專利名稱：苔蘚植物作為植物外植體消毒劑的用途、及該消毒劑組合物及其制備方法和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組培技術(shù)的消毒，具體涉及將苔蘚植物用于植物外植體消毒劑的新用途，及該消毒劑組合物及其制備方法和使用方法。

背景技術(shù)：
植物組織培養(yǎng)中的污染主要是由外植體帶菌、接種操作污染、培養(yǎng)室污染等原因造成；后兩者可以通過熟練操作過程和提高培養(yǎng)室潔凈度而避免，而外植體帶菌就需要選擇適合的消毒方式，嚴格消毒處理，再經(jīng)無菌操作接種到無菌培養(yǎng)基上。依據(jù)傳統(tǒng)的表面滅菌處理技術(shù)，采來的外植體除去不用的部分之后，還需對其進行以下幾個步驟的處理(1)外植體表面滅菌從室外帶回來的材料，要除去一些不必要的部分，洗去泥土，然后用洗潔劑浸泡、沖洗，必要時可用軟刷刷洗或用脫脂棉球擦洗材料表面，然后剪成適宜的大小，通過表面滅菌可清除許多雜菌。(2)植物材料浸入70％的酒精處理。(3)用消毒劑處理，常用的表面滅菌劑有酒精、升汞、雙氧水以及次氯化物。(4)無菌水漂洗。外植體的徹底消毒是組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素之一。外植體消毒劑的選擇上應該既考慮到有效減少或阻止植物組織培養(yǎng)基的微生物污染，又要兼顧植物組織正常生長或發(fā)育。
中國專利CN1561695A公開了一種植物組培消毒方法，采用次氯酸鈉和氯化汞作為植物材料消毒劑，但是，氯化汞是劇毒物質(zhì)，污染環(huán)境、消毒后難以除去殘余汞對外植體的殺傷作用；次氯酸鹽對組織也有毒害作用。實踐中出現(xiàn)的問題是，消毒時間長了植物材料死亡，消毒時間短了植物材料表面細菌不能殺死，致使植物材料污染死亡。中國專利CN101461329A公開了一種外植體的表面滅菌方法，采用的次氯酸鈉、氯化汞、溴水作為消毒劑，但這種消毒劑對于具有內(nèi)生菌的植物材料消毒效果較差，其蝴蝶蘭組培的污染率多達50％，紅掌組培的污染率更高達65％。中國專利CN101138317A公開了組織內(nèi)帶菌外植體消毒的處理方法，外植體消毒仍然采用常規(guī)的酒精浸泡和次氯酸鈉消毒，在組織培養(yǎng)基中加入羧芐青霉素、硫酸鏈霉素和制菌霉素，防治組培污染，但是它不是針對植物外植體本身消毒，而是針對組培培養(yǎng)基，而且，抗生素會造成植物毒害或改變培養(yǎng)植物的行為。中國專利CN1871889A公開了一種植物內(nèi)生菌脫除方法，在采集植物組織之前對植株進行農(nóng)藥連續(xù)噴施三次后，開始采外植體進行組培，操作不便且對于隨機采集珍貴物種組培不適合，亦難以推廣。
苔蘚植物是一群小型的多細胞高等植物，多適生于陰濕的環(huán)境中，不被細菌、真菌或病毒所感染，具有不易腐爛，不易霉變，不被昆蟲和一些動物所侵害等特點。存放在標本館里的苔蘚植物標本，不像其它高等植物那樣易受寄生微生物(細菌、真菌等)的侵蝕，不需經(jīng)過特別處理就可以長期存放。苔蘚植物作為簡單的陸生植物，形態(tài)學上防御屏障幾乎沒有，為適應其生存環(huán)境，發(fā)展了所謂的“化學屏障”，即能夠合成具有抗微生物活性的次生代謝產(chǎn)物以保護自身，抵抗微生物的侵害。在民間，苔蘚被廣泛用于治療外傷、燒傷、感染、肺結(jié)核、燙傷和肺炎等癥。苔蘚具有抗病原微生物的作用，可以在陰暗、暖濕的環(huán)境生活，免受自然界各種病菌的感染，主要原因就是苔蘚內(nèi)的多種抗菌活性成分，對眾多細菌、真菌、病毒同時具有抑制作用，是少有的天然來源的抗真菌化合物，可謂一種天然的廣譜抗菌物質(zhì)。目前還未見有將苔蘚植物用于植物組培消毒的相關(guān)研究和報道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的是現(xiàn)有的用于植物組培的消毒劑殺菌效果不理想或容易使植物本身受到毒害的技術(shù)問題，而首次將苔蘚植物用作植物外植體消毒的消毒劑，并提供這種消毒劑組合物，該組合物含有苔蘚植物殺菌抑菌活性成分，用于植物外植體消毒，降低植物組培微生物污染，具有安全無毒、殺菌性能好的優(yōu)點，本發(fā)明還提供了這種消毒劑組合物的制備方法和使用方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種用于植物外植體的消毒劑組合物，其特征在于，該組合物包括活性成分、滲透劑、穩(wěn)定劑和助溶劑，所述活性成分為苔蘚植物，其中各組分重量比為 苔蘚植物85-100重量份， 滲透劑2-5重量份， 穩(wěn)定劑5-10重量份， 助溶劑0.5-1重量份。
所述苔蘚植物的重量為苔蘚植物經(jīng)烘干、研磨制得的干粉的重量。
所述苔蘚植物為鞭苔屬(Bazzania)、耳葉苔屬(Frullania)、羽苔屬(Plagiochiala)、光萼苔屬(Porella)、扁萼苔屬(Radula)、蛇苔屬(Conocephalum)、地錢屬(Marchantia)、仙鶴蘚屬(Artichum)、曲尾蘚屬(Dicranum)、提燈蘚屬(Mnium)、金發(fā)蘚屬(Poylrtiehum)或泥炭蘚屬(Sphagnum)植物，所述苔蘚植物為上述一種苔蘚植物的或兩種以上苔蘚植物混合物。所述活性成分為苔蘚植物制成干粉并用95％乙醇提取的苔蘚植物提取液。
所述滲透劑為烷基酚聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚甲醛縮合物、月桂醇醚硫酸鹽或月桂氮卓酮中的一種或兩種以上的混合物。所述穩(wěn)定劑為環(huán)氧化甲基硬脂酸酯、甘油單硬脂酸酯、烷基丁二酸酯磺酸鹽、羥基芐基磷酸酯或改性蓖麻油中的一種或兩種以上的混合物。所述助溶劑為丙二醇、丙酮或環(huán)己酮中的一種或兩種以上的混合物。
本發(fā)明還提供了上述用于植物外植體的消毒劑組合物的制備方法，包括如下步驟 1)清洗、研磨將苔蘚植物用蒸餾水洗凈，于烘箱內(nèi)40℃下烘干，研磨粉碎20-40目顆粒； 2)溶解將苔蘚植物溶于相當于其5-20倍重量的提取液中，提取液為95％乙醇； 3)逆滲、浸提在0.04-0.07Mpa、20-60℃條件下提取上述溶液10-30分鐘； 4)超聲波助溶頻率20kHz的超聲波，震蕩時間5-30分鐘； 5)超濾選用孔徑為0.8μm或1.2μm的超濾膜過濾，在0.04-0.07Mpa壓力下，超濾5-20分鐘，得苔蘚植物提取液； 6)混合按所述比例先后添加滲透劑、助溶劑、穩(wěn)定劑至苔蘚植物提取液，混合均勻，靜置后即為消毒劑組合物成品。
本發(fā)明進一步提供了用于植物外植體的消毒劑組合物的使用方法，按照如下步驟使用 1)將所述消毒劑組合物用無菌水稀釋至濃度為5％-60％的消毒劑溶液，待用； 2)取植物外植體的離體植物器官，經(jīng)流水沖洗去表面塵土，用70％酒精處理10-60秒； 3)取步驟1)中的消毒劑溶液對植物外植體浸泡消毒5-30分鐘，用無菌水沖洗至清，用濾紙吸取多余水分，接種到相應的培養(yǎng)基中即可。
本發(fā)明所能達到的有益效果是 1、本發(fā)明消毒劑組合物專門用于乙醇處理后的植物外植體的消毒，是將苔蘚植物的殺菌抑菌活性成分首次應用在植物外植體消毒上，并按照一定比例混合達到協(xié)同增效作用，并借助調(diào)節(jié)滲透劑，對植物外植體具有的多種微生物有效殺滅及抑制； 2、本發(fā)明組合物來自于天然植物，安全無毒，對環(huán)境和植物組織無害，試驗證明植物外植體消毒劑浸泡后可以大大降低植物組織培養(yǎng)的污染率，植物組織正常生長或發(fā)育，使用效果好； 3、本發(fā)明組合物殺菌抑菌活性成分來源于植物，能與植物外植體組織形成較好的親和關(guān)系，能夠滲透到植物內(nèi)部對植物內(nèi)生菌有較強的殺滅作用，同時對植物材料無傷害； 4、本發(fā)明組合物制備方法簡單、原料易得、價格便宜、便于推廣應用。

具體實施例方式 第一實施例 本發(fā)明第一實施例用于植物外植體的消毒劑組合物，包括如下重量的各組分 其中苔蘚植物的重量為苔蘚植物制成干粉的重量(以下實施例相同)。
該植物外植體消毒劑組合物的制備過程為 1)清洗、研磨將新鮮鞭苔用蒸餾水洗凈，于烘箱內(nèi)40℃下烘干，研磨粉碎成20目顆粒； 2)溶解將85g鞭苔干粉溶于425g95％乙醇溶液中； 3)逆滲、浸提在0.04Mpa、60℃條件下將上述溶液提取10分鐘； 4)超聲波助溶頻率20kHz的超聲波，震蕩時間5分鐘； 5)超濾選用孔徑為0.8μm的超濾膜過濾，在0.04Mpa壓力下，超濾20分鐘，得鞭苔提取液； 6)混合按所述重量先后添加滲透劑、助溶劑、穩(wěn)定劑至鞭苔提取液，混合均勻，靜置后即為消毒劑組合物成品。
該植物外植體消毒劑組合物用于蝴蝶蘭花梗組培消毒的使用方法為 1)將上述消毒劑組合物用無菌水配置成濃度為5％的消毒劑溶液，待用； 2)蝴蝶蘭花梗經(jīng)流水沖洗去表面塵土，70％酒精處理10秒， 3)在步驟1的溶液浸泡蝴蝶蘭花梗，浸泡消毒30分鐘，用無菌水沖洗至清，用濾紙吸取多余水分，接種到MS培養(yǎng)基中即可。
第二實施例 本發(fā)明第二實施例用于植物外植體的消毒劑組合物，包括如下重量的各組分 該植物外植體消毒劑組合物的制備過程為 1)清洗、研磨將新鮮羽苔用蒸餾水洗凈，于烘箱內(nèi)40℃下烘干，研磨粉碎成30目顆粒； 2)溶解將90g羽苔干粉溶于900g95％乙醇溶液中； 3)逆滲、浸提在0.07Mpa、20℃條件下將上述溶液提取12分鐘； 4)超聲波助溶頻率20kHz的超聲波，震蕩時間8分鐘； 5)超濾選用孔徑為0.8μm的超濾膜過濾，在0.07Mpa壓力下，超濾5分鐘，得羽苔提取液； 6)混合按所述重量先后添加滲透劑、助溶劑、穩(wěn)定劑至羽苔提取液，混合均勻，靜置后即為消毒劑組合物成品。
該植物外植體消毒劑組合物用于櫻花莖尖組培消毒的使用方法為 1)將上述消毒劑組合物用無菌水配置成濃度為30％的消毒劑溶液，待用； 2)櫻花莖尖經(jīng)流水沖洗去表面塵土，70％酒精處理10秒， 3)在步驟1的溶液浸泡櫻花莖尖，浸泡消毒20分鐘，用無菌水沖洗至清，用濾紙吸取多余水分，接種到MS培養(yǎng)基中即可。
第三實施例 本發(fā)明第三實施例用于植物外植體的消毒劑組合物，包括如下重量的各組分 該植物外植體消毒劑組合物的制備過程為 1)清洗、研磨將三種新鮮苔蘚用蒸餾水洗凈，于烘箱內(nèi)40℃下烘干，研磨粉碎成40目顆粒； 2)溶解按取等量的三種苔蘚干粉共計93g溶于1400g95％乙醇溶液中； 3)逆滲、浸提在0.05Mpa、30℃條件下將上述溶液提取20分鐘； 4)超聲波助溶頻率20kHz的超聲波，震蕩時間20分鐘； 5)超濾選用孔徑為0.8μm的超濾膜過濾，在0.05Mpa壓力下，超濾15分鐘，得苔蘚提取液； 6)混合按所述重量先后添加滲透劑、助溶劑、穩(wěn)定劑至苔蘚提取液，混合均勻，靜置后即為消毒劑組合物成品。
該植物外植體消毒劑組合物用于水稻種子組培消毒的使用方法為 1)將上述消毒劑組合物用無菌水配置成濃度為40％的消毒劑溶液，待用； 2)水稻種子經(jīng)流水沖洗去表面塵土，70％酒精處理10秒， 3)在步驟1的溶液浸泡水稻種子，浸泡消毒15分鐘，用無菌水沖洗至清，用濾紙吸取多余水分，接種到MS培養(yǎng)基中即可。
第四實施例 本發(fā)明第四實施例用于植物外植體的消毒劑組合物，包括如下重量的各組分 該植物外植體消毒劑組合物的制備過程為 1)清洗、研磨將三種新鮮苔蘚植物用蒸餾水洗凈，于烘箱內(nèi)40℃下烘干，研磨粉碎成25目顆粒； 2)溶解按比例將95g三種苔蘚干粉溶于1900g95％乙醇溶液中； 3)逆滲、浸提在0.06Mpa、35℃條件下將上述溶液提取25分鐘； 4)超聲波助溶頻率20kHz的超聲波，震蕩時間25分鐘； 5)超濾選用孔徑為1.2μm的超濾膜過濾，在0.06Mpa壓力下，超濾12分鐘，得苔蘚提取液； 6)混合按所述重量先后添加滲透劑、助溶劑、穩(wěn)定劑至苔蘚植物提取液，混合均勻，靜置后即為消毒劑組合物成品。
該植物外植體消毒劑組合物用于紅掌吸芽組培消毒的使用方法為 1)將上述消毒劑組合物用無菌水配置成濃度為60％的消毒劑溶液，待用； 2)紅掌吸芽經(jīng)流水沖洗去表面塵土，70％酒精處理10秒， 3)在步驟1的溶液浸泡紅掌吸芽，浸泡消毒5分鐘，用無菌水沖洗至清，用濾紙吸取多余水分，接種到MS培養(yǎng)基中即可。
第五實施例 本發(fā)明第五實施例用于植物外植體的消毒劑組合物，包括如下重量的各組分 該植物外植體消毒劑組合物的制備過程為 1)清洗、研磨將新鮮苔蘚用蒸餾水洗凈，于烘箱內(nèi)40℃下烘干，研磨粉碎成35目顆粒； 2)溶解按所述比例將98g上述苔蘚干粉溶于780g95％乙醇溶液中； 3)逆滲、浸提在0.045Mpa、50℃條件下將上述溶液提取30分鐘； 4)超聲波助溶頻率20kHz的超聲波，震蕩時間30分鐘； 5)超濾選用孔徑為1.2μm的超濾膜過濾，在0.065Mpa壓力下，超濾8分鐘，得苔蘚提取液； 6)混合按所述重量先后添加滲透劑、助溶劑、穩(wěn)定劑至苔蘚植物提取液，混合均勻，靜置后即為消毒劑組合物成品。
該植物外植體消毒劑組合物用于棗樹莖段組培消毒的使用方法為 1)將上述消毒劑組合物用無菌水配置成濃度為15％的消毒劑溶液，待用； 2)棗樹莖段經(jīng)流水沖洗去表面塵土，70％酒精處理10秒， 3)在步驟1的溶液浸泡棗樹莖段，浸泡消毒25分鐘，用無菌水沖洗至清，用濾紙吸取多余水分，接種到MS培養(yǎng)基中即可。
第六實施例 本發(fā)明第六實施例用于植物外植體的消毒劑組合物，包括如下重量的各組分 該植物外植體消毒劑組合物的制備過程為 1)清洗、研磨將新鮮地錢用蒸餾水洗凈，于烘箱內(nèi)40℃下烘干，研磨粉碎成40目顆粒； 2)溶解將100g地錢干粉溶于1200g95％乙醇溶液中； 3)逆滲、浸提在0.06Mpa、25℃條件下將上述溶液提取35分鐘； 4)超聲波助溶頻率20kHz的超聲波，震蕩時間15分鐘； 5)超濾選用孔徑為1.2μm的超濾膜過濾，在0.055Mpa壓力下，超濾14分鐘，得地錢提取液； 6)混合按所述重量先后添加滲透劑、助溶劑、穩(wěn)定劑至地錢提取液，混合均勻，靜置后即為消毒劑組合物成品。
該植物外植體消毒劑組合物用于“六月紅”芋莖尖組培消毒的使用方法為 1)將上述消毒劑組合物用無菌水配置成濃度為25％的消毒劑溶液，待用； 2)“六月紅”芋莖尖經(jīng)流水沖洗去表面塵土，70％酒精處理10秒， 3)在步驟1的溶液浸泡“六月紅”芋莖尖，浸泡消毒20分鐘，用無菌水沖洗至清，用濾紙吸取多余水分，接種到MS培養(yǎng)基中即可。
為了驗證本發(fā)明含苔蘚植物的消毒劑組合物的殺菌效果以及對植物外植體組培的影響，對以上實施例進行了多組實驗，并與本發(fā)明背景技術(shù)中的兩現(xiàn)有技術(shù)配方進行組培實驗的對比結(jié)果如下。
以下兩表為上述實施例中植物外植體的消毒劑組合物對植物外植體消毒、滅菌性能評價對比，從中可以明顯看出本發(fā)明具有極大的優(yōu)勢。
表1含氯化汞配方與本發(fā)明消毒劑組合物平均污染率和存活率對比
注實驗中，含氯化汞配方為參照本發(fā)明背景技術(shù)中CN101461329A中公開的配方。
表2含氯化汞配方與本發(fā)明的消毒劑組合物殺菌最小抑制濃度比較
注實驗中，含氯化汞配方1為參照本發(fā)明背景技術(shù)中CN101461329A中公開的配方，含氯化汞配方2為參照本發(fā)明背景技術(shù)中CN1561695A。
綜上所陳，僅為本發(fā)明之較佳實施例而已，并非用來限定本發(fā)明實施之范圍。即凡依本發(fā)明申請專利范圍所做之均等變化與修飾，皆為本發(fā)明專利范圍所涵蓋。
權(quán)利要求
1、苔蘚植物作為植物外植體消毒劑的用途。
2、如權(quán)利要求1所述的以苔蘚植物用于植物外植體消毒的消毒劑組合物，該組合物包括活性成分、滲透劑、穩(wěn)定劑和助溶劑，所述活性成分為苔蘚植物，其中各組分重量比為
苔蘚植物85-100重量份，
滲透劑2-5重量份，
穩(wěn)定劑5-10重量份，
助溶劑0.5-1重量份。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的消毒劑組合物，其特征在于，所述苔蘚植物為鞭苔屬、耳葉苔屬、羽苔屬、光萼苔屬、扁萼苔屬、蛇苔屬、地錢屬、仙鶴蘚屬、曲尾蘚屬、提燈蘚屬、金發(fā)蘚屬或泥炭蘚屬植物中的一種苔蘚植物或兩種以上苔蘚植物的混合物。
4、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的消毒劑組合物，其特征在于，所述活性成分為苔蘚植物制成干粉并用乙醇提取的苔蘚植物提取液。
5、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的消毒劑組合物，其特征在于，所述滲透劑為烷基酚聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚甲醛縮合物、月桂醇醚硫酸鹽或月桂氮卓酮中的一種或兩種以上的混合物。
6、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的消毒劑組合物，其特征在于，所述穩(wěn)定劑為環(huán)氧化甲基硬脂酸酯、甘油單硬脂酸酯、烷基丁二酸酯磺酸鹽、羥基芐基磷酸酯或改性蓖麻油中的一種或兩種以上的混合物。
7、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的消毒劑組合物，其特征在于，所述助溶劑為丙二醇、丙酮或環(huán)己酮中的一種或兩種以上的混合物。
8、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的消毒劑組合物，其特征在于，所述苔蘚植物的重量為苔蘚植物干粉的重量。
9、根據(jù)權(quán)利要求2所述的消毒劑組合物的制備方法，其特征在于，該制備方法包括如下步驟
1)清洗、研磨將苔蘚植物用蒸餾水洗凈，于烘箱內(nèi)40℃下烘干，研磨粉碎20-40目顆粒；
2)溶解將苔蘚植物溶于相當于其5-20倍重量的提取液中，提取液為95％乙醇；
3)逆滲、浸提在0.04-0.07Mpa、20-60℃條件下提取上述溶液10-30分鐘；
4)超聲波助溶頻率20kHz的超聲波，震蕩時間5-30分鐘；
5)超濾選用孔徑為0.8μm或1.2μm的超濾膜過濾，在0.04-0.07Mpa壓力下，超濾5-20分鐘，得苔蘚植物提取液；
6)混合按所述比例先后添加滲透劑、助溶劑、穩(wěn)定劑至苔蘚植物提取液，混合均勻，靜置后即為消毒劑組合物成品。
10、根據(jù)權(quán)利要求2所述的消毒劑組合物的使用方法，其特征在于，按照如下步驟使用
1)將所述消毒劑組合物用無菌水稀釋至濃度為5％-60％的消毒劑溶液，待用；
2)取植物外植體的離體植物器官，經(jīng)流水沖洗去表面塵土，用70％酒精處理10-60秒；
3)取步驟1)中的消毒劑溶液對植物外植體浸泡消毒5-30分鐘，用無菌水沖洗至清，用濾紙吸取多余水分，接種到相應的培養(yǎng)基中即可。
全文摘要
本發(fā)明公開了苔蘚植物用作植物外植體消毒劑的用途，及該消毒劑組合物及其制備方法及使用方法。該組合物的活性成分為苔蘚植物提取液，還包括滲透劑、穩(wěn)定劑和助溶劑。本發(fā)明首次將苔蘚植物用于植物外植體的消毒，可以大大降低組培的污染率，并且該消毒劑組合物原料由于來源于天然植物，安全無毒，對環(huán)境和植物組織無害，而且，本發(fā)明組合物制備方法簡單、原料易得、價格便宜、便于推廣應用。
文檔編號A01N65/00GK101632392SQ20091016655
公開日2010年1月27日 申請日期2009年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月26日
發(fā)明者晶 孫, 胡蓓蕾, 明 鄒, 偉 鄔, 孔慧梅, 劉佳明 申請人:溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院