專利名稱：：強(qiáng)壯類芽胞桿菌g25-1-2及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及微生物固氮，尤其涉及一種強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-l-2及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：濕地生態(tài)系統(tǒng)是一種特殊的生態(tài)系統(tǒng)，平均每年生產(chǎn)蛋白質(zhì)9g/m、是陸地生態(tài)系統(tǒng)的3.5倍，而且還具有能夠調(diào)蓄水源、穩(wěn)定濱海岸線、調(diào)節(jié)氣候、凈化水質(zhì)和固定營養(yǎng)物的功能，保存物種、提供野生動物棲息地等基本生態(tài)效益，為工業(yè)、農(nóng)業(yè)、能源、醫(yī)療業(yè)等提供大量生產(chǎn)原料。珊瑚礁和海草床是熱帶海洋濕地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，較高的生產(chǎn)力水平和重要的生態(tài)學(xué)意義是它們基本的特征，但是同時也具備濕地生態(tài)系統(tǒng)的脆弱性和易變性，特別是由于近年來隨著全球氣候的變化及人類活動影響加劇導(dǎo)致了生物多樣性縮減、生態(tài)功能退化現(xiàn)象。為了保護(hù)和恢復(fù)珊瑚礁和海草床濕地生態(tài)系統(tǒng)，全球各國相繼展開了一系列的行動。研究發(fā)現(xiàn)，生物固氮，即是指具固氮能力的生物將大氣中的氮氣還原成氨的過程，在珊瑚礁和是海草床生態(tài)系統(tǒng)起著非常重要的作用，表現(xiàn)在將空氣中的氮素引入生態(tài)系統(tǒng)，然后通過硝化作用、反硝化作用、氨化作用將固氮生物合成的有機(jī)氮向海草床的生態(tài)系統(tǒng)營養(yǎng)結(jié)構(gòu)進(jìn)行轉(zhuǎn)移的機(jī)制，進(jìn)而推動了整個生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)流動和營養(yǎng)循環(huán)。關(guān)于生物固氮菌肥用于生態(tài)系統(tǒng)的維持以及恢復(fù)方面，紅樹林生態(tài)系統(tǒng)已經(jīng)率先展開了探索，墨西哥和印度等國家的科學(xué)家利用植物生長促生菌(PGPB，plantgrowth-promotingbacteria)對紅樹林進(jìn)行促生取得了一定的成效。在禾本科植物的水稻中也有已有展開應(yīng)用，智利科學(xué)家IrisPereira(2009，Developmentofabioferti1izerbasedonfilamentousnitrogen—fixingcyanobacteriaforricecropsinChile,JournalofAppliedPhycology，21(1)，135-144)通過將固氮藍(lán)細(xì)菌用于稻田的大面積試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的氮肥相比較，施用生物菌肥后，可以將施用的氮肥量減少一半，即(50kgNha—"，但仍可以獲得較高的產(chǎn)量(7.4tha—1)。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)壯類芽胞桿菌(Paenibacillusvalidus)的細(xì)菌，具有PAHs降角牟功會g(DaaneLL，2002，PAH_degradationbyPaenibacillusspp.anddescriptionofPaenibacillusn即hth3lenovo:ransspnov.，3naphthalene—degradingbacteriumfromtherhizosphereofsaltmarshplants,Internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology,2002，52(1)，131-139)和促生功能(UlrichHildebrandt，2006，ThebacteriumPaenibacillusvalidusstimulatesgrowthofthearbuscularmycorrhizalfungusGlomusintraradicesuptotheformationoffertilespores,FEMSMicrobiologyLetters,254(2)，258-267)等，但是尚未發(fā)現(xiàn)具有固氮功能。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有較高固氮活性的強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-l-2。本發(fā)明的另一個目的在于提供上述強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-l-2在海草-珊瑚礁復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)的生物固氮中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個目的在于提供上述強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-l-2在制備海草促生制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實現(xiàn)的本發(fā)明的強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-l-2屬于Paenibacillus屬(類芽胞桿菌屬)，其英文名稱為PaenibacillusvalidusG25_l_2，已于2009年6月4號保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其簡稱為CCTCC，保藏編號為CCTCCN0:M209122。本發(fā)明的強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-l-2是首次報道從海草中分離出的具有nifH基因的Paenibacillus屬細(xì)菌，該強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25_l_2為細(xì)菌直桿狀，革蘭氏染色陽性，以周生鞭毛運動，細(xì)菌大小0.2-0.4X3.1-5.2iim，細(xì)胞單個，也有較少成對。本發(fā)明的強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-l-2在無氮培養(yǎng)基上生長呈灰白色，半透明，光滑，圓形，3(TC下培養(yǎng)，三天后菌落直徑11.5mm，最適生長溫度范圍為2537。C，最高生長溫度為42°C;在膨大的胞囊內(nèi)有橢圓形的芽胞，在末端或者靠近末端的地方，兩邊向外突起或者或者在一側(cè)與菌體形成一定得角度膨大突起，在營養(yǎng)瓊脂上無可溶性色素，嚴(yán)格好氧，接觸酶陰性，氧化酶陰性，V-P陰性，不產(chǎn)生吲哚。本發(fā)明的強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-l-2經(jīng)乙炔還原法(ARA)檢測，發(fā)現(xiàn)該菌可以利用N2作為氮源，具有較高的生物固氮活性，純培養(yǎng)條件下，其固氮活性3060umolC2H2h—^g—1鮮重。運用固氮基因特定的引物PolF/PolR(參考Polyetal.，2001，ComparisonofnifHGenePoolsinSoilsandSoilMicroenvironmentswithContrastingProperties,AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2001，67(5)2255-2262，)禾口細(xì)菌16SrDNA全序列通用引物16SF/16SR(參考Weisenburgetal.，1991，16SribosomalDNAamplificationforphylogeneticstudy.Journalofbacteriology,1991173(2):697-703)對本發(fā)明的強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-1-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增得到目的片段，證明本發(fā)明的菌株具有固氮基因。將上述擴(kuò)增得到的固氮基因nifH序列和16SrDNA序列進(jìn)行測序分析，通過GenBank中的BLAST軟件將固氮基因nifH序列和16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)在數(shù)據(jù)庫中沒有找到完全相似的序列，表明這2條基因序列為首次發(fā)現(xiàn)的新基因序列，向Genebank成功遞交新基因序列得到登錄號為EU884567(16SrDNA序列)和FJ875968(固氮基因nifH序列)用本發(fā)明的強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-l-2處理從三亞灣采來的海草，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)處理后的海菜其植株高度以及莖粗平均值均明顯高于未處理的海草，而且胡蘿卜素含量、類胡蘿卜素含量和可溶性糖含量也均高于未處理的海草，由此說明，本發(fā)明的強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-l-2對于海草的促生效果較好，對于海草床生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)和恢復(fù)具有巨大的潛在意義。本發(fā)明的強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-l-2可用于海草-珊瑚礁復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)的生物固氮，還可用于制備海草促生制劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明從海草中分離篩選到純菌株，并通過對該純菌株進(jìn)行三重篩選無氮培養(yǎng)基菌種生長情況、固氮酶活性測定結(jié)果、nifH基因擴(kuò)增帶有無，從而快速確定菌種是否為固氮菌，最終得到具有高效固氮活性的新菌株一一強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-l-2，強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-l-2具有適應(yīng)能力廣、抗逆性強(qiáng)、以及高效固氮活性的特性，其固氮活性可達(dá)3060um。lC2H2h—'mg—1鮮重；2.本發(fā)明的強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-l-2具有較好的固氮效果，可制備成固氮酶活性高、耐干燥、抗逆性強(qiáng)的固氮菌劑，且可將菌劑干燥制成干粉后便于長期儲存和運輸，適合于制成粉狀或顆粒狀微生物肥料，是固氮菌類更新?lián)Q代的最佳菌種，因此具有廣闊的應(yīng)用前景；3.本發(fā)明的強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-l-2對海草具有顯著的促生作用，可用于海草的保育和生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)，以及對珊瑚礁-海草床復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)的的氮素的循環(huán)和較高生產(chǎn)力水平的維持都有較好的促進(jìn)作用。圖1為實施例1分離純化所得純菌株的PCR電泳結(jié)果圖；其中，1為菌株的基因組DNA，2為PCR擴(kuò)增得到的16SrDNA，3為PCR擴(kuò)增得到的固氮基因nifH，Ml為ADNA/HindIII標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物，M2為MarkerDL2000;圖2為強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-l-2在16SrDNA中的系統(tǒng)發(fā)育樹。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步地描述，但具體實施例并不對本發(fā)明做任何限定。實施例1菌株的分離純化本實施例的采樣地點為中國海南省三亞市三亞灣珊瑚礁保護(hù)區(qū)珊瑚退化后生長的海草(18°15'08.6〃N;109°30'51.1〃E)，主要海草種類為泰來藻(Thalassiahemprichii)，樣品采集后，對每個樣品進(jìn)行分別分類、編號，裝入滅菌的封口聚乙烯袋中，置于冰盒內(nèi)帶回實驗室，_20°〇保存。將上述采集的海草樣品，取根際(即葉鞘以及根狀莖)，用滅菌的剪刀剪成2cm左右的小塊，放入選擇性固氮液體培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基含有NaCl25g、KC10.56g、MgS04_7H204.8g、MgCl2-6H204.0g、K2HP040.Olg、FeS04-7H200.OOlg、Tris0.48g、蛋白胨4.Og、酵母提取物2.Og、甘油2.Oml和蒸餾水1L，終pH為8.2)進(jìn)行加富培養(yǎng)(30°C，180rpm，恒溫48h)，然后將培養(yǎng)液稀釋成一系列梯度的濃度，每個梯度的濃度取出200yL以涂布法接種，每個梯度三個重復(fù)，30°C，48h培養(yǎng)后選擇單一菌落進(jìn)一步純化。用接種針挑取上述單一菌落，經(jīng)涂片染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，如所分離的菌落不純，應(yīng)再次重復(fù)系列濃度稀釋后再次用平板涂布法分離，直至獲得純菌株，然后將純菌株接種至斜面培養(yǎng)基(將常規(guī)配方的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基滅菌后試管傾斜成斜面凝固制備而得)，用于后期檢測固氮酶活性。本實施例分離到的純菌株為細(xì)菌直桿狀，革蘭氏染色陽性，以周生鞭毛運動，細(xì)菌大小0.2-0.4X3.1-5.2iim，細(xì)胞單個，也有較少成對；在無氮培養(yǎng)基上生長呈灰白色，半透明，光滑，圓形，3(TC下培養(yǎng)，三天后菌落直徑1-1.5mm，最適生長溫度范圍為2537°C，最高生長溫度為42°C;在膨大的胞囊內(nèi)有橢圓形的芽胞，在末端或者靠近末端的地方，兩邊向外突起或者或者在一側(cè)與菌體形成一定得角度膨大突起，在營養(yǎng)瓊脂上無可溶性色素，嚴(yán)格好氧，接觸酶陰性，氧化酶陰性，V-P陰性，不產(chǎn)生吲哚。實施例2菌種的固氮酶活力測定本實施例菌種的固氮酶活性采用氣相色譜儀測固氮菌的乙炔還原活性(Acetylene-reducingActivity,ARA)(參考Capone1993，CaponeDG(1993)Determinationofnitrogenaseactivityinaquaticsamplesusingtheacetylenereductionprocedure.AquaticMicrobialEcology,621-631)。取上述40iiL反應(yīng)后氣體在GC-17A型氣相色譜儀(島津)上測定乙烯峰值，標(biāo)準(zhǔn)氣乙烯的濃度為138ppm。氣相色譜儀的工作條件設(shè)置為檢測室溫度10(TC，柱溫6(TC，進(jìn)樣口60，柱長lm，表頭載氣壓力氮氣為0.95kgcm—2，氫氣為0.8kgcm—2，空氣為0.6kg*cm—2。乙炔還原活性計算方法為ARA(nmolCHH—1Culture—1)=VstXCstXAsaXVtu/Vsa/Ast/H/22.4其中，Vst是注入標(biāo)準(zhǔn)氣的體積(mL)，Cst是標(biāo)準(zhǔn)氣的濃度，Vtu是所用試管體積(mL)，Asa是樣品乙烯峰的面積(cm)，Vsa是樣品注入體積(mL)，Ast是標(biāo)準(zhǔn)氣峰面積(cm)，H是培養(yǎng)時間。本實施例分實驗組和空白對照組。實驗組實施例1分離純化得到純菌株，并且保存在斜面培養(yǎng)基上，將該純菌株接種于10mlL選擇性液體無氮液體改良培養(yǎng)基內(nèi)，于3(TC搖床振蕩培養(yǎng)72h，取lmL于滅菌的5mL小瓶中，蓋上橡皮塞，瓶蓋邊緣以石蠟封口，用注射器從容器中抽走5%空氣，然后加入相同體積的乙炔氣體?？瞻讓φ战M對照容器中不加入乙炔氣體。所有樣品于3(TC反應(yīng)12h，用SQ-204氣相色譜檢測乙烯的生成量。檢測結(jié)果表明實施例1分離純化得到的純菌株可以利用N2作為氮源，且具有較高的生物固氮活性，純培養(yǎng)條件下平均固氮活性為3060umolC2H2h—^g—1鮮重。本實施例的選擇性液體無氮液體改良培養(yǎng)基，其配方為NaCl25g，KC10.56g，MgS04-7H204.8g，MgCl2-6H204.0g，K2HP040.01g，F(xiàn)eS047H200.001g，Tris0.48g，蛋白胨4.0g，2.0g酵母提取物2.0g，甘油2.0mL，蒸餾水1L，終ffl為8.2;固體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂；液體培養(yǎng)基采用0.22um抽濾法滅菌，固體培養(yǎng)基采用高溫高壓滅菌。實施例3菌株的序列鑒定模板制備選擇實施例1分離純化得到的純菌株進(jìn)行DNA提取和純化，所述DNA的提取與純化，其操作方法參考東秀珠《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》P4。9，提取純化得到的DNA極為本實施例后續(xù)PCR擴(kuò)增所用模板。1、nifH基因的擴(kuò)增采用固氮細(xì)菌的nifH基因通用引物PolF/PolR(參考Polyetal.，2Q01)進(jìn)行PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系總體系為25uL，1XPCRBuffer,200umolL—MNTPs，2.0,1L—1的Mg2+，lumolL-1的引物，4ug的BSA和2.0U的TaqDNA聚合酶，模板lul。PCR擴(kuò)增條件94t:預(yù)變性5min，94t:變性30s，退火溫度55。C復(fù)性30s，72。C延伸30s，進(jìn)行30個循環(huán)后72。C延伸10min。取5iiL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電壓為IOOV，瓊脂糖凝膠為1%，EB泡膠，用凝膠成像系統(tǒng)觀察泳結(jié)果并拍照，電泳圖如圖1所示，剩余的PCR產(chǎn)物直接交與Invitrogen生物技術(shù)有限公司用ABIPrism3730XLDNA分析系統(tǒng)測序。得到的nifH序列直接遞交Genbank數(shù)據(jù)庫，序列號為FJ875968。2、16SrDNA全序列的擴(kuò)增采用細(xì)菌16SrDNA全序列通用引物16SF/16SR(Weisenburgetal.，1991，16SribosomalDNAamplificationforphylogeneticstudy.，Journalofbacteriology,1991173(2):697-703)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如表1所示。表1PCR反應(yīng)體系模板1uL上、下游引物(ImM)各l"IOXPCR緩沖液LMgCl2(25mM)4uLdNTP混合液(各lOmM)1uL牛血清白蛋白(5mgmL—01uLEx-Taq酶(5UuL—00.4uL無菌水34uL總計50uLPCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95。C5min;變性95。C30s，退火55。C30s，延伸72。Clmin，共30個循環(huán)；后延伸72°C10min。反應(yīng)完畢后，取2iUPCR反應(yīng)產(chǎn)物用0.8X的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結(jié)果如圖1所示，其余PCR產(chǎn)物直接交與Invitrogen生物技術(shù)有限公司用ABIPrism3730XLDNA分析系統(tǒng)測序，得到的16SrDNA序列直接遞交Genbank數(shù)據(jù)庫，序列號為EU884567。圖1中，l為實施例1分離純化所得菌株的基因組DNA，2為PCR擴(kuò)增得到的16SrDNA，3為PCR擴(kuò)增得到的固氮基因nifH，Ml為ADNA/HindIII標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物(Marker)，M2為DL2000(Marker)。將上述測序分析得到的固氮基因序列nifH(Genbank登錄號為FJ875968)和16SrDNA序列(Genbank登錄號為EU884567)，通過GenBank中的BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，在數(shù)據(jù)庫中沒有找到完全相似的序列，表明這2條基因序列為首次發(fā)現(xiàn)的新基因序列。由實施例2和3的分析可以看出，實施例1分離純化得到一棵新的菌株，該菌株屬于Paenibacillus屬(類芽胞桿菌屬)，其中文名字為強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25_l_2，英文名稱為PaenibacillusvalidusG25_l_2，已于2009年6月4號保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其簡稱為CCTCC，保藏編號為CCTCCNO:M209122。在GenBank數(shù)據(jù)庫中選取了部分與測定的16SrDNA序列相似性較高的代表性基因序列，通過ClustalW軟件和Mega軟件以Neibor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(如圖2所示)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出與強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-l-2的16SrDNA序列具有較近親緣關(guān)系的序列均來自強(qiáng)壯類芽胞桿菌，并且與已知菌株P(guān)aenibacillusvalidusPR-P9(AF353697)和Paenibacillusvalidus(AB073203)的16SrDNA序列具有99%的相似性，表明其確定為強(qiáng)壯類芽胞桿菌，但是其具有較高的固氮活性以及固氮基因nifH存在有表明了其與一般的強(qiáng)壯類芽胞桿菌具有不同之處，如表2所示的生理生化指標(biāo)也證實了這一點。表2生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>不做任何處理；兩組均置于室外同樣的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)60天后，對實驗組和對照組分別進(jìn)行各項指標(biāo)測定(即植株高度，莖粗、葉綠素含量、類胡蘿卜素、可溶性糖以及可溶性蛋白等)，觀察該菌是否對海草的生長具有促生作用，各項指標(biāo)的測定結(jié)果如表3所示。表3強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-l-2接種60天后對于海草生長的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>上述表3中，所有數(shù)值均為10組平行樣平均值。如表3所示，通過實驗組和對照組的對比可以發(fā)現(xiàn)，實驗組的植株高度以及莖粗平均值明顯高于對照組，胡蘿卜素含量和類胡蘿卜素含量也分別比對照組高出46.8%和103%，可溶性糖含量是對照組的1.49倍，而可溶性蛋白與對照組沒有顯著的差異。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-l-2對于海草的促生效果較好，對于海草床生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)和恢復(fù)具有巨大的潛在意義。權(quán)利要求一種強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-1-2，已于2009年6月4號保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其簡稱為CCTCC，保藏編號為CCTCCNOM209122。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-l-2，其特征在于該強(qiáng)壯類芽孢桿菌G25-l-2在無氮培養(yǎng)基上的生長溫度為2537°C。3.權(quán)利要求l所述的強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-l-2在海草-珊瑚礁復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)的生物固氮中的應(yīng)用。4.權(quán)利要求1所述的強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-l-2在制備海草-珊瑚礁復(fù)促生制劑中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開一種強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-1-2及其應(yīng)用，該菌已于2009年6月4號保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其簡稱為CCTCC，保藏編號為CCTCCNOM209122，該菌株是從海草生態(tài)系統(tǒng)中分離篩選得到的具有高效固氮活性的純菌株。用本發(fā)明的強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-1-2處理海草，其植株高度、莖粗平均值、胡蘿卜素含量、類胡蘿卜素含量以及可溶性糖含量均高于試驗對照組，表明該菌對海草具有較好的促生效果。本發(fā)明的強(qiáng)壯類芽胞桿菌G25-1-2可用于海草的保育和整個海草生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)，以及對珊瑚礁-海草床復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)的氮素的循環(huán)和較高生產(chǎn)力水平的維持都有較好的促進(jìn)作用。文檔編號A01N63/02GK101735966SQ20091019261公開日2010年6月16日申請日期2009年9月25日優(yōu)先權(quán)日2009年9月25日發(fā)明者凌娟,張偲,張燕英,李麗璇,王友紹,董俊德申請人:中國科學(xué)院南海海洋研究所