專利名稱：：Muscodor屬植物內(nèi)生真菌ZJLQ070及其用途和殺菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物學及殺菌劑領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種新Muscodor屬植物內(nèi)生真菌和基于或源自它的揮發(fā)性混合物及其它們的用途。
背景技術(shù)：
：真菌是微生物中的一個龐大的家族，真菌與人類的關(guān)系非常密切，真菌可用以制造醫(yī)藥、食品、化工等工農(nóng)業(yè)上重要的產(chǎn)品。著名的青霉素和頭孢霉素是迄今為止真菌帶給醫(yī)藥界的最珍貴的藥物之一，也是目前最重要的抗生素，被廣泛應(yīng)用于細菌感染疾病的治療上，并挽救了千千萬萬人類的生命。植物內(nèi)生真菌(endophyticfungi)是真菌的一個重要類群，據(jù)Dreyfuss和Chapel估計內(nèi)生真菌總數(shù)達100萬種?，F(xiàn)在已有少數(shù)幾種被用于醫(yī)藥、農(nóng)藝生產(chǎn)或工業(yè)應(yīng)用方面，但是植物內(nèi)生真菌資源還遠遠未被充分發(fā)掘。內(nèi)生真菌具有多種多樣的生態(tài)學功能，內(nèi)生真菌的生態(tài)學功能很可能是與其多樣性相關(guān)，而內(nèi)生真菌的多樣性意味著其化學多樣性[3]。內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生各種各樣的次生代謝產(chǎn)物，它們在人類生活、生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用潛力，如內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生紫杉醇等抗腫瘤化合物；oreganicacid等新抗腫瘤活性物質(zhì)；抗白色念珠菌、須癬毛癬菌和紅色發(fā)癬菌等病原真菌的新化合物cryptocin、cryptocandin等；產(chǎn)生具有抗幽門螺桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷氏菌和鼠傷寒沙門氏菌等病原細菌的periconicins、rhizoctonicacid等?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)多種不同的微生物具有產(chǎn)生控制植物病害的生物活性物質(zhì)，包括殺蟲劑、殺菌劑及植物生長調(diào)節(jié)劑等。目前對于控制農(nóng)作物生產(chǎn)過程中的病原微生物、建筑材料霉變微生物及人類或動物生存環(huán)境的病原微生物的研究也有許多，而且也有重要的進展，但主要還是依靠化學合成方法來生產(chǎn)殺菌劑或殺蟲劑。使用化學合成藥劑帶來一系列的嚴重后果l)高殘留由于化學合成藥劑，包括其多種原材料具有致癌性和毒性，進入動植物體內(nèi)不容易排除，環(huán)境降解能力差，造成農(nóng)藥殘留量高；2)破壞生態(tài)平衡生物長期進化與適應(yīng)，自然界中各種生物相對數(shù)量達到動態(tài)平衡，使用化學藥劑造成有害生物的天敵數(shù)量大大減少；3)抗藥性的產(chǎn)生自然界中的病原菌及昆蟲類的基因具有很強的突變能力，不合理用藥、肓目用藥促使抗藥性的迅速產(chǎn)生。由于上述種種的缺點，化學合成藥劑的使用也越來越受限制，開發(fā)新的、作用機理獨特且對人畜和生態(tài)環(huán)境無害的生物制劑越來越被重視，也成為現(xiàn)代農(nóng)藥行業(yè)發(fā)展的重要方向。許多種真菌能產(chǎn)生一些低濃度揮發(fā)性氣體，而且有些揮發(fā)性氣體還具有抗菌、殺蟲或殺病毒的功能，如Dennis&Webster等發(fā)現(xiàn)木霉(Trichoderma)產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體物質(zhì)能抑制立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、終極腐霉(Pythiumultimum)等的生長。Strobel等從熱帶木本植物分離到能產(chǎn)生揮發(fā)性混合物質(zhì)(volatilecompounds,VOCs)的四種Muscodor屬內(nèi)生真菌，它們分別為樟屬植物錫蘭肉桂(Cinnamomumzeylanicum)內(nèi)生真菌Muscodoralbus、蕨葉銀樺(Grevilleapteridifolia)內(nèi)生真菌Muscodorroseus、熱帶木質(zhì)藤本植物(Paulliniapaullinioides)內(nèi)生真菌Muscodorvitigentis、鳳梨屬植物Ananasananassoides內(nèi)生真菌Muscodorcrispans。Muscodoralbus、Muscodorroseus、Muscodorvitigentis禾口Muscodorcrispans產(chǎn)生的VOCs對真菌、細菌及病毒等具有抑殺作用，在防治或殺滅農(nóng)作物生產(chǎn)過程中的病原微生物、建筑材料霉變微生物及人類或動物生存環(huán)境中的病原微生物具有重要的應(yīng)用價值，他們并且也進行了相關(guān)的商業(yè)化開發(fā)。利用真菌產(chǎn)生的VOCs的應(yīng)用研究目前還不多見，Strobel等關(guān)于Muscodor屬相關(guān)內(nèi)生真菌的研究成果及開發(fā)應(yīng)用，證明Muscodor屬真菌產(chǎn)生的VOCs是尋找新型化合物、新型藥物或新型藥物中間體的重要途徑，也是開發(fā)新型生物制劑的重要資源。利用真菌產(chǎn)生的VOCs來控制農(nóng)作物生產(chǎn)過程中的病原微生物、建筑材料霉變微生物及人類或動物生存環(huán)境的病原微生物，具有對非靶標生物無毒害，不污染環(huán)境，不破環(huán)生態(tài)平衡，不會誘導有害微生物、病毒及昆蟲等產(chǎn)生抗藥性的優(yōu)點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種VOCs產(chǎn)生快、能持久抑制多種植物病原真菌、細菌及酵母的新穎Muscodor屬真菌菌株及其產(chǎn)生的揮發(fā)性化物的組合。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種植物內(nèi)生真菌，該植物內(nèi)生真菌Muscodorsp.菌株保藏名稱為ZJLQ070，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2009年1月8日，保藏地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所，保藏號CGMCC2864。本發(fā)明還同時提供了利用上述植物內(nèi)生真菌制成的活體制劑，其是包括Muscodor屬真菌ZJLQ070的培養(yǎng)活菌、透氣吸濕性固體載體、穩(wěn)定劑、微量元素、碳氮營養(yǎng)源及生長素等組成的穩(wěn)定性活體制劑。上述活體制劑可采用以下方法制成將內(nèi)生真菌Muscodorsp.ZJLQ070的活化培養(yǎng)，接入種子培養(yǎng)液，用攪拌機將菌絲體攪碎后，添加種子培養(yǎng)液使菌體恢復(fù)生長，接入固體培養(yǎng)基，真空冷凍干燥后包裝。本發(fā)明還同時提供了上述植物內(nèi)生真菌或其活體制劑的用途，其特征是用于抑制或殺滅病原微生物或霉變微生物。作為本發(fā)明的植物內(nèi)生真菌或活體制劑的用途的改進病原微生物為農(nóng)作物生產(chǎn)過程中的病原微生物、或人類或動物生存環(huán)境中的病原微生物；所述霉變微生物為建筑材料霉變微生物。本發(fā)明還同時提供了一種殺菌劑，該殺菌劑包含0.65%10.2%2-甲基-丙酸甲酯、28%78%2-甲基丙酸、0.6%2.5%l-乙烯基-l-甲基-2.4-二(1-甲基乙烯基)-環(huán)己烷、0.10%0.4%石竹烯、0.06%1%2，6-二甲基-6-(4-甲基-3-戊烯)二環(huán)[3丄l]庚-2-烯、0.8%3.5%1，2，3，4，5，6，7，8-八氫化-l，4-二甲基-7-(1-甲基亞乙基)奧、5.8%11%1，2，3，4，4a，5，6，8a-八氫化-4a，8-二甲基-2-(1-甲基乙基)萘、0.05%0.2%的3，3，7，11-四甲基三環(huán)[6.3.0.0(2，4)]^^一碳-8-烯、0.3%2.8Xa-水^烯、4%45%P-水j^烯、0.1%0.6%反式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-環(huán)己烯-l-醇、0.08%0.4%順式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-環(huán)己烯-l-醇、0.25%4%反式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-環(huán)己烯-1-醇、0.03%0.28%順式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-環(huán)己烯-l-醇；其余為溶劑；以上百分比均為體積百分比。作為本發(fā)明的殺菌劑的改進殺菌劑包含7.8%8.2%2-甲基-丙酸甲酯、76.5%78%2-甲基丙酸、0.63%0.7%1-乙烯基-1-甲基-2.4-二(1-甲基乙烯基)-環(huán)己烷、0.10%0.12%石竹烯、0.06%0.08%2，6-二甲基-6-(4-甲基-3-戊烯)二環(huán)[3丄l]庚-2-烯、0.8%0.9%1，2，3，4，5，6，7，8-八氫化-l，4-二甲基-7-(l-甲基亞乙基)奧、5.8%6.2%1，2，3，4，4a，5，6，8a-八氫化-4a，8-二甲基-2-(l-甲基乙基)萘、0.05%0.07%的3，3，7，11-四甲基三環(huán)[6.3.0.0(2，4)]^^一碳-8-烯、0.3%0.4%a-水j^烯、4%4.5%P-水j^烯、0.1%0.15%反式1-甲基-4-(1-甲基乙基)_2-環(huán)己烯-1-醇、0.08%0.12%順式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-環(huán)己烯-l-醇、0.3%0.35%反式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-環(huán)己烯-l-醇、0.03%0.05%順式3-甲基-6心-甲基乙基)-2-環(huán)己烯丄醇；其余為溶劑(為常規(guī)溶劑，如丙酮、環(huán)乙烷、甲醇等)。內(nèi)生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ070產(chǎn)生的VOCs是有效的殺菌劑，對立枯絲核菌、終極腐霉、尖孢鐮刀菌、細鏈格孢(Altemariaaltemata)、曲霉(Aspergillussp)、灰葡萄？包(Botrytiscinerea)、蠶豆葡萄孢(Botrytisfabae)、圓形剌盤孢(Colletotrichumorbiculare)、瀉根亞隔孢殼(Didymellabryoniae)、褐孢霉(Fulviafulva)、淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)、指狀青霉(Penicillumdigitatum)、柿盤多毛孢(Pestalotiadiospyri)、稻梨孢菌(Pyriculariaoryzae)、齊整小核菌(Sclerotiumrolfsii)、核盤菌(Sclerotiniasclerotioram)、大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和葉桿菌(Phyllobacteriumsp.)等多種病原絲狀真菌、酵母菌及革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都具有抑制或殺滅作用。內(nèi)生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ070具有產(chǎn)生VOCs速度快，持效性長的特點，能降解終極腐霉和稻梨孢菌的細胞壁，并且此VOCs具有獨特的使人愉悅的香味。內(nèi)生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ070能利用大麥粉、細米糠、小米粉和蔗糖等為碳源，能利用蛋白胨、酵母粉、酵母膏、麩皮、豆餅粉和玉米漿干粉等為氮源，能在谷物或麥類、馬鈴薯葡萄糖瓊脂、燕麥葡萄糖瓊脂或麥芽汁葡萄糖瓊脂上生長，并產(chǎn)生具有抑菌活性的VOCs。內(nèi)生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ070不能以葡萄糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉、糊精、乙酸鈉、丙酸鈉、酒石酸銨、檸檬酸鈉、丙酮酸鈉和丙三醇中的任何一種為唯一碳源，不能以尿素、硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨中的任何一種為唯一氮源。內(nèi)生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ070核糖體脫氧核糖核酸內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(InternaltranscribedspacerofribosomalDNA，ITSrDNA)、核糖體脫氧核糖核酸大亞基(28SrDNA)、核糖核酸聚合酶II亞基(RNApolymeraseIIsubunit，RPB2)、P-微管蛋白(beta-tubulin)基因具有獨特的序列。內(nèi)生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ070的活性載體制劑具有商業(yè)開發(fā)用途，ZJLQ070培養(yǎng)物及其產(chǎn)生的VOCs可以用于處理或防止建筑材料和建筑物中有毒霉菌，可以用于水果和食品的保鮮防霉，可以用于防止或殺滅糧食和飼料中的有害霉菌，可以用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中土壤的處理、花卉或果疏病害的防治。本發(fā)明的VOCs能從生長在谷物或麥類、馬鈴薯葡萄糖瓊脂、燕麥葡萄糖瓊脂或麥芽汁葡萄糖瓊脂上的新穎內(nèi)生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ070培養(yǎng)物上分離得到。VOCs可作為薰蒸劑用作農(nóng)作物生產(chǎn)過程中的病原微生物、建筑材料霉變微生物及人類或動物生存環(huán)境中的病原微生物的抑制或殺滅，具有從中開發(fā)出新型、高效、無毒的天然殺菌劑的巨大潛力。本發(fā)明的Muscodorsp.ZJLQ070活體制劑或內(nèi)生真菌MuscodorspZJLQ070培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的VOCs及包含一種或多種水芹烯或2-環(huán)己烯-1-醇衍生物的合成殺菌劑的用途。它們適用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和服務(wù)行業(yè)等。例如它們可以處理或防止建筑材料和建筑物中有毒霉菌；可以用于水果和食品的保鮮防霉；可以用于防止或殺滅糧食和飼料中的有害霉菌；可以用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中土壤的處理、花卉或果疏病害的防治。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。圖1是Muscodorsp.ZJLQ070菌落圖；圖2是Muscodorsp.ZJLQ070菌絲掃描電鏡圖；圖3菌株ZJLQ070核糖體rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(InternalTranscribedSpacer,ITSrDNA)構(gòu)建的進化樹；圖4菌株ZJLQ070核糖體大亞基(28SrDNA)構(gòu)建的進化樹；圖5菌株ZJLQ070RNA聚合酶II(RNApolymeraseIIsubunit，RPB2)構(gòu)建的進化樹；圖6菌株ZJLQ070beta-tubulingene構(gòu)建的進化樹；圖7是Muscodorsp.ZJLQ070產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體(VOCs)對植物病原真菌的影響(掃描電鏡圖片)A:終極腐霉Pythiumultimum，B:稻梨孢菌Pyriculariaoryzae，C:Muscodorsp.ZJLQ070禾口Pyriculariaoryzae，D:Muscodorsp.ZJLQ070禾口Pythiumultimum，圖8是Muscodor.sp菌株ZJLQ070活性載體制劑和Muscodor.sp菌株ZJLQ070大麥粒培養(yǎng)物對植物病原菌抑制率對照；A、曲霉Aspergillus.SP;B、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum);C、灰葡萄孢Botrytiscinerea;D、終極腐霉(Pythiumultimum);a、曲霉Aspergillus.SP;b、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum);c、灰葡萄孢Botrytiscinerea;d、終極腐霉(Pythiumultimum);注其中大寫A、B、C、D為病原菌與Muscodorsp.菌株ZJLQ070大麥粒培養(yǎng)物對峙培養(yǎng)結(jié)果；小寫a、b、c、d為病原菌與Muscodorsp.菌株ZJLQ070活性載體制劑對峙培養(yǎng)結(jié)果；圖9是Muscodorsp菌株ZJLQ070揮發(fā)性混合物VOCs防治采收后水果腐爛試驗對比圖；A、Muscodorsp菌株ZJLQ070培養(yǎng)物；B、空白對照。具體實施例方式實施例l、內(nèi)生真菌菌株的分離純化(1)植物組織標本的采集從中國浙江鳳陽山國家自然保護區(qū)(鳳陽山自然保護區(qū)位于浙江省西南部龍泉市境內(nèi)，地理位置為119°06'119°15'E，27°46'27°58'N，氣候為典型的中亞熱帶海洋性季風氣候)，在海拔12001500m采集植物標本，其中包括中華獼猴桃(Chinesegoosebeery)和喜樹(Camptothecaacuminata)，采集部位包括根、莖、葉和果實，采集后保存于保鮮袋，在4t:條件下保存時間不超過48h。(2)內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)將步驟(1)的植物標本組織用自來水沖洗表面的灰層及附著物，涼干表面水份，經(jīng)75%無水乙醇和0.5%次氯酸鈉表面消毒。根、莖、葉和果實根據(jù)表皮組織用75%無水乙醇消毒的時間控制在30-603，0.5%次氯酸鈉消毒時間為2-10min。表面消毒后用無菌水沖洗三次，無菌濾紙吸干表面水份后用無菌手術(shù)刀切成3X3mm大小的組織片，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potatodextroseagar,PDA)培養(yǎng)基上(含氨芐青霉素100iig/ml和硫酸鏈霉素60iig/ml)，90mm的培養(yǎng)皿中約接12塊組織片。25t:生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至植物組織周圍長出菌絲體，挑取菌絲尖端置于新鮮的PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)純化后保存于PDA斜面培養(yǎng)基和液體冷凍培養(yǎng)基中，PDA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)物加液體石蠟常溫保存，液體冷凍培養(yǎng)基中培養(yǎng)物保存于-8(TC超低溫冷柜。將表面消毒處理過的材料不做剪切直接植于PDA平板上作為對照檢查表面消毒是否徹底，確保分離得到的真菌是植株的內(nèi)生真菌而非表面附生菌。本發(fā)明人將采集的標本置于保溫冰盒中帶回實驗室進行分離，共分離得到158株內(nèi)生真菌菌株。實施例2、產(chǎn)揮發(fā)性混合物VOCs的內(nèi)生真菌篩選采用有格培養(yǎng)皿對峙培養(yǎng)法，將融化好的PDA培養(yǎng)基倒入有格塑料培養(yǎng)皿(90mm)中，直徑5mm的不銹鋼打孔器切取內(nèi)生真菌菌餅，接入培養(yǎng)皿一側(cè)，25。C培養(yǎng)2d-5d后，在PDA平板另一側(cè)接入病原指示菌，同時以只接病原指示菌為對照，用parafilm封口膜膜封口，待對照指示菌長滿培養(yǎng)皿一側(cè)后，觀察內(nèi)生真菌對指示病原菌菌落的生長及抑菌情況，測量指示菌菌落直徑，篩選出能產(chǎn)生揮發(fā)性混合物VOCs并且能抑制植物病原菌生長的內(nèi)生真菌。對分離純化后的158株內(nèi)生真菌菌株進行了生物活性篩選，分別以灰葡萄孢、立枯絲核菌、終極腐霉為指示菌，其中Muscodorsp.屬的5個菌株ZJLQ023、ZJLQ024、ZJLQ070、ZJLQ151、ZJLQ374產(chǎn)生具有抗菌活性的VOCs，對三種指示菌灰葡萄孢、立枯絲核菌、終極腐霉都具有很強的抑制活性，特別是ZJLQ023、ZJLQ024、ZJLQ070三個菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性混合物VOCs能完全殺死灰葡萄孢、立枯絲核菌、終極腐霉。Muscodorsp.菌株ZJLQ070保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2009年1月8日，保臧號CGMCC2864。實施例3、Muscodorsp.菌株ZJLQ070抑菌活性譜的測試將內(nèi)生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ070及Muscodoralbus(如專利200480025237.X所告知)在PDA培養(yǎng)基上生長活化10-15d備用(培養(yǎng)溫度為25°C)。分別將灰葡萄孢、立枯絲核菌、細鏈格孢、齊整小菌核、終極腐霉、尖孢鐮刀菌黃瓜專化型、圓形剌盤孢、大麗輪枝菌、核盤菌、柿盤多毛孢、稻梨孢菌、指狀青霉、蠶豆葡萄孢、褐孢霉、瀉根亞隔孢殼、曲霉、淡紫擬青霉在PDA培養(yǎng)基上活化，轉(zhuǎn)接入PDA新鮮培養(yǎng)基上，在25t:下生長3-7d后使用；釀酒酵母在YEPD固體培養(yǎng)基上劃線，挑單菌落，接種于YEPD液培養(yǎng)液中搖菌(200r/min，30°C)，48h后使用；大腸桿菌、葉桿菌先在LB固體培養(yǎng)基上劃線，挑單菌落接種于LB液體培養(yǎng)液中，37t:培養(yǎng)24h備用。將融化好的PDA培養(yǎng)基倒入有格塑料培養(yǎng)皿(90mm)中，用直徑為5mm的不銹鋼打孔器切取內(nèi)生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ070菌餅，用接種針接入培養(yǎng)皿一側(cè)，在25t:條件下分別培養(yǎng)3d、5d、7d后，在PDA平板另一側(cè)接入病原指示菌，同時以只接病原指示菌為對照，parafilm封口膜封口，培養(yǎng)一定時間后觀察菌落的生長及抑菌情況。(其中釀酒酵母、大腸桿菌、葉桿菌采用劃線法接種，其余真菌均采用菌餅接種法)，以Muscodoralbus菌株為陽性對照，測試結(jié)果見表1。表lMuscodorsp.菌株ZJLQ070和Muscodoralbus對指示菌的抑菌活性<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注表內(nèi)數(shù)據(jù)為指示菌的存活率。Muscodorsp.菌株ZJLQ070與Muscodoralbus之間相互不抑制對方的生長，Muscodorsp.菌株ZJLQ070也不會影響木霉Trichodermasp.的生長。Muscodorsp.菌株ZJLQ070對對尖孢鐮刀菌和淡紫擬青霉的抑制性相對較弱，Muscodoralbus對尖孢鐮刀菌和淡紫擬青霉及指狀青霉的抑制性都不強，而Muscodorsp.菌株ZJLQ070能完全抑制指狀青霉的生長，對尖孢鐮刀菌和淡紫擬青霉的抑制性也比Muscodoralbus要強。Muscodorsp.菌株ZJLQ070和Muscodoralbus對其它所選的指示菌都具有很強的抑制/殺滅作用。Muscodorsp.菌株ZJLQ070產(chǎn)生的VOCs能分解終極腐霉和稻梨孢菌的菌絲細胞壁，從而導致終極腐霉和稻梨孢菌菌體崩潰致死，但是Muscodoralbus只能抑制病原菌生長，而不能降解終極腐霉和稻梨孢菌菌絲體。用真空冷凍掃描電子顯微鏡(scanningelectronmicroscopy,SEM)拍攝Muscodorsp.菌株ZJLQ070產(chǎn)生的VOCs對終極腐霉和稻梨孢菌的細胞壁分解情況。顯微鏡為HITACHIS-3000N，冷凍系統(tǒng)為ALTO2100。將準備好的材料切割成0.8cmX0.8cm左右的大小(培養(yǎng)基盡量簿)，用專用膠水粘貼在樣品臺上，置于液氮中進行冷凍固定，溫度為-189t:;之后移入真空狀態(tài)的ALTO2100系統(tǒng)中進行升溫升華，控制溫度在-96t:，時間5min;升華完畢后開始降溫到-140°C以下時，電噴霧鍍金2min;之后將樣品緩慢送入固定平臺上，調(diào)整位置后打開HITACHIS-3000N顯微系統(tǒng)的操作軟件進行觀察(圖7)。Muscodorsp.菌株ZJLQ070和Muscodoralbus培養(yǎng)不同時間的培養(yǎng)物對病原菌的抑制作用比較，結(jié)果表明Muscodorsp.菌株ZJLQ070培養(yǎng)3d時間后接種病原指示菌，其抑制效果明顯比Muscodoralbus強，培養(yǎng)5d和7d后它們之間沒有明顯區(qū)別，說明ZJLQ070產(chǎn)活性VOCs快，可以更快的抑制病原菌的生長，并且具有持效久的特點。實施例4、內(nèi)生真菌ZJLQ070形態(tài)學及生理生化鑒定菌株ZJLQ070通過形態(tài)學、分子系統(tǒng)學及產(chǎn)生的VOCs組分等手段進行鑒定。參照文獻[l-2]方法，采用PDA、麥芽汁瓊脂(maltextractagar,MEA)和促孢培養(yǎng)基進行插片培養(yǎng)，誘導菌株ZJLQ070產(chǎn)孢，但經(jīng)多種促孢誘導方式(光照及化學試劑)都沒有產(chǎn)生分生孢子和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。對內(nèi)生真菌ZJLQ070的菌落形態(tài)、顏色、生長速率及顯微形態(tài)特征進行觀察，在PDA、MEA和促孢培養(yǎng)基(KH2P041g，KN031g，MgS047H200.5g，KC10.5g，可溶性淀粉0.2g，葡萄糖0.2g，蔗糖0.2g，瓊脂15g，水1000mL，自然pH值)上均不分泌色素，菌落致密呈白色(見圖1)，沒有分生孢子或產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)形成。利用真空冷凍掃描電子顯微鏡對菌株ZJLQ070的菌絲形態(tài)進行觀察，菌絲呈繩索狀纏繞(如圖2所示)。[OOM][參考文獻][l]魏景超，真菌鑒定手冊.上?？茖W技術(shù)出版社，1979[2]HawksworthDL，KirkPM，SuttonBC，etal.l995.Ainsworth&Bisby'sDictionaryoftheFungi.8thedn.CambridgeUniversityPress,London.真菌舌辛典(第八片反)，倫敦劍橋出版社在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(硝酸銨2g、磷酸二氫鉀lg、氯化鉀0.5g、硫酸鎂0.5g、硫酸亞鐵0.01g、葡萄糖30g、瓊脂20g)上，加入葡萄糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉、糊精、乙酸鈉、丙酸鈉、酒石酸銨、檸檬酸鈉、丙酮酸鈉和丙三醇中的其中任何一種為唯一碳源時，Muscodorsp.菌株ZJLQ070均不能正常生長，加入尿素、硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨中的其中任何一種為唯一氮源時，Muscodorsp.菌株ZJLQ070也均不能正常生長。但是以大麥粉、細米糠、小米粉和蔗糖為碳源，以蛋白胨、酵母粉、酵母膏、麩皮、豆餅粉和玉米漿干粉為氮源時，Muscodorsp.菌株ZJLQ070均能良好生長(碳氮源利用及生長情況見表2)。表2Muscodorsp.菌株ZJLQ070碳氮源利用情況磯氣鱖直徑(mm》Muscotforsp.ZJLQO70葡萄糖一373菌落稀親耱菌藩稀tt扁菌藩稀親果耱280菌藩稀癱麥芽糖菌落稀癍42.0m稀緣B了溶性S耮關(guān)菌落稀纖鄉(xiāng),O菌落稀親大変翳31,7菌落钂巒，餾絲錄tJft,鎳3菌落鱸密，菌豔缽白色,氣1生菌絲+富生菌絲,富小素耪訓菌藩敏密，餾絲缽白fc,48.3菌藩戴密，菌絲缽白色,氣1生菌絲豐富生菌絲豐富鲴*糠2S3菌落鱸》,菌絲缽Cl色，Ar趣妙聿贊備菌藩綴密，菌絲缽白fi,，tf油8.0T^國暨，凝亂7f鬭徑爭疆菌藩稀魔---肉翳酸鈉-菌落稀疏糊菌摹稀琉額《醴镲38,0菌,驄7.0菌藩稀蔬-菌》1簏糊糖37J菌落稀癱鬚fi縢27,7菌藩敷崈，菌絲缽6ft,^Tlfc翁絲#療,3菌藩綴密，菌鏠缽白色,&龜赫l.喻，酵母驗KJ菌藩敏密，菌絲缽Dft,鋃3S矚靈F灑菌藩綾密，菌絲缽白fi,氣氣生菌絲卞富生茵絲豐富,裔溢,7菌落敷密，菌絲體白色，4S.7菌落致密，菌絲缽白色,氣氣生菌絲生菌絲豐富豆纖2t.3菌落稀疏，無氣生菌絲47.0菌落稀疏，無氣生菌絲"E纖贛菌落致密，菌絲體白色，45.7菌落致密，菌絲缽白色,氣氣生菌絲豐富生菌絲豐富錢tt37.3菌落致密，餾絲體Cl色，備菌落致崈，菌絲體白色,氣生菌絲卩富尿素-菌落稀疏銷酸納菌落稀it腦菌落稀疏硝酸銨40.0菌落稀疏琉被銨-腦菌落稀疏注表中"-"表示菌株不能生長內(nèi)生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ070最適生長溫度測試，在PDA培養(yǎng)基上將凍存管中的內(nèi)生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ070進行活化，活化后用無菌不銹鋼打孔器切取直徑5mm的菌餅，分別轉(zhuǎn)接于PDA和MEA培養(yǎng)基上，移入10、15、20、25、28、30、35和4(TC條件下的生化培養(yǎng)箱中，15d后測量菌落生長直徑。內(nèi)生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ070在高于3(TC時不能生長，最佳的生長溫度為25°C，在MEA培養(yǎng)基上，25。C培養(yǎng)15d的菌落直徑為23-28mm，在PDA培養(yǎng)基上，25。C培養(yǎng)15d的菌落直徑為26-35mm，測試時以菌株Muscodoralbus為對照，測試結(jié)果如表3所述。表3內(nèi)生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ070最佳生長溫度測試(單位mm)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注N代表不能生長。內(nèi)生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ070耐高溫測試在PDA培養(yǎng)基上將凍存管中的內(nèi)生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ070進行活化，活化后用無菌不銹鋼打孔器切取直徑5mm的菌餅，分別轉(zhuǎn)接于PDA和MEA培養(yǎng)基上，移入30、35和4(TC條件下的生化培養(yǎng)箱中分別處理24h、48h、72h和120h，處理后將培養(yǎng)皿取出置于25°C的生化培養(yǎng)箱中10d，之后再觀察菌落生長情況并且測量菌落生長直徑，測試時以菌株Muscodoralbus為對照。內(nèi)生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ070在3(TC條件下雖然不能正常生長，但處理120小時后再轉(zhuǎn)移到25t:條件下還是能正常生長，Muscodorsp.菌株ZJLQ070不能耐35°C以上的高溫，測試結(jié)果如表4所述。表4內(nèi)生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ070耐高溫測試(單位mm)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注N代表不能生長。實施例5Muscodorsp.內(nèi)生真菌ZJLQ070分子系統(tǒng)學分析Muscodorsp.內(nèi)生真菌ZJLQ070分子系統(tǒng)學特性主要分析了其ITSrDNA、28SrDNA、RPB2和beta-tubulin基因，并進行系統(tǒng)發(fā)育分析。首先是Muscodorsp.內(nèi)生真菌ZJLQ070的總DNA提取ZJLQ070菌株接種11<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>于PDA培養(yǎng)基上，25。C培養(yǎng)3-5d，再移接至PDB液體培養(yǎng)基中，25°C、150rpm/min培養(yǎng)4d。用濾紙濾取菌絲，吸水紙吸干水份后在液氮中研成粉末，按每管約100mg的量分裝于1.5mL離心管中。采用DNeasyPlantMiniKits(QIAGEN)，按廠商的程序提取基因組DNA。在lOOmg菌體粉末中加入400y1裂解緩沖液API和4y1100mg/mlRNaseA貯存液，劇烈振蕩混勻60s，65t:保溫10min裂解細胞，隔3min振蕩混勻1次；裂解液中加130ii1緩沖液AP2，混勻，冰浴5min后14000rpm/min離心5min;取上清液至QIAshredder離心柱，14000rpm/min離心2min;將濾過液移至1.5mleppendorf管，力卩1.5倍沉淀緩沖液AP3/E，用槍頭吸打混勻；取650iU反應(yīng)液至DNeasy微型柱，11000rpm/min離心lmin，棄去收集管中的濾液；將余下的反應(yīng)液移至DNeasy微型柱，11000rpm/min離心lmin，棄去收集管和濾液；將DNeasy微型柱置于另一收集管，加500y1緩沖液AW至DNeasy微型柱，11000rpm/min離心lmin，棄去收集管中的濾液；將DNeasy微型柱重新置于收集管中，加500iU緩沖液AW至DNeasy微型柱，14000rpm/min離心2min，棄去收集管和濾液；將DNeasy微型柱置于另一1.5mleppendorf管上，力niOOiU預(yù)熱(65°C)的緩沖液AE至DNeasy膜上，室溫靜止5min，llOOOrpm/min離心lmin，收集濾液即為基因組DNA。-20"保存?zhèn)溆?。?iU樣品在1.4%Agarose膠上電泳，檢測DNA的分子大小，同時取liU稀釋50倍，測定OD260/OD280，檢測DNA含量及質(zhì)量。ITSrDNA的擴增采用通用引物ITSl(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')禾口ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')，PCR體系DNA模板(lOOng/yL)l.OyL，10xPCR緩沖液(含25mmol/LMgCl2)5.0iiL，dNTPs(5mmol/L)1.0iiL，引物(50iig/mL)各0.5iiL，TaqDNA聚合酶(2U/yL)liiL，加水補足50yL，混勻后在MJResearch公司的MinicyclerPTC-150型PCR儀上進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件94°C3min;94°C40s，55°C50s，72°C60s，30個循環(huán)；72°ClOmin。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴增產(chǎn)物用QIAGEN公司的QIAquickPCR純化試劑盒純化在PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加5倍體積的PB緩沖液，渦旋混勻；將上述混合液轉(zhuǎn)至QIAquick微型柱中，離心柱置于2mL收集管上，13000rpm離心30-60s;棄去收集管中的濾液，將微型柱重新放回收集管中；加0.75mLPE緩沖液至微型柱中，13000rpm離心30-60s;棄去收集管中的濾液，將微型柱重新放回收集管中，14000rpm離心lmin;將微型柱置于1.5mL離心管上，加30iiLEB緩沖液或水，靜止lmin后13000rpm離心lmin，收集濾液即為純化的PCR產(chǎn)物。純化后的PCR產(chǎn)物-2(TC保存?zhèn)溆?。?iiL濾液在瓊脂糖凝膠上電泳，估算濃度。28SrDNA基因的擴增采用通用引物LR0R(5'-ACCCGCTGAACTTAAGC-3')和LR5(5'-ATCCTGAGGGAAACTTC-3')，PCR體系DNA模板(100ng/yL)5.0yL，10XPCR緩沖液(含25mmol/LMgCl2)5.0iiL，dNTPs(5mmol/L)1.0iiL，引物(50iig/mL)各0.5iiL，TaqDNA聚合酶(2U/yL)liiL，加水補足50yL，混勻后在MJResearch公司的MinicyclerPTC-150型PCR儀上進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件94°C3min;94°C30s，52°C50s，72。C60s，35個循環(huán)；72°C10min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴增產(chǎn)物用QIAGEN公司的QIAquickPCR純化試劑盒純化在PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加5倍體積的PB緩沖液，渦旋混勻；將上述混合液轉(zhuǎn)至QIAquick微型柱中，離心柱置于2mL收集管上，13000rpm離心30-60s;棄去收集管中的濾液，將微型柱重新放回收集管中；加Q.75mLPE緩沖液至微型柱中，13000rpm離心30-60s;棄去收集管中的濾液，將微型柱重新放回收集管中，14000rpm離心lmin;將微型柱置于1.5mL離心管上，加30iiLEB緩沖液或水，靜止lmin后13000rpm離心lmin，收集濾液即為純化的PCR產(chǎn)物。純化后的PCR產(chǎn)物-2(TC保存?zhèn)溆?。?iiL濾液在瓊脂糖凝膠上電泳，估算濃度。RPB2基因的擴增采用通用引物frpb2-5f(5'-GAYGAYMGWGATCAYTTYGG-3')禾口frpb2-7cr(5'-CCCATRGCTTGYTTRCCCAT-3')，PCR體系DNA模板(lOOng/iiL)5.0iiL，10XPCR緩沖液(含25mmol/LMgCl2)5.0iiL，dNTPs(5mmol/L)1.0iiL，弓l物(50iig/mL)各0.5iiL，TaqDNA聚合酶(2U/PL)lyL，加水補足50iiL，混勻后在MJResearch公司的MinicyclerPTC-150型PCR儀上進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件94。C3min;94°C30s，53°C50s，72°C90s，35個循環(huán)；72°C10min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴增產(chǎn)物用QIAGEN公司的QIAquickPCR純化試劑盒純化在PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加5倍體積的PB緩沖液，渦旋混勻；將上述混合液轉(zhuǎn)至QIAquick微型柱中，離心柱置于2mL收集管上，13000rpm離心30-60s;棄去收集管中的濾液，將微型柱重新放回收集管中；加0.75mLPE緩沖液至微型柱中，13000rpm離心30-60s;棄去收集管中的濾液，將微型柱重新放回收集管中，14000rpm離心lmin;將微型柱置于1.5mL離心管上，加30iiLEB緩沖液或水，靜止lmin后13000rpm離心lmin，收集濾液即為純化的PCR產(chǎn)物。純化后的PCR產(chǎn)物-2(TC保存?zhèn)溆?。?iiL濾液在瓊脂糖凝膠上電泳，估算濃度。beta-tubulin基因的擴增采用通用引物BT1(5'-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3')禾PBT22(5'-TCTGGATGTTGTTGGGAATCC-3')，PCR體系DNA模板(100ng/yL)5.0yL，10XPCR緩沖液(含25mmol/LMgCl2)5.0iiL，dNTPs(5mmol/L)1.0iiL，弓|物(50yg/mL)各0.5yL，TaqDNA聚合酶(2U/yL)lyL，加水補足50iiL，混勻后在MJResearch公司的MinicyclerPTC-150型PCR儀上進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件94。C3min;94°C30s，53°C50s，72°C90s，35個循環(huán)；72°C10min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴增產(chǎn)物用QIAGEN公司的QIAquickPCR純化試劑盒純化在PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加5倍體積的PB緩沖液，渦旋混勻；將上述混合液轉(zhuǎn)至QIAquick微型柱中，離心柱置于2mL收集管上，13000rpm離心30-60s;棄去收集管中的濾液，將微型柱重新放回收集管中；加0.75mLPE緩沖液至微型柱中，13000rpm離心30-60s;棄去收集管中的濾液，將微型柱重新放回收集管中，14000rpm離心lmin;將微型柱置于1.5mL離心管上，加30yLEB緩沖液或水，靜止lmin后13000rpm離心lmin，收集濾液即為純化的PCR產(chǎn)物。純化后的PCR產(chǎn)物-20°C保存?zhèn)溆?。?iiL濾液在瓊脂糖凝膠上電泳，估算濃度。純化后的PCR產(chǎn)物進行連接反應(yīng)，連接體系(10iiL)如下2XT4連接酶緩沖液5iiL，PCR純化產(chǎn)物2iiL，PGEM-T載體1yL，T4連接酶1yL，ddH201PL?；靹驑悠罚?t:連接過夜。將10i!L連接混合液轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化程序如下從-S(TC超低溫冰箱中取100iiL感受態(tài)細胞懸液，放置冰上解凍；加入DNA連接液10iiL，輕輕搖勻，冰上放置30min;42。C水浴中熱擊90s，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5min;向離心管中加入0.8mLLB液體培養(yǎng)基(不含Amp)，混勻后37°C、80rpm振蕩培養(yǎng)lh，使細菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因；將上述菌液5000rpm離心30s，倒掉部分培養(yǎng)基，保留約300iiL，搖勻后取100yL涂布于含100yg/yLAmp的藍白斑篩選平板上(在含適當抗生素的預(yù)制90mm瓊脂平板中央滴加40yL3%X-gal和7iiL20%IPTG.，用一個無菌的涂布器涂勻，37。C溫浴直至全部液體吸收)，正面向上放置0.5h，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37t:培養(yǎng)16-24h;挑取白色克隆，LB液體培養(yǎng)，保存，進行插入片段驗證和測序分析。CTAB法抽提質(zhì)粒用無菌牙簽挑取分離的單菌落接種到5ml含100iig/mLAmp的LB液體培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)12h至對數(shù)生長后期，將1.5mL過夜培養(yǎng)菌液加入1.5mL離心管中，12000rpm離心30s，棄去上清液，將離心管倒置使上清液全部流盡，加入200iiLSTET(含糖)，充分懸浮菌體，加入4iiL濃度為10mg/mL的溶菌酶，顛倒混勻，室溫放置5min，沸水煮50s，12000rpm離心10min，用牙簽去除沉淀，上清加入5yL10mg/mL的RNase，顛倒混勻，68。C水浴10min，加入10y15%(w/v)CTAB，混勻室溫放置3min，12000rpm離心5min，沉淀懸浮于300iiL1.2mol/LNaCl溶液中，渦旋，加入750yL無水乙醇，室溫放置5min，12000rpm離心2min，沉淀用500yL70%乙醇沖洗，12000rpm離心2min，沉淀于空氣或溫箱中干燥后，溶解于20iUTE或雙蒸水中。提取出來的質(zhì)粒經(jīng)驗證后，送公司測序，測序由上海生工生物工程服務(wù)有限公司完成。內(nèi)生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ070的ITSrDNA、28SrDNA、RPB2和beta-tubulin基因序列如附件序列表所述(SEQIDNO:1—-SEQIDNO:4)。內(nèi)生真菌ZJLQ070的ITSrDNA、28SrDNA、RPB2及beta-tubulin基因序列在GenBank上進行BLAST搜索?；贐LAST結(jié)果，用軟件ClustalX1.81將菌株ZJLQ070基因序列與包括Muscodor屬在內(nèi)的相關(guān)屬進行系統(tǒng)發(fā)育分析。系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建由軟件PAUP*4.0bl0完成，應(yīng)用最大簡約法中的啟發(fā)式搜尋法進行系統(tǒng)發(fā)生分析，具體設(shè)置如下用逐步添加法生成樹，添加隨機序列，重復(fù)1000次；樹-對分-重接法作為分枝交換運算法則；序列中單個缺口作為第五種堿基對待，插入的序列若與其他序列不同源則被刪除；應(yīng)用自舉分析評估樹的可靠性，設(shè)置自舉值為1000個重復(fù)。從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果確定，ZJLQ070為Muscodor屬的新種，與己知的Muscodor屬真菌Muscodoralbus、Muscodorroseus、Muscodorvitigentis禾口Muscodorcrispans不同。實施例6內(nèi)生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ070產(chǎn)生的VOCs分析內(nèi)生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ070產(chǎn)生的VOCs采用固相萃取/氣相色譜/質(zhì)譜技術(shù)(Solidphasemicroextraction/Gaschromatograph/Massspetra，SPME/GC/MS)分禾斤。>|每Muscodorsp.菌株ZJLQ070菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，25。C培養(yǎng)3-5d，切取菌餅轉(zhuǎn)接到PDA或MEA培養(yǎng)基上，用封口膜將一次性塑料培養(yǎng)皿封口，25t:生化培養(yǎng)箱里培養(yǎng)一定時間(3d、5d、10d)，用細針頭從培養(yǎng)皿邊緣鉆一小孔。將固相微萃取不繡鋼保護針管插入GC/MS的進樣室，推出萃取頭，使萃取頭暴露GC氣化室中，24(TC活化20分種，之后將萃取頭縮回保護針管，立即插入已準備好的待測培養(yǎng)皿中，推出萃取頭，使萃取頭暴露在培養(yǎng)皿中，不能碰到菌絲，室溫下萃取45分鐘后，立即將萃取頭縮回保護針管，立即插入GC/MS的進樣室，推出萃取頭，萃取頭暴露GC氣化室中，24(TC解吸30秒，進行色譜測定。分析操作條件及器材如下儀器、試劑及GC/MS條件固相微萃取裝置(美國Supelco公司)，萃取頭涂層為50/30iiMDVB/CAR/PDMS;氣相色譜儀-質(zhì)譜儀(Agilent6890NGC/5975BinertXLMS)，石英毛細管柱HP-5MS(30mX250iimX0.25iim);數(shù)據(jù)檢索應(yīng)用NIST05數(shù)據(jù)庫。色譜條件載氣為氦氣，柱流量l.OmL-min—1;汽化室溫度240°C，色譜柱初始溫度30°C，保持3min，以5°Cmin-1升溫速率升至220°C。質(zhì)譜條件EI電離源，電離電壓70eV，離子源溫度23(TC，四極桿溫度15(TC，接口溫度28(TC，掃描范圍20-450amu，不分流。通過GC/MS分析，得到各成分的總離子流圖，根據(jù)標準圖譜和有關(guān)文獻確定各組分的化學成分，并按峰面積歸一法計算各組分的相對百分含量，測試分析結(jié)果見表5:表5內(nèi)生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ070和Muscodoralbus培養(yǎng)5d產(chǎn)生的VOCsRTPossiblecompoundAfrTotalarea(%)《min:s)ZJLQ070M.albus3遍Propanoicadd,2-methy卜，methylester2-甲基-丙酸甲酯1028.024.394.510-Butano1，3-methyI-3-甲基--r醉黼-0477艦Propanoicacid，2-methyl-2-甲基閃酸容877.0829.1213,515.alpha.誦Phellandrenea-水芹烯136固，4,321.beta.-Phellandrenep-水芹烯136W房g*PhenylethylAlcohol苯乙醇122-1,25n,2絲2-Cyclohexen-1-ol，l-methyl~4-(l-methylethyl)-，trans-反式-卜甲基~4-(1-甲基乙基)-2-環(huán)己烯1540.13，7扁2-Cyclohexen-1-ol，1-methyM《1-methylethyl)國，c〗s順式-1-甲基斗(1-甲基乙基)-2-環(huán)己錄-l-醇1540,10請,5聽2-Cyclohexen-1-ol，3隱methyl-6-(1-methylethyl)-，trans-反式-3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-環(huán)己懶-l-醇1540.32訓542-Cycohexen-l-o，3-methyl-6"(l-methylethyl)-,cis-順式-3'甲基-6《-甲基乙基口-環(huán)己烯■1-S^540.04<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>27.,*Azulene，1，2,3，5，6，7,8,8a-octahydro-i，4"dimethyl-7>(1-methyIethenyl)-,[1S-(1.alpha.,7.alpha_，8a.beta.)]-麵(commonname:valencene)2M[1S-(lalpha^alpha^abeta)]-1,2,3,5,6,7,8,8a-八氣化-i,4-二甲基-7-(1-甲基乙基)萬0.191.4031細Tricyclo〖6.3.0.0(2,4)]undec-8"ene,3,3,7，ll-tetrame爭3,3,7,11-四甲基二環(huán)[6.3.0.0(2,4)]十一^04碳-s-烯0,060,1，主要的抗菌活性化合物由(a)2-甲基-丙酸甲酉旨(Propanoicacid，2-methyl-，methylester);(b)2-甲基丙酸(Propanoicacid，2-methyl-);(c)l-乙烯基-1-甲基-2.4-二(1-甲基乙烯基)-環(huán)己烷(Cyclohexane，l-ethenyl-l-methyl-2，4-bis(l-methylethenyl)-，[IS-(I.alpha.,2.beta.，4.beta.)]-);(d)石竹烯(Caryophyllene);(e)2，6-二甲基-6-(4-甲基-3-戊烯)二環(huán)[3丄1]庚-2-烯(-Bicyclo[3丄l]hept-2-ene，2，6-dimethyl-6-(4-methyl-3-pentenyl)-);(f)l，2，3，4，5，6，7，8-八氫化-1，4-二甲基-7-(1-甲基亞乙基)奧(Azulene，1，2，3，4，5，6，7，8-octahydro-l，4-dimethyl-7-(l-methylethenyl)-，[IS-(I.alpha.，4.alpha.，7.alpha.)]-);(g)l，2，3，4，4a，5，6，8a-八氫化-4a，8-二甲基-2-(l-甲基乙基)萘(Naphthalene,1，2，3，4，4a，5，6，8a-octahydro-4a，8-dimethyl-2-(l-methylethenyl)-，[2R-(2.alpha.,4a.alpha.，8a.beta.)]-);(h)3，3，7，11-四甲基三環(huán)[6.3.0.0(2，4)]—^一碳-8-烯(Tricyclo[6.3.0.0(2，4)]undec-8-ene，3，3，7，ll-tetramethyl-)，重要的是含有(i)a-水j^烯(alpha,Phellandrene);(j)P-水？B希(beta,Phellandrene);(k)反式1-甲基-4-(l-甲基乙基)-2-環(huán)己烯-1-醇，(2-Cyclohexen-l-ol，1-methyl-4-(1-methylethyl)-，trans-)(1)順式1-甲基-4-(l-甲基乙基)-2-環(huán)己烯-1-醇(2-Cyclohexen-l-ol，1-methyl-4-(1-methylethyl)-，cis-)(m)反式3-甲基-6-(l-甲基乙基)-2-環(huán)己烯-1-醇(2-Cyclohexen-l-ol，3-methyl-6-(1-methylethyl)-，trans-)(n)順式3-甲基-6-(l-甲基乙基)-2-環(huán)己烯-1-醇(2-Cyclohexen-l-ol，3-methyl-6-(l-methylethyl)-，cis-)類等活性物質(zhì)。實施例7Muscodorsp.菌株ZJLQ070活性載體制劑的制備本發(fā)明制備Muscodorsp.菌株ZJLQ070活性載體制劑的方法，該方法包括(1)Muscodorsp.菌株ZJLQ070種子培養(yǎng)液的制備，(2)將Muscodorsp.菌株ZJLQ070種子液接種于載體培養(yǎng)基中，(3)Muscodorsp.菌株ZJLQ070在載體培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長，(4)Muscodorsp.菌株ZJLQ070載體培養(yǎng)物的干燥密封包裝。適當?shù)墓腆w載體為垤石、珍珠巖或硅藻土，最優(yōu)選為硅藻土；合適的培養(yǎng)基為包括鈣離子、鎂離子、鐵離子、磷酸鹽離子和其它微量元素、蛋白胨、酵母提取物、大豆餅粉、葡萄糖、小米粒、大麥粉、麩皮、土豆汁和玉米漿的組合物；穩(wěn)定劑包括蔗糖、葡萄糖、甘油或乳糖，最優(yōu)選為甘油；以及合適的培養(yǎng)條件，包括pH、溫度、濕度及培養(yǎng)時間。具體如下1)在優(yōu)選的實施方案中Muscodorsp.菌株ZJLQ070種子液制備是通過將菌株ZJLQ070在PDA培養(yǎng)基上活化后，將菌餅接入優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基中來制備種子液。優(yōu)選的種子液體培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(potatodextrosebroth，PDB)、MID改訂培養(yǎng)液(每升含蔗糖30.00g，蛋白胨1.00g，酵母粉0.25g，酒石酸銨5.00g，Ca(NO3)20.28g，KNO30.08g，KC10.06g，MgSO40.36g，NaH2P04H200.02g，F(xiàn)eCl3.6H2O2.0mg，MnSO45.0mg，ZnS04.7H202.5mg，H3B031.4mg，KI0.7mg，pH5.5)、大麥粉酵母粉培養(yǎng)基(每升含大麥粉30g、酵母粉5.0g、蛋白胨3.0g、Ca(NO3)20.4g，KNO30.12g，KC10.2g，MgSO40.25g，F(xiàn)eCl3.6H205.0mg，MnSO45.0mg，ZnS04.7H205.0mg，H3BO32.0mg，KIl.Omg，pH5.5)、小米粉酵母粉培養(yǎng)基(每升含小米粉30g、酵母粉5.0g、蛋白胨3.0g、Ca(NO3)20.4g，KNO30.12g，KC10.2g，MgSO40.25g，F(xiàn)eCl36H205.0mg，MnSO45.0mg，ZnS047H205.0mg，H3BO32.0mg，KIl.Omg，pH5.5)和細米糠酵母粉培養(yǎng)基(每升含細米糠30g、酵母粉5.0g、蛋白胨3.0g、Ca(NO3)20.4g，KNO30.12g，KC10.2g，MgSO40.25g，F(xiàn)eCl3.6H205.0mg，MnSO45.0mg，ZnS047H205.0mg，H3BO32.0mg，KIl.Omg，pH5.5)，更優(yōu)選為大麥粉酵母粉培養(yǎng)基、小米粉酵母粉培養(yǎng)基和細米糠酵母粉培養(yǎng)基，最優(yōu)選為小米粉酵母粉培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)液的制備在控制的溫度以及pH和轉(zhuǎn)速下生長，以獲得高細胞密度的培養(yǎng)物。優(yōu)選的溫度介于10-3(TC之間，更優(yōu)選介于20-28t:之間，最優(yōu)選為25t:。優(yōu)選的pH是3-8，優(yōu)選4-7，更優(yōu)選為5.5。優(yōu)選的轉(zhuǎn)速為50-300rpm之間，更優(yōu)介于100-200rpm，最優(yōu)選為150rpm。培養(yǎng)時間優(yōu)選為2-10d，更優(yōu)選為3-8d，最優(yōu)選為5d，培養(yǎng)之后采收全部種子培養(yǎng)液。2)將制備好的Muscodorsp菌株ZJLQ070種子培養(yǎng)液接入載體培養(yǎng)基，在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下生長。優(yōu)選的固體載體為垤石、珍珠巖或硅藻土，最優(yōu)選為硅藻土；優(yōu)選培養(yǎng)基包括鈣離子、鎂離子、鐵離子、磷酸鹽離子和其它微量元素、蛋白胨、酵母提取物、大豆餅粉、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖、小米粒、大麥粉、麩皮、細米糠、土豆汁和玉米槳的組合物；更優(yōu)選為硝酸f丐、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鋅、硫酸錳、氯化鐵、硼酸、碘化鉀、蛋白胨、酵母提取物、大豆餅粉、葡萄糖、小米粒、大麥粉、麩皮、細米糠、土豆汁和玉米漿的組合物，最優(yōu)選為硝酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鋅、硫酸錳、氯化鐵、硼酸、碘化鉀、蛋白胨、酵母提取物、大豆餅粉、葡萄糖、小米粒、麩皮、細米糠、土豆汁的組合物。優(yōu)選固體載體硅藻土在載體培養(yǎng)基中(干基計)的比例50-90%，更優(yōu)為70-90%，最優(yōu)為85%。作為本發(fā)明的培養(yǎng)基的改進，該載體培養(yǎng)基的組成為硅藻土380g/kg、硝酸鈣0.4g/kg、硫酸鎂0.25g/kg、磷酸二氫鉀1.0g/kg、氯化鉀0.2g/kg、硫酸鋅5mg/kg、硫酸錳5mg/kg、氯化鐵5mg/kg、硼酸2mg/kg、碘化鉀lmg/kg、蛋白胨5.0g/kg、酵母提取物3.0g/kg、大豆餅粉5.0g/kg、葡萄糖10.0g/kg、小米粒20.0g/kg、麩皮30.0g/kg、細米糠20.0g/kg，其余為土豆汁，將濕度控制在45%。也就是說將酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鋅、硫酸錳、氯化鐵、硼酸、碘化鉀、蛋白胨、酵母提取物、大豆餅粉、葡萄糖、小米粒、麩皮、細米糠的組合物溶于土豆汁中形成混合液，再與硅藻土混合均勻。優(yōu)選溫度為20-3(TC，更優(yōu)選為22-28t:，最優(yōu)選為25t:。優(yōu)選的生長時間為l-15d，更優(yōu)選3-12d，最優(yōu)選為7d。優(yōu)選的濕度控制在20-80%，更優(yōu)為30-70%，最優(yōu)為55%。優(yōu)選接種時種子培養(yǎng)液與載體培養(yǎng)基的比例為1-20%(重量比)，更優(yōu)選的比例為5-15%，最優(yōu)選10%。3)在活性載體制劑中添加穩(wěn)定劑，例如蔗糖、葡萄糖、甘油或乳糖等，以保持菌體細胞的活性，在優(yōu)選的方案中，穩(wěn)定劑為蔗糖、葡萄糖、甘油或乳糖，更優(yōu)選為蔗糖、葡萄糖、甘油，最優(yōu)選為甘油。添加穩(wěn)定劑的時間為固體發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束時加入，在穩(wěn)定劑加入量優(yōu)選方案中，優(yōu)選的比例為5-20%(穩(wěn)定劑活性載體制劑的重量比)，更優(yōu)選為10-15%，最優(yōu)選為10%。之后再進行干燥包裝，干燥時采用低溫低凍技術(shù)，以抑制Muscodorsp.菌株ZJLQ070菌體細胞的生長代謝活動。優(yōu)選商品活性載體制劑的水分控制指標為10-50%，更優(yōu)化為15-35%，最優(yōu)為20%。包裝是為了給活性載體制劑提供一個穩(wěn)定安全的貯存與使用微環(huán)境，本發(fā)明是將干燥后的活性載體制劑裝入透氣透濕的環(huán)境中，外層采用無紡布保護，在內(nèi)層玻璃膜袋中事先配備定量的活化營養(yǎng)液，只要使用時用手擠壓就可以使營養(yǎng)液加入活性載體制劑中，以使菌株ZJLQ070菌體細胞得到水分和營養(yǎng)以恢復(fù)生長，釋放出抗菌活性的揮發(fā)性混合物VOCs。活化營養(yǎng)液包括水、蛋白胨、酵母提取物、生物生長素、葡萄糖及微量元素(為公知技術(shù))。采用二分隔平皿對峙培養(yǎng)法測試Muscodorsp.菌株ZJLQ070活性載體制劑抑制植物病原菌的活性，以不加Muscodorsp.菌株ZJLQ070培養(yǎng)物為空白對照。病原指示菌灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌、終極腐霉、曲霉。將病原指示菌接在PDA培養(yǎng)基上活化，切取菌絲塊(直徑5mm)(曲霉用孢子懸浮液接種)接種于PDA培養(yǎng)基(90mm有隔培養(yǎng)皿)一則，將Muscodorsp.菌株ZJLQ070培養(yǎng)物置于培養(yǎng)皿另一側(cè)(無培養(yǎng)基)，用parafilm膜封口，25t:生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待空白對照皿中病原菌菌落長至快滿皿時，測量Muscodorsp.菌株ZJLQ070培養(yǎng)物產(chǎn)生的揮發(fā)性混合物質(zhì)VOCs對病原指示菌的生長抑制，計算抑制率。將測試后的未生長的病原菌菌餅塊取出轉(zhuǎn)接到新鮮的PDA培養(yǎng)基上，25t:生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，檢查其是否能生長，確定Muscodorsp.菌株ZJLQ070培養(yǎng)物產(chǎn)生的揮發(fā)性混合物質(zhì)VOCs是否可以完全殺死病原菌(圖8)。測試結(jié)果表明Muscodorsp.菌株ZJLQ070活性載體制劑對病原指示菌尖孢鐮刀菌的抑制活性比Muscodorsp.菌株ZJLQ070大麥粒培養(yǎng)物強，由于Muscodorsp.菌株ZJLQ070產(chǎn)生的VOCs對曲霉、灰葡萄孢和終極腐霉比較敏感，兩種培養(yǎng)物都能完全殺死它們。實施例8Muscodorsp.菌株ZJLQ070產(chǎn)生的VOCs防治采收后水果腐爛試驗為了測試Muscodorsp.菌株ZJLQ070產(chǎn)生的VOCs對采后水果腐爛的防治作用，實施例如下將用生長在PDA培養(yǎng)基上或制備好的活性載體制劑Muscodorsp.菌株ZJLQ070來控制采收后水果的腐爛問題。具體而言，挑取采收后無傷口和蟲害的水果(新疆香梨或水蜜桃)，置于水果保存盒中(可密封)，手術(shù)刀輕輕劃一傷口，在傷口上接入褐腐病菌(Moniliniafructicola)，并在傷口敷上濕潤的濾紙片用于保濕，將生長在PDA培養(yǎng)基上或制備好的活性載體制劑Muscodorsp.菌株ZJLQ070放置于水果保存盒內(nèi)，用于抑制病原菌的生長，加蓋密封，放入25t:的人工氣候箱，保持濕度在85%。每處理3重復(fù)，以不加Muscodorsp.菌株ZJLQ070培養(yǎng)物為對空白對照，3-5d后取出水果，調(diào)查發(fā)病情況并拍照記錄。結(jié)果表明Muscodorsp.菌株ZJLQ070培養(yǎng)物產(chǎn)生的VOCs可以較好的控制采收后水果腐爛問題(圖9)。實施例9Muscodorsp.菌株ZJLQ070產(chǎn)生的VOCs對種苗病害的防治作用以蘿卜幼苗生長法測定Muscodorsp.菌株ZJLQ070產(chǎn)生的VOCs對種苗病害的防治作用。將磨碎后的D至石裝入直徑50mm、高度400mm的試管中，裝入D至石的高度約為10cm，12rC濕熱滅菌20min。在每個試管中接入病原菌終極腐霉菌餅(直徑8mm)5-6塊，用隉石覆蓋，其上撒入10粒種子(短葉十三號蘿卜，廣東省良種引進服務(wù)公司提供)，再用隉石覆蓋。測試組試管里掛上Muscodorsp.菌株ZJLQ070活性載體制劑(外面用紗布包裝)，以只接病原菌為空白對照，試管用透氣軟塞封口。移入人工氣候箱(25°C，光照黑暗二12h:12h)中培養(yǎng)，定期統(tǒng)計發(fā)芽率及觀察種苗的發(fā)病情況。表6Muscodorsp.菌株ZJLQ070產(chǎn)生的VOCs對種苗病害的防治作用<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>Muscodorsp菌株ZJLQ070活性載體制劑產(chǎn)生的VOCs能有效地抑制終極腐霉對蘿卜種子萌發(fā)、幼苗生長的影響。實施例10Muscodorsp.菌株ZJLQ070活性載體制劑產(chǎn)生的VOCs抑制人類生存環(huán)境中空氣微生物數(shù)量的測試為了測試Muscodorsp.菌株ZJLQ070活性載體制劑產(chǎn)生的VOCs對空氣中微生物數(shù)量的影響及環(huán)境中微生物狀況，采用平皿培養(yǎng)法測試。將15-20毫升的PDA培養(yǎng)基倒入直徑為90mm無菌培養(yǎng)皿，待培養(yǎng)基凝固后再使用。測試在浙江大學生物技術(shù)研究所生物技術(shù)樓實驗室(室溫25°C)進行，用玻璃板隔開二小間(每間l-2m2)，其中處理間放置Muscodorsp.菌株ZJLQ070活性載體制劑100g，對照間不放置Muscodorsp.菌株ZJLQ070活性載體制劑，48h、72h和120h后將準備好的培養(yǎng)皿置于處理間和對照間，并打開蓋子，使其在空氣中暴露60min，將培養(yǎng)皿蓋子合上后移入25t:的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，測試空氣中的微生物數(shù)量。表7Muscodorsp.菌株ZJLQ070活性載體制劑抑制人類生存環(huán)境中空氣微生物數(shù)量的測試結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>Muscodorsp.菌株ZJLQ070活性載體制劑能有效地減少環(huán)境空氣中微生物的數(shù)量，Muscodorsp.菌株ZJLQ070活性載體制劑在暴露72h后對空氣中微生物的抑制率達到70.5%，與暴露120h沒有明顯差異。實施例11可分離自Muscodorsp.菌株ZJLQ070培養(yǎng)物產(chǎn)生的VOCs的人工合成混合物殺菌劑本申請人發(fā)現(xiàn)，(l)Muscodorsp.菌株ZJLQ070培養(yǎng)物產(chǎn)生VOCs的基本所有成分；(2)Muscodorsp.菌株ZJLQ070培養(yǎng)物產(chǎn)生VOCs中部分成分的組合，或(3)Muscodorsp菌株ZJLQ070培養(yǎng)物的產(chǎn)生VOCs中一種成分的合成VOCs具有Muscodorsp.菌株ZJLQ070的殺菌特性。為了測試各類化合物相對的生物活性和各類化合物在全部混合物中最適濃度及比例，全部混合物為標準培養(yǎng)平板中的培養(yǎng)物上每50mL空域的100i!L的檢測混合物。例如，3-水芹烯占鑒定揮發(fā)物混合物的4.37%，以4.37iiL/50mL(0.0874iiL/mL)空域測試對P-水芹烯進行測試，其它化合物也是以相同的標準過程。以8.02%2-甲基-丙酸甲酯、77.08%2-甲基丙酸、0.67%1-乙烯基-l-甲基-2.4-二(1-甲基乙烯基)-環(huán)己烷、0.11%石竹烯，0.07%2，6-二甲基-6-(4-甲基-3-戊烯)二環(huán)[3丄l]庚-2-烯，0.84%1，2，3，4，5，6，7，8-八氫化-l，4-二甲基-7-(l-甲基亞乙基)奧、6.02%1，2，3，4，4a，5，6，8a-八氫化-4a，8-二甲基-2-(1-甲基亞乙基)萘，0.06%3，3，7，11-四甲基三環(huán)[6.3.0.0(2，4)]—^一碳-8-烯、7.13%丙酮配制成有機混合物(稱為組合物1)。設(shè)低、中、高三個水平的組合物1與0.36%a-水芹烯、4.37%P-水^烯、0.13%反式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-環(huán)己烯-l-醇、0.10%順式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-環(huán)己烯-l-醇、0.32%反式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-環(huán)己烯-l-醇、0.04%順式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-環(huán)己烯-1-醇進行混合，測試混合性揮性化合物對指示病原菌的抑制性，以終極腐霉為病原指示菌，測試結(jié)果見表8。表8三個不同水平的組合物1與其它化合物配成的人工合成揮發(fā)性混合物對終極腐霉的抑制率序號名稱<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>從測試結(jié)果可以看出，高、中、低三個水平的組合物1與0.36%a-水芹烯、4.37%P-水^烯、0.13%反式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-環(huán)己烯-l-醇、0.10%順式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-環(huán)己烯-l-醇、0.32%反式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-環(huán)己烯-l-醇、0.04%順式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-環(huán)己烯-1-醇混合物的揮發(fā)性氣體對終極腐霉的抑制率不同，低水平時時的抑制率最低，中水平和高水平抑制率都達到100%。實施例12、人工合成的殺菌劑，其包括如表9所述體積百分比的成分，余量為丙酮。表9、殺菌劑的3個實施例22<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>采用二分隔平皿培養(yǎng)法測試以NlN3和等同表于5的Muscodoralbus培養(yǎng)5d產(chǎn)生的VOCs(作為對比例)抑制植物病原菌的活性實驗。病原指示菌灰葡萄孢、立枯絲核菌、細鏈格孢、齊整小菌核、終極腐霉、尖孢鐮刀菌黃瓜?；?、圓形剌盤孢、大麗輪枝菌、核盤菌、柿盤多毛孢、稻梨孢菌、指狀青霉、蠶豆葡萄孢、褐孢霉、瀉根亞隔孢殼、曲霉、淡紫擬青霉。將病原指示菌接在PDA培養(yǎng)基上活化，切取菌絲塊(直徑5mm)(曲霉用孢子懸浮液接種)接種于PDA培養(yǎng)基(90mm有隔培養(yǎng)皿)一側(cè)，將以按照NlN3和等同于表5的Muscodoralbus培養(yǎng)5d產(chǎn)生的VOCs(作為對比例)中各種化合物比例的4種混合物分別加入培養(yǎng)皿另一側(cè)(每種混合物用量均分別為100yL)，用parafilm膜封口，25t:生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待空白對照皿中病原菌菌落長至快滿皿時，測量人工合成的揮發(fā)性混合物質(zhì)VOCs對病原指示菌的生長抑制，計算抑制率，結(jié)果如表10所示。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>cctttgtgaacctaccatcgttgcttcggcggcggaggtgctacgctgcaaggcgctacc60ctgtagttaccctgtagtcccagggagctgtcatcagctctttaggggagcccacagcct120昭cgacgttttcgtoc昭ggctgt昭ctccggactgccctccccgccggcggcc^cla180aactctgttttctttggaactctgaatcataaacttaataagttaaaactttcaacaacg240gatctcttggttctggratcg啤鄉(xiāng)^cgragcga^tgcg她敏a啤tg礎(chǔ)tg300c昭礎(chǔ)tragtg礎(chǔ)ratcg^tctttg^cgrarattgcgccratogcattct敏gg360gcatgcctgttcgagcgtcatttcaccacttaagccctgttgcttagcgttgggggccta420cggcacagcctgtagccccttaaagtgattggcggagttggttctatctctaagcgtagt480aatttcttctcgcttctgcagtagtgctggcccccgccgtaaaa524SEQIDNO:2核糖體大亞基(28SrDNA)基因序列ttgccctagtaacggcgagtgaagcggcaacagctcaaatttgaaatctggctctcgggc60ccgagttgtaatttgtagaggatgattttggcgcggtgccttccgagttccctggaacgg120gacgccttagagggtgagagccccgtacggttggacaccaagcctctgtaaatctccttc180gacgagtcgagtagtttgggaatgctgctctaaatgggaggtaaatttcttctaaagcta240a她ccggcc昭昭accgat昭cgrac鄉(xiāng)tog敏gatcg^昭啤^鄉(xiāng)C3Ctttg300^3昭昭ggtto她gracgtg3礎(chǔ)tgttga^ggg^gra她clacc昭acctct360gccctgcggatcatgtggtgttctcaccgctgcacttcgcttggtttaggccagcatcgg420tttttgtagggggataaaagccttaggaacgtagctccctcgggagtgttatagcctttt480gcataatacccttacggggaccgaggaccgcgcttcggcaaggatgctggcataatggta540gtcaatgacccgtcttgaaacacggaccaaggagtcgaacatttgtgcgagtgtttgggt600gttaaaccctcacgcgtaatgaaagtgaacgtaggtgagagcccttacgggtgcatcatc660gaccgatcttgatgtcttcggatggatttgagtaagagcataactgttcggacccgaaag720atggtgaactatgcgtggatagggtgaagccagaggaaactctggtggaggctcgcagcg780gttctgacgtgcaaatcgatcgtcaaatctgcgcatgggggcgaaagacttatcgaacca840to^cc昭cggt^礎(chǔ)g3ctoct昭gtggto昭昭gccccccgcgagggg昭昭gc900ct昭gggggttocccggt昭ctgclaccctgcacttccgggtggccgcccgaratcgcla960礎(chǔ)tgcg昭garatccracc鄉(xiāng)gcc昭gggtlaccgccgcccgctga^昭cgccgcgg1020caccgagagtagcgctcttgggtacggtaaaaacgcccccggtagcggacgacttgcagc1080caaccccgcactacaggggaaggttcacagactaaacagcgatgggtcggcgcgctgccg1140gcctaagacatagtcgacctggggcctgagaaggtgccctgcagcgtggcgtacaggcg1199SEQIDNO:3RNA聚合酶II(RNApolymeraseIIsubunit，RPB2)基因序列cttttccgtaacatcgtccgccgcatgacgcaggaggtcttgtcccacttgaagcgaagc60atcg昭c昭ggc^gc敏tc^ratcgccctcgccgtra昭gcca她ttotoct昭c120ggtctcaagtactcgctcgccaccggtaactggggtgatcagaagaaagccatgagctcc180accgctggcgtgtcccaggtgctcaacagatatactttcgcgtccacgctctcgcatttg240cgacg^craaracgcccgt昭gtcg昭atggc^gctcgcc鄉(xiāng)ccccgcc昭cttrac300^raccractggggcct敏ttgtcctgccg昭acccccg昭ggtc昭gcctgtggtctg36025/25頁:0180]gtgaagaacttgtctcttatgtgctccgtcagtgtcggcacctcgacggagcccatcatc420:0181]gagtacatggcgtcccggaacatggagattctcgaagaatacgaaccccagcgctatccc480:0182]aatgccaccaagatctttctcaacggctcatggatcggcgtccaccacgatcccaagtct540:0183]ctcgtgagagatgtccagcagctacgccgaaccaatcagatccctgcagaagtatcattg600:0184]gttcgcgacatccgtgatcgcgagttcaagatcttctcggacgctggccgagtcatgcga660:0185]cccttgtttgtcgtcg^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