專利名稱：一種小分子(＜15kd)發(fā)酵飼用多肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，以豆粕、棉粕和麩皮為原料，利用微生物發(fā)酵 技術(shù)有效去除豆粕和棉粕中的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子，同時(shí)得到富含凝結(jié)芽孢桿菌的優(yōu)質(zhì)發(fā)酵 豆粕，尤其是一種固態(tài)發(fā)酵的制備分子量低于15道爾頓(KD)的飼用植物性多肽的工 藝。
背景技術(shù)：
近年來，進(jìn)口優(yōu)質(zhì)魚粉、乳清粉價(jià)格大幅攀升，給飼料加工企業(yè)的生產(chǎn)帶來空 前的壓力，也給生物發(fā)酵餅粕產(chǎn)品帶來空前的發(fā)展機(jī)遇。開發(fā)進(jìn)口優(yōu)質(zhì)動物蛋白(如魚 粉、血漿蛋白、腸膜蛋白等)替代產(chǎn)品，是實(shí)現(xiàn)飼料工業(yè)與養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，保持 乳仔豬養(yǎng)殖戶贏利能力的重要舉措發(fā)酵餅粕指是通過現(xiàn)代生物發(fā)酵技術(shù)對原料豆粕、棉粕、菜子粕等進(jìn)行發(fā)酵處 理后的產(chǎn)物。發(fā)酵過程中可產(chǎn)生蛋白酶、非淀粉多糖酶等多種酶活，消除抗?fàn)I養(yǎng)因子， 消解大豆抗原蛋白實(shí)現(xiàn)大豆生物脫敏，降解轉(zhuǎn)化有毒游離棉酚，把大分子量的餅粕蛋白 質(zhì)分解為多肽、寡肽、甚至小肽，從而增加水溶性，提高消化率，利于動物消化吸收。 纖維類物質(zhì)分解為糖，部分糖被轉(zhuǎn)化為乳酸，并產(chǎn)生大量有益微生物，使餅粕轉(zhuǎn)化成高 營養(yǎng)價(jià)值的功能性飼料。本發(fā)明技術(shù)主要針對上述的提供豆粕和棉粕營養(yǎng)價(jià)值的關(guān)鍵問題，通過研究芽 孢桿菌固體發(fā)酵的工藝參數(shù)，最終獲得一種富含小分子(< 15KD)發(fā)酵飼用多肽的制備 方法。為解決優(yōu)質(zhì)飼料蛋白資源緊缺特別是為幼齡動物提供優(yōu)良蛋白原料和益生菌提供 了技術(shù)支撐。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過凝結(jié)芽孢桿菌固態(tài)生物發(fā)酵，提供一種小分子 (< 15KD)發(fā)酵飼用多肽的制備方法，促進(jìn)豆粕和棉粕在幼齡動物飼喂中的有效應(yīng)用， 解決優(yōu)質(zhì)蛋白飼料資源的緊缺問題。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明提供的一種小分子(< 15KD)發(fā)酵飼用多肽的制備方法，其步驟如下a.原始出發(fā)菌株凝結(jié)芽孢桿菌劃線在牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基上，30°C， 靜置培養(yǎng)48h進(jìn)行活化。b.從斜面上挑取一環(huán)菌體，接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30°C， 200-250rpm,培養(yǎng)12_16h，作為種子液。在液體擴(kuò)大牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，以 5%的接種量接種種子液，30°C，200-250rpm,培養(yǎng)OD6tltlnm = 4時(shí)，作為發(fā)酵接種液。C.將b中的發(fā)酵接種液以10%的接種量接種到餅粕發(fā)酵基料中(豆粕和棉粕粉碎 過20目，豆粕棉粕麩皮=4:4:2，料水比=1 0.9。)，混合均勻，于30°C發(fā) 酵48h。于60°C烘干，對發(fā)酵前后的餅粕進(jìn)行營養(yǎng)成分分析。
本發(fā)明步驟a中所述的活化菌體的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比含有 1.0%蛋白胨，0.5%氯化鈉，0.3%牛肉膏，2.0%瓊脂。本發(fā)明步驟b中所述的菌體種子液和擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比含有1.0%蛋 白胨，0.5%氯化鈉，0.3%牛肉膏。本發(fā)明步驟a中所述的菌種為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus Coagulans，CGMCC 1.2009) 1 株。本發(fā)明具有以下有益效果與其他化學(xué)和物理方法相比，本發(fā)明所用的微生物發(fā)酵法具有對飼料營養(yǎng)成分 的影響與破壞較小的特點(diǎn)。同時(shí)降低了豆粕和棉粕抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，蛋白溶解度增 加，大分子蛋白質(zhì)被明顯降解，從而大大提高了豆粕和棉粕的營養(yǎng)品質(zhì)。通過專用軟 件(GlyKoBandScanVersion 5.0)針對餅粕發(fā)酵前后的蛋白的磷酸緩沖液抽提液(PBS， pH7.4 KH2PO4 0.24g/L, Na2HPO4 1.44g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L)的三羥甲基甘氨 酸一十二烷基硫酸鈉一聚丙稀酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE)條帶濃度分析表明， 分子量大于45KDa的蛋白質(zhì)在未發(fā)酵餅粕中平均占40%，發(fā)酵餅粕中平均為2% ；分子 量介于15KDa和45KDa之間的蛋白質(zhì)在未發(fā)酵餅粕中平均占55%，發(fā)酵餅粕中平均為 35% ；分子量小于15KDa的蛋白質(zhì)在未發(fā)酵餅粕中平均占5%，發(fā)酵餅粕中提高平均為 63% (表2).胰蛋白酶抑制劑含量由發(fā)酵前1.749mg/g降至發(fā)酵后0.082mg/g;發(fā)酵后水 解度為22.72%;從表2和圖1可以看出發(fā)酵餅粕中主要的抗原蛋白如β-伴球蛋白α 亞基(分子量為57-76KDa)和大豆球蛋白的5個亞基(分子量均大于58KDa)和棉粕中 有毒游離棉酚都得到有效地降解，從而可以降低其抗原性和毒性，益生菌凝結(jié)芽孢桿菌 達(dá)到5.0X 108CFU/g。有益微生物發(fā)酵植物性餅粕(豆粕和棉粕)基料的8大關(guān)鍵指標(biāo) 包括小于15kD的小分子肽質(zhì)量比例>60%，水解度>20%，真蛋白質(zhì)表觀含量提高 2.55%,主要致敏蛋白降解率> 90%，胰蛋白酶抑制劑含量< 0.20mg/g，蛋白酶酶活> 1000U/g,棉酚含量< 80mg/Kg，益生菌凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)量> 1.0 X 108CFU/g，是一 種在現(xiàn)代畜牧業(yè)和飼料工業(yè)中有著重要應(yīng)用前途的高值飼料蛋白。


圖1餅粕在發(fā)酵前后的Tricine-SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳圖譜下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。圖1為餅粕發(fā)酵前后的SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳圖譜，其中泳道1為蛋白質(zhì)分子 量標(biāo)準(zhǔn)，從上至下依次為94.0kDa，66.2kDa, 45.0kDa, 35.0kDa, 28.5kDa, 20.0kDa, 14.4kDa ；泳道2為未發(fā)酵基料樣品；泳道3為發(fā)酵餅粕產(chǎn)品。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供的一種小分子(< 15KD)發(fā)酵飼用植物性多肽的制備方法的具體實(shí) 施方式如下本實(shí)施例所用的菌株為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus Coagulans，CGMCC 1.2009)。a.l0g蛋白胨，5g氯化鈉，3g牛肉膏，定容至1L，加入20g瓊脂，加熱溶解后，
分裝到試管中，蒸汽滅菌121°C，20min,制成活化菌體的牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基。IOg蛋白胨，5g氯化鈉，3g牛肉膏，定容至1L，分裝到三角瓶，蒸汽滅菌121°C， 20min,制成菌體種子液和擴(kuò)大培養(yǎng)液體培養(yǎng)基。b.原始出發(fā)菌株凝結(jié)芽孢桿菌劃線在牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基上，30°C， 靜止培養(yǎng)48h進(jìn)行活化。C.從斜面上挑取一環(huán)菌體，接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30°C， 200-250rpm,培養(yǎng)12_16h，作為種子液。在液體擴(kuò)大牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，以 5%的接種量接種種子液，30°C，200-250rpm,培養(yǎng)OD6tltlnm = 4時(shí)，作為發(fā)酵接種液。d.發(fā)酵接種液以10%的接種量接種到植物性餅粕發(fā)酵基料中(豆粕和棉粕粉碎 過20目，豆粕棉粕麩皮=4:4:2，料水比=1 0.9)，混合均勻，于30°C發(fā)酵 48h。于60°C烘干。e.對發(fā)酵前后的豆粕進(jìn)行營養(yǎng)成分分析。經(jīng)上述實(shí)例中微生物發(fā)酵法制備的植物源性小分子多肽與未發(fā)酵植物性餅粕相 比，營養(yǎng)特性得到明顯改善。豆粕發(fā)酵后，蛋白溶解度增加，大分子蛋白質(zhì)被明顯降 解，通過專用軟件(GlyKo BandScan Version 5.0)針對豆粕、棉粕發(fā)酵前后的蛋白的PBS 抽提液(PBS pH7.4 KH2PO40.24g/L，Na2HPO41.44g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L)的 Tricine-SDS-PAGE電泳條帶(圖1)濃度分析表明，分子量大于45KDa的蛋白質(zhì)在未發(fā) 酵餅粕中平均占40%，發(fā)酵餅粕中平均為2%;分子量介于15KDa和45KDa之間的蛋白 質(zhì)在未發(fā)酵餅粕中平均占55%，發(fā)酵餅粕中平均為35%;分子量小于15KDa的蛋白質(zhì) 在未發(fā)酵餅粕中平均占5%，發(fā)酵餅粕中提高平均為63% (表2).胰蛋白酶抑制劑含量由 發(fā)酵前1.749mg/g降至發(fā)酵后0.082mg/g ；中性蛋白酶酶活> 1331U/g，發(fā)酵后水解度為 22.72%；豆粕中主要的抗原蛋白如β-伴球蛋白α亞基(分子量為57-76KDa)和大豆球 蛋白的5個亞基(分子量均大于58KDa)都得到有效地降解(表2和圖1)，從而可以降低 其抗原性；同時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)基中棉粕所含有毒游離棉酚由330mg/Kg降低到77mg/Kg，降 低76.67% ；益生菌凝結(jié)芽孢桿菌達(dá)到5.0X 108CFU/g。通過凝結(jié)芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵以豆 粕和棉粕為主的飼料蛋白培養(yǎng)基，營養(yǎng)價(jià)值得到明顯改進(jìn)，其效果見表1和表2。有益微 生物發(fā)酵植物性餅粕(豆粕和棉粕)基料所得產(chǎn)品的8大關(guān)鍵指標(biāo)分別是小于15kD的 小分子肽質(zhì)量比例> 60%，水解度>20%，真蛋白質(zhì)表觀含量提高2.55%，主要致敏蛋 白降解率>90%，胰蛋白酶抑制劑含量<0.20mg/g，蛋白酶酶活> 1000U/g，棉酚含量 <80mg/Kg,益生菌凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)量>1.0X108CFU/g，是一種在現(xiàn)代畜牧業(yè)和飼 料工業(yè)中有著重要應(yīng)用前途的高值飼料蛋白。表1培養(yǎng)基發(fā)酵前后成分的比較
權(quán)利要求
1.一種小分子(< 15KD)發(fā)酵飼用多肽的制備方法，其步驟為a.原始出發(fā)菌株凝結(jié)芽孢桿菌劃線在牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基上，30°C，靜置 培養(yǎng)48h進(jìn)行活化。b.從斜面上挑取一環(huán)菌體，接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30°C， 200-250rpm,培養(yǎng)12_16h，作為種子液。在液體擴(kuò)大牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，以 5%的接種量接種種子液，30°C，200-250rpm,培養(yǎng)OD6tltlnm = 4時(shí)，作為發(fā)酵接種液。C.將b中的發(fā)酵接種液以10%的接種量接種到植物性餅粕(豆粕和棉粕)發(fā)酵基料中 (豆粕和棉粕粉碎過20目，豆粕棉粕麩皮=4 4 2，料水比=1 0.9)，混合均 勻，于30°C發(fā)酵48h。于60°C烘干，對發(fā)酵前后的豆粕進(jìn)行營養(yǎng)成分分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子(<15KD)發(fā)酵飼用多肽的制備方法，其步驟a所 述的活化菌體的牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，IOg蛋白胨，5g氯化鈉，3g牛肉膏，定 容至1L，加入20g瓊脂，加熱溶解后，分裝到試管中，蒸汽滅菌121°C，20min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子(<15KD)發(fā)酵飼用多肽的制備方法，其步驟b所述 的菌體種子液和擴(kuò)大培養(yǎng)液體培養(yǎng)基，IOg蛋白胨，5g氯化鈉，3g牛肉膏，定容至1L， 分裝到三角瓶，蒸汽滅菌121°C，20min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子(<15KD)發(fā)酵飼用多肽的制備方法，其步驟a所 述的菌種為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus Coagulans, CGMCC 1.2009) 1株。
5.根據(jù)權(quán)利1，2，3，4制作的發(fā)酵植物性餅粕(豆粕和棉粕)產(chǎn)品的8大關(guān)鍵指標(biāo) 如下小于15kD的小分子肽質(zhì)量比例> 60%，水解度>20%，真蛋白質(zhì)表觀含量提高 2.55%,主要致敏蛋白降解率> 90%，胰蛋白酶抑制劑含量<0.20mg/g，蛋白酶酶活> 1000U/g,棉酚含量< 80mg/Kg，益生菌凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)量> 1.0 X 108CFU/g，是一 種在現(xiàn)代畜牧業(yè)和飼料工業(yè)中有著重要應(yīng)用前途的高值飼料蛋白。
全文摘要
一種小分子(＜15KD)發(fā)酵飼用多肽的制備方法本發(fā)明涉及生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，以豆粕、棉粕和麩皮為原料，利用微生物發(fā)酵技術(shù)有效去除豆粕中的大豆抗?fàn)I養(yǎng)因子和棉粕中的棉酚，同時(shí)得到富含凝結(jié)芽孢桿菌的優(yōu)質(zhì)發(fā)酵植物性餅粕，尤其是一種固態(tài)發(fā)酵的制備分子量低于15KDa的飼用植物性多肽的工藝。原始出發(fā)菌株凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)1株經(jīng)過活化，擴(kuò)大培養(yǎng)后，OD600nm達(dá)到4時(shí)的培養(yǎng)液，作為餅粕發(fā)酵接種液。以10％的接種量接種到植物性餅粕發(fā)酵基料中(豆粕和棉粕粉碎過20目，豆粕∶棉粕∶麩皮＝4∶4∶2，料水比＝1∶0.9)，混合均勻，于30℃發(fā)酵48h。于60℃烘干，對發(fā)酵前后的豆粕進(jìn)行營養(yǎng)成分分析。
文檔編號A23K1/00GK102008006SQ20091016950
公開日2011年4月13日 申請日期2009年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月8日
發(fā)明者楊雅麟, 滕達(dá), 王建華, 田子罡 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所