)與適宜的調(diào)節(jié)序列(如基于SEQIDNo.5或6的長或短zrp2啟動子序列的啟動子、適當?shù)?，轉(zhuǎn)錄終止和苦酸化序列)可操作地連接。在一些構(gòu)建體中，上述的嵌合基因包含編碼導(dǎo)致靶向質(zhì)體的如美國專利5,510,471(或再頒布的美國專利RE036449)中所描述的優(yōu)化的葉綠體轉(zhuǎn)運肽(代替N-末端的細菌信號肽)、或者導(dǎo)致耙向細胞壁的信號肽的DNA序列。類似地，也可以使用其它在植物細胞中有效的信號肽，優(yōu)選由7jc稻a-淀粉酶3基因編碼的信號肽(Sutliff等，1991，PlantMolec.Biol.16,579-591)、由菠菜纟失氧還原蛋白NADP+氧化還原酶基因編碼的信號肽(OelmueHer等，1993，Mol.Gen.Genet.237,261-272)、或由馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因II編碼的信號肽(Keil等，1986，Nucl.AcidsRes.14，5641-5650)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Ishida等，1996，NatureBiotechnology14，745-750;和U.S.專利No.5,591,616)、如美國專利5,792,936所述的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、或如WO92/09696或美國專利5,641,664中所述的用損傷的并經(jīng)酶降解的成胚愈傷組織進行的電穿孔，使上述的isplA和isp2A嵌合基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化玉米細胞(所有這些文獻在此處引入作為參考)。由轉(zhuǎn)化的細胞再生玉米植抹，再根椐在根中的最佳表達水平和綜合農(nóng)藝性狀進行選擇。由此獲得產(chǎn)生上述ISP蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米植林，其對試圖以此種植物為食的玉米根葉甲(Diabroticavirgifera)可引起顯著的死亡率。依照本發(fā)明，也可以獲得含有幾種DNA構(gòu)建體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的玉米植林，或兩種本發(fā)明的ISP蛋白以及合適的標記基因，優(yōu)選除草劑抗性基因。在這些DNA構(gòu)建體中，優(yōu)選的3'轉(zhuǎn)錄終止和多fJ^苷酸化序列是含有由花椰菜花葉病毒中獲得的3'轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化序列的215bp片段(Oka等，1981，J.Mol.Biol.147，217-226)。在一些構(gòu)建體中可以加入5，非翻譯前導(dǎo)序列，優(yōu)選那些來自碧冬茄屬(Petunia)cab22基因(Harpster等，1988，Mol.GenGenetics212，182-190)或zrp2基因(Held等，1997，PlantMolecularBiology35,367-375，Genbank登錄號U38790)的前導(dǎo)序列。在這些構(gòu)建體中優(yōu)選的啟動子是35S啟動子(例如，Odell等，1985,Nature313，810-812)或zrp2啟動子(Held等，1997,PlantMolecularBiology35,367-375，Genbank登錄號U387卯)的有效啟動子部分。除了上述優(yōu)化的葉綠體轉(zhuǎn)運狀之外，所述的構(gòu)建體還可以包含在植物細胞中有效的信號肽，即水稻a-淀粉酶3基因信號肽(Sutliff等，1991，PlantMolec.Biol.16，579-591)、來自菠菜的4失氧還原蛋白NADP+氧化還原酶信號肽(Oelmudler等，1993，Mol.Gen.Genet.237，261-272)、或來自馬鈴薯的蛋白酶抑制劑II的信號肽(Keil等，1986，Nucl.AddsRes.14，5641-5650)。選擇以上的優(yōu)選元件用ISP嵌合基因以本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所掌握的技術(shù)轉(zhuǎn)化植物即可用于實現(xiàn)本發(fā)明的目的。優(yōu)選地，所述植物還包括編碼賦予草胺膦(glufosinate)或草甘膦抗性的蛋白的基因，其可應(yīng)用不同的啟動子和/或前導(dǎo)序列，例如gos2啟動子和/或gos2前導(dǎo)序列(dePater等，1992，PlantJ.2，837-844)。顯然，本發(fā)明并不僅僅局限于上述使用的玉米植物、轉(zhuǎn)化方法及特定的ISP蛋白或DNA序列。相反，本發(fā)明還包括保留殺昆蟲活性的ISP蛋白的變異體或等價物，如基本上具有本發(fā)明的ISP蛋白的M酸序列并基本上具有ISP蛋白的殺昆蟲活性的蛋白。另外，任何易受下述昆蟲損害的植物均包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)作為編碼ISP蛋白的DNA所轉(zhuǎn)化的優(yōu)選乾植物，所述的昆蟲為鞘翅目的昆蟲，尤其是玉米根蟲，象甲或馬鈴薯甲蟲，特別是玉米才艮葉甲(Diabroticavirgifera)或馬鈴薯葉曱(Leptinotarsadecemlineata)，優(yōu)選的昆蟲選自楊樹瑩葉曱(Agelasticaalni)，紫苜蓿葉象(Hyperapostica)，埃及苜蓿葉象(Hyperabruimeipennis)，Halticatombacina，墨西哥沖帛鈴象(Anthonomusgrandis),黃粉蟲(Tencbriomolitor),赤4以谷盜(Triboleumcastaneum)，水稻鐵甲(Dkladispaarmigera)，Trichispaseries,7K稻負泥蟲(Oulcmaoryz狄)，葡萄肖葉甲(Colaspisbru畫a),稻水象曱(Lissorhorptrusoryzophaus),蘿卜菜浪匕甲Phvllotretacmciferae,黃曲條菜i^甲(Phyllotretastriolata)，忽布貞匕曱(Psylliodespunctulata),美洲油菜葉甲(Entomoscelisamericana)，油菜露尾蟲(Meligethesaeneus),龜象屬種(Ceutorynchus)，油菜金頭淑^甲(Psylliodeschrysoc印hala)2豌豆細玟浪l甲(Phyllotretaundulata)，馬鈴薯葉甲(Leptinotarsadecemlineata)，黃瓜十一星葉曱亞種(Diabroticaundecimminctataundecimpunctata),黃瓜十~-'星葉甲食根亞種(Diabroticaundecimpunctatahowardi)，Diabroticabarberi和玉米才艮葉甲(Diabroticavirgifera)。序列表<rio〉拜爾生物科學(xué)股份有限公司<120>細菌殺昆蟲蛋白<130〉C認SPWOl<150〉US09/573,872<151〉2000-05-18<160>10<170>Patentln版本3.0<210>1〈211〉2616<212>DNA〈213>側(cè)孢短小芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)<220><221>CDS〈222>(1)..(2613)<400>1atgaaatatatgaaaMetLysTyrMetLys15ttcgettctatgtttPheAlaSerMetPhe20agtaaaacaaatcagSerLysThrAsnGin35caaatagatcgagaaGinI]eAspArgGlu50tttaatgatcttaccPheAsnAspLeuThr65aaaggattatctagtgttgtaataggtacgttg48LysGlyLeuSerSerValVallieGlyThrLeu1015ttgaatgggaatgtaaatgetgtttacgcgaac96LeuAsnGlyAsnValAsnAlaValTyrAlaAsn2530attgetacaacaactcaggcaageaaagacaac144lieAlaThrThrThrGinAlaSerLysAspAsn4045ggaetacttggttattactttaaaggaaaagat192GlyLeuLeuGlyTyrTyrPheLysGlyLysAsp5560ttgtttgcaccgacacgtgataatactcttatt240LeuPheAlaProThrArgAspAsnThrLeulie707580tatgaccaacaaacagcaaatacaetagtagatcaaaagcatcaagaet288丁yrAspGinGinThrAlaAsnThrLeuValAspGinLysHisGinGlu859095tatcattctattcgctggattggattgattcagagtagtgcaacagga336TyrHisSerlieArgTrplieGlyLeulieGinSerSerAlaThrGly100105110gatttcacatttaaattgteagatgatgaaaatgccateattgaattg384AspPheThrPheLysLeuSerAspAspGluAsnAlalielieGluLeu115120125gatgggaaagttatttctgaaaaaggtaacaataaacaaagtgttcat432AspGlyLysVallieSerGluLysGlyAsnAsnLysGinSerValHis130135140gaaaaaggacagttggtgcaaataaaaattgagtaccaateagac480LeuGluLysGlyGinLeuValGinT]eLyslieGluTyrGinSerAspM5150155160gatgcattacatatagataataeiaatttttaaagagcttaagetattc528AspAlaLeuHislieAspAsnLysliePheLysGluLeuLysLeuPhe165170175aagatagatagtcasaatcactctcaacaagttcaacaagatgaactg576LyslieAspSerGinAsnHisSerGinGinValGinGinAspGluLeu180185190agaaaccctgagtttaataagaaagaaacgcaagtattcttaaagaaa624ArgAsnProGluPheAsnLysLysGluThrGinValPheLeuLysLys195200205gcatcgaaaacaaatctttttacacaaaaaacaaaaagagacattgat672AlaSerLysThrAsnLeuPheThrGinLysThrLysArgAsplieAsp210215220gaagatacggatacagatggagattctatecctgatgtttgggaagaa720GluAspThrAspThrAspGlyAspSerlieProAspValTrpGluGlu225230235240aacgggtataccattcaaaacaaagtcgcagtcaaatgggatgattcg768AsnGlyTyrThrlieGinAsnLysValAlaValLysTrpAspAspSer245250255ttagcaagtaaagggtatcaaaaatttacttctaatccaetagaagca81644LeuAlaSerLysGlyTyrGinLysPheThrSerAsnProLeuGluAla260265270cacacagttggagatccctatagtgattatgaaaaagetgcaagagat864HisThrValGlyAspProTyrSerAspTyrGluLysAlaAlaArgAsp275280285atgcccttatcgaatgcaaaagaaacttttaatcctctggttgccgcc912MetProLeuSerAsnAlaLysGluThrPheAsnProLeuValAlaAla290295300tttccateagtaaatgttagtttagaaaaggtgattttatecaaaaat960PheProSerValAsnValSerLeuGluLysVallieLeuSerLysAsn305310315320gaagaccttteccatagegttgaaageagtcaatctaccaattggtct1008Gl.uAspLeuSerHisSerValGluSerSerGinSerThrAsnTrpSer325330335tataccaatactgaaggcgttaacgtcaatgccggatggteaggctta1056TyrThrAsnThrGluGlyValAsnValAsnAlaGlyTrpSerGlyLeu340345350ggacctagttttggagtttctgttaactatcaacatagtgaaactgta1104GlyProSerPheGlyValSerValAsnTyrGinHisSerGluThrVal355360365gcaaatgaatggggttctgcgacgaatgatggcacacatataaatgga1152AlaAsnGluTrpGlySerAlaThrAsnAspGlyThrHislieAsnGly370375380gcggaatctgettatttaaacgcaaatgttcgctataataacgttggg1200AlaGluSerAlaTyrLeuAsnAlaAsnValArgTyrAsnAsnValGly385390395400acaggagcaatttatgaaacgaaaccaacaacgagttttattcttgat1248ThrGlyAlalieTyrGluThrLysProThrThrSerPhelieLeuAsp405410415ggaacaacaattggaacgattaaagcaaaagaaaatacaacagett"ta1296GlyThrThrlieGlyThrlieLysAlaLysGluAsnThrThrAlaLeu420425430actattttaccggaccaaagetatccagag犯agggaaaaacggaate1344ThrlieLeuProAspGinSerTyrProGluLysGlyLysAsnGlylie435440445gcaattaacacaatggatgattttaactctcgcccaattccattaaat1392AlalieAsnThrMetAspAspPheAsnSerArgProlieProLeuAsn450455460aaagagcaaetaaatacttatttatctaataaaaaaccaateetactt1440I,ysGluGinLeuAsnThrTyrLeuSerAsnLys)LysProlieLeuLeu465470475480gaaacagatcaagtagaaggaaaatacgccataaaggataccaatggg1488GluThrAspGinValGluGlyLysTyrAlalieLysAspThrAsnGly485490495aatattacaatagetggagattggaatggtataacagatgaaatttct1536AsnlieThrlieAlaGlyAspTrpAsnGlylieThrAspGlulieSer500505510getaaaacggcctctattattgtagataatggaaatcaaatgteagaa1584AlaLysThrAlaSerlielieValAspAsnGlyAsnGinMetSerGlu515520525aagagagttgcagcgaaggattatacaaatccagaggataaaactcct1632LysArgValAlaAlaLysAspTyrThrAsnProGluAspLysThrPro530535540aatttatctgtaaaagaagetetaaagttagettatccagatgaaatt1680AsnLeuSerValLysGluAlaLeuLysLeuAlaTyrProAspGlulie545550555560gagg犯aaagatggtttattattttataatgacc犯cctatttttgaa1728GluGluLysAspGlyLeuLeuPheTyrAsnAspGinProliePheGlu565570575gcatctgtacaaagttatgttgacgaatatacagetaaacaaattaga1776AlaSerValGinSerTyrValAspGluTyrThrAlaLysGinlieArg580585590aaacagttaaatgatagtactggtagettcaaagatgttaagaattta1824LysGinLeuAsnAspSerThrGlySerPheLysAspValLysAsnLeu595600605tatgatgtgaaattagaacccaaaatgaatttcacaataaaaactage1872TyrAspValLysLeuGluProLysMetAsnPheThrlieLysThrSer610615620actttatatgatggaggagaatctgac朋cacaaaaataggaaattgg1920ThrLeuTyrAspGlyGlyGluSerAspAsnThrLyslieGlyAsnTrp625630635640tactatacttatgttgtcaacggaggaaatacgggtaaaaaacaatac1968TyrTyrThrTyrValValAsnGlyGlyAsnThrGlyLysLysGinTy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eThrGinThr755760765ProGlyThrPheSerPheThrTyrLysVallieGlyGluGinThrLys770775780ThrVa]LeuAspSerGlySerGlyLysAsnAlaAsnArglieAsnLeu785790795800AspPheLysAsnValLysSerAspArgSerPheLeuTyrThrLeuSer805810815CysLysAspAspLeuTrpGlySerThrArgThrAlaValValArglie820825830PheAlaValAsp83579權(quán)利要求1.由SEQIDNo.4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)、或通過在所述序列中添加、缺失或置換一個或幾個氨基酸而自其衍生的蛋白質(zhì)、或由在嚴謹雜交條件下與SEQIDNo.3或7的DNA序列雜交的DNA編碼的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)或所述衍生的蛋白質(zhì)當與SEQIDNo.2中氨基酸位置38至氨基酸位置871所示的蛋白組合被玉米根葉甲幼蟲攝入后能夠?qū)⑺隼ハx殺死。2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其由SEQIDNo.4中從第51位到449或457位的氨基酸序列組成。3.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其由SEQIDNo.4或SEQIDNo.8的氨基酸序列組成。4.編碼權(quán)利要求1至3中任意一項的蛋白質(zhì)的DNA序列，或在嚴謹雜交條件下與所述DNA序列中任一項雜交的DNA，其中所述雜交的DMA編碼當與SEQIDNo.2中氨基酸位置38至氨基酸位置871所示的蛋白組合被玉米根葉甲幼蟲攝入后對所述幼蟲具有殺昆蟲作用的蛋白質(zhì)。5.如權(quán)利要求4所述的DNA，其包含人工的DNA序列，該人工DNA6.嵌合基因，其包含權(quán)利要求4或5所述的DNA和可在植物中表達的啟動子區(qū)域。7.如權(quán)利要求6所述的嵌合基因，其中所述的啟動子區(qū)域優(yōu)先在根組織中具有活性。8.如權(quán)利要求7所述的嵌合基因，其中所述的啟動子包括SEQIDNo.5或6的DNA序列或能在嚴謹條件下與其雜交的DNA。9.如權(quán)利要求6所述的嵌合基因，其中所述的嵌合基因還包含用于向細胞外分泌或靶向細胞器的信號肽。10.如權(quán)利要求9所述的嵌合基因，其中所述的信號肽是葉綠體轉(zhuǎn)運肽。11.植物細胞，其包含嵌合基因，所述的嵌合基因選自權(quán)利要求6至10中任意一項所述的嵌合基因。12.植物細胞，其經(jīng)轉(zhuǎn)化而含有選自權(quán)利要求6至10中任意一項所述的嵌合基因的嵌合基因和下迷嵌合基因所述嵌合基因包含編碼下述蛋白質(zhì)的DNA，所述蛋白質(zhì)為由SEQIDNo.2的#^酸序列組成的蛋白質(zhì)、或通過在所述序列中添加、缺失或置換一個或幾個氨基酸而自其衍生的蛋白質(zhì)、或由在嚴謹雜交條件下與SEQIDNo.1或9的DNA序列雜交的DNA編碼的蛋白質(zhì)，并且其中所述蛋白質(zhì)當與SEQIDNo.4中氨基酸位置51至氨基酸位置457所示蛋白組合被玉米根葉甲幼蟲攝入后能夠?qū)⑺隼ハx殺死。13.植物細胞，其經(jīng)轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生權(quán)利要求1至3中任意一項所述的蛋白和下述蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)為由SEQIDNo.2的>#^酸序列組成的蛋白質(zhì)、或通過在所述序列中添加、缺失或置換一個或幾個氨基酸而自其衍生的蛋白質(zhì)、或由在嚴謹雜交條件下與SEQIDNo.1或9的DNA序列雜交的DNA編碼的蛋白質(zhì)，并且其中所述蛋白質(zhì)當與SEQIDNo.4中氨基酸位置51至氨基酸位置457所示蛋白組合被玉米根葉曱幼蟲攝入后能夠?qū)⑺隼ハx殺死。14.植物或種子在控制玉米根葉甲中的用途，其中所述植物或種子包含整合到其細胞中的嵌合基因，其中所述的嵌合基因選自權(quán)利要求6至10中任意一項所述的嵌合基因。15.如權(quán)利要求14所述的用途，其中所述植物或種子是玉米植物或種子。16.微生物，其經(jīng)轉(zhuǎn)化而含有權(quán)利要求4或5所述的DNA。17.賦予植物鞘翅目昆蟲抗性的方法，其包括用第一嵌合基因和第二嵌合基因轉(zhuǎn)化植物細胞，和由所述的抗昆蟲性細胞再生轉(zhuǎn)化植物，其中所述的第一嵌合基因選自權(quán)利要求6至10中任意一項所述的嵌合基因；并且所述的第二嵌合基因是包含編碼下述蛋白質(zhì)的DNA的嵌合基因，其中所述蛋白質(zhì)為由SEQIDNo.2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)、或通過在所述序列中添加、缺失或置換一個或幾個氨基酸而自其衍生的蛋白質(zhì)、或由在嚴謹雜交條件下與SEQIDNo.1或9的DNA序列雜交的DNA編碼的蛋白質(zhì)，并且其中所述蛋白質(zhì)當與SEQIDNo.4中氨基酸位置51至M酸位置457所示蛋白組合被玉米根葉甲幼蟲才聶入后能夠?qū)⑺隼ハx殺死。18.控制鞘翅目昆蟲病蟲害的方法，其包括在田地里種植、播種或栽培經(jīng)第一嵌合基因和第二嵌合基因轉(zhuǎn)化的植物，其中所述的第一嵌合基因選自權(quán)利要求6至10中任意一項所述的嵌合基因；并且所述的第二嵌合基因是包含編碼下述蛋白質(zhì)的DNA的嵌合基因，其中所述蛋白質(zhì)為由SEQIDNo.2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)、或通過在所述序列中添加、缺失或置換一個或幾個氨基酸而自其衍生的蛋白質(zhì)、或由在嚴謹雜交條件下與SEQIDNo.1或9的DNA序列雜交的DNA編碼的蛋白質(zhì)，并且其中所述蛋白質(zhì)當與SEQIDNo.4中氨基^列51至^J^酸位置457所示蛋白組合被玉米根葉甲幼蟲攝入后能夠?qū)⑺隼ハx殺死。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的植物是玉米。20.如權(quán)利要求17至19中任意一項所述的方法，其中所述的昆蟲選自根蟲，象甲，馬鈴薯甲蟲，葉曱，花象屬種，馬鈴薯葉甲屬種，楊樹瑩葉曱，紫苜蓿葉象，埃及苜蓿葉象，Haltkatombacina，墨西哥棉鈴象，黃粉蟲，赤擬谷盜，水稻鐵曱，Trichispaserica，水稻負泥蟲，葡萄肖葉曱，稻水象甲，蘿卜茱跳曱，黃曲條茱跳甲，忽布跳甲，美洲油菜葉甲，油菜露尾甲，龜象屬種，油菜金頭跳曱，豌豆細紋跳甲，馬鈴薯葉甲，黃瓜十一星葉甲亞種，黃瓜十一星葉甲食根亞種，Diabroticabarberi和玉米才艮葉曱。21.殺昆蟲組合物，其包含作為組合制劑用以同時、分開或連續(xù)使用以保護玉米植物不受玉米根蟲侵害的權(quán)利要求1至3中任意一項所述的蛋白和另一下述蛋白質(zhì)，其中所述另一蛋白質(zhì)為由SEQIDNo.2的氨基^列組成的蛋白質(zhì)、或通過在所述序列中添加、缺失或置換一個或幾個氨基酸而自其f汴生的蛋白質(zhì)、或由在嚴謹雜交條件下與SEQIDNo.l或9的l)NA序列雜交的DNA編碼的蛋白質(zhì)，并且其中所述蛋白質(zhì)當與SEQIDNo.4中氨基酸位置51至氨基酸位置457所示蛋白組合被玉米根葉甲幼蟲攝入后能夠?qū)⑺隼ハx殺死。全文摘要本發(fā)明分離了細菌殺昆蟲蛋白及其等價物。這些蛋白和編碼所述蛋白的DNA序列可用于制備殺昆蟲組合物或轉(zhuǎn)基因植物，以保護植物不受昆蟲尤其是鞘翅目昆蟲的損害。文檔編號A01H5/00GK101591380SQ20091013827公開日2009年12月2日申請日期2001年5月17日優(yōu)先權(quán)日2000年5月18日發(fā)明者A·伯特斯,G·阿爾諾,J·萬瑞,N·達默申請人:拜爾生物科學(xué)公司