專利名稱：一種緩病類芽孢桿菌及其種衣劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌，尤其涉及一種緩病類芽孢桿菌(Paenibacilluslentimorbus)及其種衣劑。

背景技術(shù)：
水稻白葉枯病(以下簡(jiǎn)稱白葉枯病)和水稻細(xì)菌性條斑病(以下簡(jiǎn)稱細(xì)條病)是目前威脅我國(guó)南方稻區(qū)水稻生產(chǎn)的兩種重要細(xì)菌病害，在南方稻區(qū)與稻瘟病和紋枯病并列水稻四大病害。白葉枯病在我國(guó)大部分地區(qū)均有發(fā)生，一般減產(chǎn)10％～30％，嚴(yán)重可達(dá)50％以上。水稻細(xì)條病亦是水稻一種重要的細(xì)菌性病害。在我國(guó)部分地區(qū)此病發(fā)生嚴(yán)重，常年發(fā)生面積在460萬公頃以上。尤其在我國(guó)南方稻區(qū)的危害已超過白葉枯病，雜交稻受害更重。目前防治這兩種病害主要是使用化學(xué)殺菌劑。
長(zhǎng)期大量使用農(nóng)藥造成自然生態(tài)環(huán)境污染及稻米農(nóng)藥殘留的問題越來越突出，尋求作物病害防治的新途徑一直是人們努力的目標(biāo)。成功的研究表明，拮抗細(xì)菌是一類重要的生物防治制劑，在水稻病害的綜合防治中應(yīng)該發(fā)揮更大的作用。細(xì)菌在生防應(yīng)用中的主要優(yōu)勢(shì)在于1)細(xì)菌的種類和數(shù)量眾多，在植物根際和地上部大量存在；2)細(xì)菌對(duì)病原菌的作用方式較廣，可以通過競(jìng)爭(zhēng)、拮抗和寄生、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等方式對(duì)病原菌產(chǎn)生影響；3)具有驚人的繁殖速度；4)許多細(xì)菌存在于植物根際和地上部，對(duì)植物的生態(tài)比較適宜；5)細(xì)菌大多可以人工培養(yǎng)，便于控制，在實(shí)踐中易于操作；6)有些細(xì)菌不僅能防治病害而且具有促生作用，可以增加作物產(chǎn)量。
種衣劑是由活性組分(微生物、殺蟲劑、殺菌劑等，有的還加入微肥、激素)、成膜劑、分散劑、防凍劑和其他助劑加工制成的，可直接或經(jīng)稀釋后包于種子表面，形成具有一定強(qiáng)度和通透性的保護(hù)層膜的農(nóng)藥制劑。種衣劑和用于浸種或拌種的農(nóng)藥乳劑、粉劑相比具有突出的優(yōu)點(diǎn)，一般常規(guī)拌種藥劑處理種子時(shí)附著性差，脫落率低，既影響藥效又污染環(huán)境，對(duì)人畜也不安全；浸種或悶種僅僅是播種前種子帶菌消毒的植保措施，加之浸種或悶種后只能立即播種，不能貯藏，不符合良種標(biāo)準(zhǔn)化的要求。種衣劑包于種子表面，藥、肥等緩慢釋放，對(duì)種子形成一個(gè)保護(hù)屏障，吸水后膨脹，不馬上被溶解，在種子發(fā)芽、苗成長(zhǎng)過程中，有效成分逐漸被根系吸收，傳導(dǎo)到幼苗植株各部位，對(duì)種子帶菌、土壤病蟲害起到持續(xù)的防治作用，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量。但是現(xiàn)有種衣劑在應(yīng)用中也存在以下缺點(diǎn)成膜劑通透性不佳，影響種子發(fā)芽率；附著性差，導(dǎo)致作用成份極易脫落，與未包衣無異；絕大大多以農(nóng)藥為主要成分，這其中又以呋喃丹、克靈菌等高毒高殘留農(nóng)藥使用最廣，不適應(yīng)農(nóng)藥和種衣劑高效低毒甚至無毒的發(fā)展趨勢(shì)。
生物型種衣劑是根據(jù)生物菌類之間的拮抗原理，篩選有益的拮抗菌，以抵抗有害病菌的侵害和繁殖，而達(dá)到防病目的，完全無污染、無毒害，是將來種子包衣技術(shù)和農(nóng)藥的發(fā)展趨勢(shì)。
中國(guó)專利申請(qǐng)90100470.7公開了短桿菌屬(Brevibacterium sp.)的植物活性菌劑的生產(chǎn)方法，該菌劑由原菌劑和粘合劑組成。
中國(guó)專利申請(qǐng)00109080.1公開了一種微生物(Bacillus subtilis)種衣劑及其生產(chǎn)方法，按重量百分比含有有效微生物培養(yǎng)物15～25％或有效菌含量≥103CFU/mL，保護(hù)劑1～3％，著色劑1.5～2.5％和營(yíng)養(yǎng)劑3～5％，成膜劑40～60％，其余為水。其生產(chǎn)方法為，按重量百分比將前述各成分在常溫下混合研磨均勻而成。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種緩病類芽孢桿菌(Paenibacillus lentimorbus)，該菌株可以防治水稻細(xì)菌性病害，尤其對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病與白葉枯病有突出的抑制能力，并且能夠促進(jìn)植株生長(zhǎng)。
一種緩病類芽孢桿菌(Paenibacillus lentimorbus)ZJUB2006-0，保藏于位于武漢市珞珈山武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期為2009年9月23日，保藏號(hào)為CCTCC NOM 209209。
上述菌株主要形態(tài)及生物學(xué)特征如下 細(xì)胞桿狀，營(yíng)養(yǎng)體大小0.8-0.83μm×1.7-2.2μm，周生鞭毛，孢囊膨大，內(nèi)有橢圓形芽孢；革蘭氏染色陽性；好氣，異養(yǎng)；在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)靜止時(shí)產(chǎn)生皺折菌膜，菌液渾濁，有沉淀物；在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上菌落圓形，乳白色不透明，中間略隆起，皺狀花紋，邊緣齒狀。無可溶性色素；生長(zhǎng)最適溫度30-35℃，生長(zhǎng)范圍15-45℃；生長(zhǎng)最適pH 6.8-7.0，生長(zhǎng)范圍pH4.8-8.5。
本發(fā)明還提供了一種含上述緩病類芽孢桿菌(Paenibacilluslentimorbus)ZJUB2006-0的種衣劑，其原料重量百分比組成為 緩病類芽孢桿菌ZJUB2006-0培養(yǎng)物15％～25％ 成膜劑2.5％～5％ 營(yíng)養(yǎng)劑1％～5％ 色料 0.5％～2.5％ 保護(hù)劑1％～5％ 水余量。
所述的緩病類芽孢桿菌(Paenibacillus lentimorbus)ZJUB2006-0培養(yǎng)物的培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基，其制備過程是將緩病類芽孢桿菌ZJUB2006-0接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)兩天得到的菌懸液，其成品有效菌含量?jī)?yōu)選大于105CFU/mL。
優(yōu)選地，所述的成膜劑為聚乙烯醇和乙酸乙烯酯-乙烯共聚物的混合物，聚乙烯醇與乙酸乙烯酯-乙烯共聚的重量比為2～4∶1。該成膜劑可以在種子表面形成具有膜孔道的不溶于水但透氣、透水性良好的衣膜，從而將各種作用成分網(wǎng)結(jié)在一起，有利于各成分長(zhǎng)效、集中發(fā)揮效力。
所述的色料優(yōu)選為酸性紅或熒光紅，警戒性強(qiáng)且不易褪色。
所述的營(yíng)養(yǎng)劑優(yōu)選為硅酸鈉、硝酸鈣、硫酸鋅和磷酸氫二鉀的混合物，無固定配比，能滿足種子萌發(fā)和后期壯苗培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求即可。
所述的保護(hù)劑優(yōu)選為乙二醇和磷酸三丁酯的混合物，能夠增強(qiáng)種子抗逆性，并能保證所有成分穩(wěn)定共存，不影響有效成分發(fā)揮效力。乙二醇和磷酸三丁酯的重量比優(yōu)選為0.5～2∶1。
本發(fā)明種衣劑對(duì)稻種進(jìn)行包衣后，使得種子周圍土壤中形成一個(gè)有利于種子萌發(fā)、生長(zhǎng)的微環(huán)境，對(duì)改善秧苗素質(zhì)，抑制病菌的侵染與擴(kuò)散，減輕水稻白葉枯病與細(xì)條病的危害具有顯著效果。
本發(fā)明還提供上述種衣劑的使用方法，包括以下步驟 以藥種比為1∶40進(jìn)行包衣，即每1kg稻種需加入種衣劑25g(約25毫升)。種子包衣后攤開晾干至顏色不再變化為止即可播種。
本發(fā)明種衣劑能顯著降低水稻細(xì)菌性病害的發(fā)生率，防效超過現(xiàn)有化學(xué)和生物種衣劑，有效減輕病害危害，促進(jìn)植物生長(zhǎng)；制備簡(jiǎn)單，不需要特殊加工，成本低廉；更重要的是完全無毒害，無污染，生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲(chǔ)存和使用安全、方便，具有極強(qiáng)的應(yīng)用前景。



圖1是本發(fā)明緩病類芽孢桿菌ZJUB2006-0對(duì)白葉枯病菌的拮抗圖； 圖2是本發(fā)明緩病類芽孢桿菌ZJUB2006-0對(duì)條斑病菌的拮抗圖； 圖3是本發(fā)明緩病類芽孢桿菌ZJUB2006-0的FAME脂肪酸圖譜。

具體實(shí)施例方式 菌株分離純化 從浙江省杭州市一塊水稻田里采集0～20cm的表層土壤，裝入無菌聚乙烯塑料袋，封口。稱取10g稻田土樣品，加入到有玻璃珠和90mL無菌水的三角瓶中，在搖床上180轉(zhuǎn)/分振蕩30min后，用無菌水梯度稀釋得到10-2、10-3、10-4、10-5的懸浮液，分別取100μl 10-3、10-4、10-5的懸浮液涂布于KMB平板(蛋白胨20.0g，甘油10.0g，KH2PO4·3H2O 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，瓊脂15g，H2O 1000mL；pH 7.2)上，在28℃下培養(yǎng)3～5天，挑取代表性菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(以下簡(jiǎn)稱NA培養(yǎng)基，含牛肉浸膏1g，蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化鈉5g，蔗糖10g，瓊脂20g，水1000mL；pH 6.8-7.0)平板上純化后保存作為待測(cè)菌。
將水稻白葉枯和細(xì)條病菌分別接種于兩瓶營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基(以下簡(jiǎn)稱NB培養(yǎng)基，含牛肉浸膏1g、蛋白胨5g、酵母膏5g、氯化鈉5g、蔗糖10g、水1000mL；pH 6.8-7.0)中，180r/min培養(yǎng)48h后，制得菌懸液，將滅過菌的NA培養(yǎng)基冷卻到45℃左右時(shí)，倒入上述兩種菌懸液中，NA培養(yǎng)基與菌懸液體積比為5∶1，搖勻后倒平板。4h后將上述分離純化得到的待測(cè)菌接種于上述兩種平板上。
平板在室溫下培養(yǎng)48h，觀察抑菌圈的大小，挑選抑菌圈大于10mm的待測(cè)菌，轉(zhuǎn)接至NA培養(yǎng)基試管斜面上，連續(xù)接種，傳代5次，繼續(xù)采用上述方法，挑取對(duì)白葉枯和細(xì)條病菌有較強(qiáng)拮抗效力的菌株，進(jìn)行田間小區(qū)篩選實(shí)驗(yàn)。在田間小區(qū)篩選實(shí)驗(yàn)中，待水稻長(zhǎng)至1心2葉末期時(shí)，噴霧接種濃度為1×108CFU/mL的待測(cè)菌菌懸液，3d后噴霧接種濃度為1×108CFU/mL的白葉枯和細(xì)條病病原菌菌懸液。噴灑病原菌后14d觀察發(fā)病情況，選擇對(duì)白葉枯和細(xì)條病菌防效最好的菌株。
菌株鑒定 分離得到的菌株主要形態(tài)及生物學(xué)特征如下 細(xì)胞桿狀，營(yíng)養(yǎng)體大小0.8-0.83μm×1.7-2.2μm，周生鞭毛，孢囊膨大，內(nèi)有橢圓形芽孢；革蘭氏染色陽性；好氣，異養(yǎng)；在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)靜止時(shí)產(chǎn)生皺折菌膜，菌液渾濁，有沉淀物；在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上菌落圓形，乳白色不透明，中間略隆起，皺狀花紋，邊緣齒狀；無可溶性色素.生長(zhǎng)最適溫度30-35℃，生長(zhǎng)范圍15-45℃；生長(zhǎng)最適pH 6.8-7.0，生長(zhǎng)范圍pH4.8-8.5。
該菌株經(jīng)Biolog、FAME脂肪酸分析和16S rDNA序列(如SEQ IDNO1所示)比對(duì)，將其鑒定為緩病類芽孢桿菌(Paenibacillus lentimorbus)，命名為緩病類芽孢桿菌(Paenibacillus lentimorbus)ZJUB2006-0。
抑菌活性測(cè)定 將水稻白葉枯和細(xì)條病菌分別接種于兩瓶NB培養(yǎng)基中，180r/min培養(yǎng)48h后，制得菌懸液，將滅過菌的NA培養(yǎng)基冷卻到45℃左右時(shí)，倒入兩種菌懸液中，NA培養(yǎng)基與菌懸液體積比為5∶1，搖勻后倒平板。4h后將上述分離純化得到的緩病類芽孢桿菌ZJUB2006-0接種于上述兩種平板上，平板在28℃培養(yǎng)48h后觀察抑菌圈的大小。
如圖1和圖2所示，緩病類芽孢桿菌ZJUB2006-0對(duì)細(xì)條病菌和白葉枯病菌有極強(qiáng)的抑制能力，抑菌圈分別達(dá)到30.3mm與41.0mm(一般生防菌拮抗病原菌的抑菌圈≥10mm即可稱為有較強(qiáng)抑菌能力)。
種衣劑配制 將緩病類芽孢桿菌ZJUB2006-0接種于NA培養(yǎng)基中，180r/min培養(yǎng)48h，制得緩病類芽孢桿菌ZJUB2006-0培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物的成品有效菌含量大于108CFU/mL。將聚乙烯醇、乙酸乙烯酯-乙烯共聚物(EVA)加入100℃熱水中，劇烈攪拌混合均勻，冷卻后依次加入硅酸鈉、硝酸鈣、硫酸鋅、磷酸氫二鉀、色料、乙二醇、磷酸三丁酯以及上述培養(yǎng)物，補(bǔ)足水分，在常溫下混合研磨均勻，制得種衣劑。
通過上述方法制得3種種衣劑，各組分重量百分比如下表所示，所有組分重量百分比以種衣劑總重量為基準(zhǔn)。
種衣劑對(duì)稻種促生作用的測(cè)定 取實(shí)施例1、2、3的種衣劑，按藥種重量比為1∶40的比例與稻種混合進(jìn)行包衣，包衣后的稻種置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中播種，以清水浸種作為對(duì)照。出苗7d后統(tǒng)計(jì)稻種出苗率，測(cè)量莖和根的長(zhǎng)度，試驗(yàn)重復(fù)3次，并取平均值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示
從上表中可以看出，稻種經(jīng)種衣劑包衣后，發(fā)芽率有很大提高，而且本發(fā)明菌株能改善稻種生活力。
種衣劑的防病效果測(cè)定 取實(shí)施例1、2、3的種衣劑，按藥種重量比為1∶40的比例混合進(jìn)行包衣，晾干后播種。在水稻長(zhǎng)至1心2葉末期時(shí)，飽和噴霧接種已生長(zhǎng)48h、濃度約為1×108CFU/mL的病原菌菌懸液，薄膜覆蓋保濕1d，分別以市售華農(nóng)種衣劑(江蘇華農(nóng)種衣劑有限責(zé)任公司生產(chǎn))、適樂時(shí)種衣劑(先正達(dá)公司生產(chǎn))、強(qiáng)氯精(湖南省海洋生物有限公司生產(chǎn))浸種和清水浸種作為對(duì)照。接種后14d統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，記載病級(jí)。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，結(jié)果如下表所示
注-表示結(jié)果暫缺 結(jié)果顯示，在水稻細(xì)條病菌與白葉枯病菌高濃度的強(qiáng)選擇壓力下，本發(fā)明種衣劑對(duì)細(xì)條病和白葉枯病的防效均好于所有對(duì)照。
SEQUENCE LISTING
<110>浙江大學(xué)
<120>一種緩病類芽孢桿菌及其種衣劑
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1222
<212>DNA
<213>緩病類芽孢桿菌(Paenibacillus lentimorbus)
<400>1
ccatgcggcg tgctatacat gcaagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt 60
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ttaaatgggc ttcaacggtg cccatggaca gaaggggcgg acccaggtta tacaccaatc 1200
gaaggggtct ctctcgagtg gg122權(quán)利要求
1.一種緩病類芽孢桿菌菌株，其特征在于命名為緩病類芽孢桿菌(Paenibacillus lentimorbus)ZJUB2006-0，保藏號(hào)為CCTCC NOM209209。
2.一種含有權(quán)利要求1所述的緩病類芽孢桿菌ZJUB2006-0的種衣劑，其特征在于，原料重量百分比組成為
緩病類芽孢桿菌ZJUB2006-0培養(yǎng)物15％～25％
成膜劑2.5％～5％
營(yíng)養(yǎng)劑1％～5％
色料 0.5％～2.5％
保護(hù)劑1％～5％
水余量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的種衣劑，其特征在于所述的緩病類芽孢桿菌ZJUB2006-0培養(yǎng)物中成品有效菌含量不小于105CFU/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的種衣劑，其特征在于所述的成膜劑為聚乙烯醇和乙酸乙烯酯-乙烯共聚物的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的種衣劑，其特征在于所述的乙烯醇和乙酸乙烯酯-乙烯共聚物重量比為2～4∶1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的種衣劑，其特征在于所述的色料為酸性紅或熒光紅。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的種衣劑，其特征在于所述的營(yíng)養(yǎng)劑為硅酸鈉、硝酸鈣、硫酸鋅和磷酸氫二鉀的混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的種衣劑，其特征在于所述的保護(hù)劑為乙二醇和磷酸三丁酯的混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的種衣劑，其特征在于所述的乙二醇和磷酸三丁酯的重量比為0.5～2∶1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種緩病類芽孢桿菌，其為緩病類芽孢桿菌ZJUB2006-0(Paenibacillus lentimorbus ZJUB2006-0)，菌種保藏編號(hào)為CCTCC M 209209。本發(fā)明公開了由緩病類芽孢桿菌ZJUB2006-0制成的種衣劑，其重量百分比組成為緩病類芽孢桿菌ZJUB2006-0培養(yǎng)物15％-25％、成膜劑2.5％-5％、營(yíng)養(yǎng)劑1％-5％、色料0.5％-2.5％、保護(hù)劑1％-5％、其余為水。本發(fā)明種衣劑能顯著降低水稻細(xì)菌性病害的發(fā)生率，防效超過現(xiàn)有化學(xué)和生物種衣劑，促進(jìn)植物生長(zhǎng)；制備簡(jiǎn)單，不需要特殊加工，成本不高；更重要的是完全無毒害，無污染，生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲(chǔ)存和使用安全、方便，具有極強(qiáng)的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A01N63/02GK101705197SQ200910154899
公開日2010年5月12日 申請(qǐng)日期2009年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月26日
發(fā)明者懷雁, 謝關(guān)林, 余山紅, 李斌 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)