專利名稱：石斑魚腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因及其成熟肽的表達系統(tǒng)、生產(chǎn)方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種石斑魚腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因及其 成熟肽的表達系統(tǒng)、生產(chǎn)方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase activatingpolypeptide,簡稱PACAP)，是下丘腦分泌的38個氨基酸的肽類物質(zhì)。自1989 年被發(fā)現(xiàn)以來，隨著對其越來越深入的研究，表明PACAP作為一個神經(jīng)肽類激素，對中樞神 經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)都有著重要的調(diào)控作用。由于其廣泛的生物活性和生理活性所以對 脊椎動物的生長、發(fā)育、繁殖都有重要作用。
石斑魚是海洋珊瑚礁魚類，屬魚旨科(Serranidae)石斑魚屬(Epin印helus))，有 30多種，石斑魚是一種名貴的海水魚類，具有極高的經(jīng)濟價值。石斑魚的苗種培育是養(yǎng)殖生 產(chǎn)持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵，但目前在石斑魚人工養(yǎng)殖中還沒有一種能有效促進其苗種生長的餌料 添加劑，因此，迫切需要提供一種可以有效促進石斑魚苗種生長的餌料添加劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種經(jīng)人工改造的，有利于在酵母 中高效表達的重組石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因；本發(fā)明另一目的在于提供含有上述酵母表達的重組石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激 活多肽基因的表達載體；本發(fā)明另一目的是提供上述表達載體轉(zhuǎn)化的重組工程菌株；本發(fā)明另一目的是提供上述重組石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽的成熟肽的 生產(chǎn)方法；本發(fā)明還有一個目的是提供上述石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽的成熟肽在 制備海水魚類使用的生長和繁殖調(diào)控劑中的應(yīng)用。本發(fā)明上述目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的本發(fā)明酵母表達的重組石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因，如SEQ IDNO 1 所示，該基因序列是通過引物SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5經(jīng)PCR擴增得到的。本發(fā)明構(gòu)建了含有石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽的成熟肽基因序列的表達 載體，該載體的構(gòu)建方法如下將通過引物搭橋PCR方法合成的斜帶石斑魚垂體腺苷酸 環(huán)化酶激活多肽基因經(jīng)酶切和分離純化后，接入到已有的相應(yīng)載體的相應(yīng)酶切位點(即 ECORI和Ν0ΤΙ)之間，即構(gòu)建成所需的含有斜帶石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因的 表達載體。其中，上述表達載體優(yōu)選畢赤酵母表達載體pPICZ α Α,將斜帶石斑魚垂體腺苷酸 環(huán)化酶激活多肽基因經(jīng)酶切和分離純化后，接入到畢赤酵母表達載體PPICZ α A中，得到含有斜帶石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因序列的表達載體pPICZ α A-PACAP。通過上述含有石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因序列的表達載體構(gòu)建了能 高效表達石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽的成熟肽的重組畢赤酵母工程菌株。其中，上述重組畢赤酵母工程菌株優(yōu)選含有斜帶石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因序列的表達載體PPICZ α A-PACAP轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33而得到的菌株 pPICZa A-PACAP-X-33。利用上述重組畢赤酵母工程菌株生產(chǎn)斜帶石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽的 成熟肽的方法，包括如下步驟(1)菌種的培養(yǎng)發(fā)酵將菌種接種在含有zeocin的BMGY液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(2)菌種的誘導(dǎo)表達將菌液沉淀去上清，收集的菌體重懸于BMGY液體培養(yǎng)基中 培養(yǎng)，加入甲醇進行誘導(dǎo)后收集上清，得到表達產(chǎn)物；(3)將表達產(chǎn)物進行分離純化，得到重組石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽的成 熟肽。上述方法優(yōu)選為如下步驟(1)菌種的培養(yǎng)發(fā)酵將菌種接種在含有zeocin的BMGY液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng) 過夜；(2)菌種的誘導(dǎo)表達將菌液沉淀去上清，收集的菌體重懸于BMGY液體培養(yǎng)基中， 30°C培養(yǎng)，每隔24小時加入0. 5%的甲醇進行誘導(dǎo)，36小時后收集上清，得到表達產(chǎn)物；(3)將表達產(chǎn)物進行分離純化，得到重組石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽的成 熟肽。上述重組石斑魚腺苷酸環(huán)化酶激活多肽的成熟肽可以直接用于制備適合海水魚 尤其是石斑魚屬使用的生長和繁殖調(diào)控劑，也可以通過適當?shù)馁x形劑、保護劑按一定比例 形成組合物來應(yīng)用。本發(fā)明提供的石斑魚腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因通過與適當?shù)妮d體連接后可在 相應(yīng)的微生物菌株中高效表達，分離純化后即可得高純度的重組石斑魚腺苷酸環(huán)化酶激活 多肽的成熟肽，而且具有表達水平高，容易純化的優(yōu)點。通過本發(fā)明，可以方便地大量生產(chǎn) 重組石斑魚腺苷酸環(huán)化酶激活多肽的成熟肽，成本降低，這種來源穩(wěn)定、成本便宜的重組石 斑魚腺苷酸環(huán)化酶激活多肽的成熟肽可進一步應(yīng)用于制備適合海水魚類尤其是石斑魚屬 使用的生長與繁殖調(diào)控劑。


圖1是為斜帶石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因設(shè)計的兩段引物及PCR擴增 產(chǎn)物的凝膠電泳分析圖；圖2為重組表達載體pPICZ a A-PACAP的構(gòu)建過程示意圖；圖3為是質(zhì)粒pPICZ a A-PACAP的PCR鑒定和酶切分析，其中M為分子量標準；1、 2為PCR鑒定；NC為陰性對照；3、4為pPICZ a A/ECOR I+NOTI酶切鑒定；圖4為重組畢赤酵母的PCR鑒定。其中M為分子量標準；NC為陰性對照；廣9為不 同酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定；圖5為重組石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因表達產(chǎn)物的SDS-PAGE凝膠電泳圖譜，其中M是蛋白分子量，Γ8是SDS-PAGE甲醇誘導(dǎo)的pPICZ α A-PACAP-X-33,NC是陰 性對照 pPICZ α Α-Χ-33 ；圖6為重組石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因表達產(chǎn)物的Western blot圖 譜，其中NC是陰性對照，1、2和3是甲醇誘導(dǎo)的pPICZ α A-PACAP_X_33 ；圖7為投喂的石斑魚的GHRH(生長激素釋放激素)做的定量PCR分析的柱狀圖， 其中l(wèi)ug/ul的表達量具有顯著差異；圖8為對投喂的石斑魚的SS (生長激素抑制激素)做的定量PCR分析的柱狀圖， 其中2ug/ul的表達量具有顯著差異；圖9為對投喂的石斑魚的GH(生長激素)做的定量PCR分析的柱狀圖，其中Iug/ ul的表達量具有顯著差異。
具體實施方式
以下結(jié)合實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何限定。實施例1酵母表達的重組石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因上游引物和下 游引物的設(shè)計由于斜帶石斑魚的垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽的成熟肽的片段長度只有114bp， 故通過一次PCR就可以完成對原序列的基因突變。因此，根據(jù)已知的斜帶石斑魚垂體腺苷 酸環(huán)化酶激活多肽基因(如SEQ ID N0:6所示)，結(jié)合和酵母密碼子偏好性設(shè)計兩端75bp 左右的引物，經(jīng)PCR擴增垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因的成熟肽。上游引物序列如SEQ ID NO 4所示，下游引物序列如SEQ IDNO 5所示。實施例2重組石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因的人工合成用上游引物和下游引物搭橋，普通的PCR反應(yīng)就可以擴出目的基因，PCR反應(yīng)體系 如下IOXbufferIOuldNTP(10mmol/L)8ul上游引物IOOpmol下游引物IOOpmol聚合酶(5u/ul)0. 2ulddH20加至 IOOul。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性3min，95°C變性15s，從56°C退火15s，72°C延伸20s，最 后72°C延伸2min，擴增35個循環(huán)，得到序列如SEQ ID N0:1所示。通過SEQ ID N0:1和 SEQ ID NO :6對比可以看出，核苷酸序列有了很大的改變，但是氨基酸序列完全一樣，如SEQ ID NO 3 所示。實施例3含石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因的畢赤酵母表達載體 pPICZ α A-PACAP 的構(gòu)建質(zhì)粒pPICZ α A經(jīng)限制酶EcoR I和NOT I雙酶切后，酶切產(chǎn)物用Ε. Ζ. N. A. Gel Extraction Kit回收后分離純化3. 6kb的片段。接著再將實施例1的PCR產(chǎn)物用ECOR I和 NOT I進行雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳(圖1)，酶切產(chǎn)物用Ε. Ζ. N. A. Gel Extraction Kit回收，分離純化約120bp的斜帶石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因片段。將這兩段回收產(chǎn)物用MBI T4連接酶22°C連接16小時后用標準氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌Diitb 中，篩選具zeocin抗性的轉(zhuǎn)化子，以標準方法提取質(zhì)粒，用限制酶ECOR I及NOT I雙酶切 重組質(zhì)粒，得到120bp和3. 6kb的兩個片段，大小分別與斜帶石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活 多肽基因片段和表達載體PPICZ α A大小相同，證明斜帶石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多 肽基因已克隆入表達載體PPICZ α A中，重組質(zhì)粒命名為pPICZ α A-PACAP0質(zhì)粒構(gòu)建圖和酶 切分析圖分別見圖2及圖3。實施例3高效表達重組石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽的成熟肽的畢赤酵母 菌重組株pPICZ α A-PACAP-X-33的構(gòu)建和鑒定Sacl線性化酶切質(zhì)粒pPICZ α A-PACAP，濃縮，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母X_33，在YPD平板 中(含lOOug/ml的zeocin抗性)，PCR檢測目的基因是否插入，檢測到插入片段后，在不同 的zeocin抗生素上進行高拷貝篩選(圖4)。實施例4利用畢赤酵母菌重組株pPICZ α A_PACAP_X_33生產(chǎn)重組石斑魚垂體腺苷 酸環(huán)化酶激活多肽的成熟肽
挑取畢赤酵母菌重組株pPICZ α A-PACAP-X-33單菌落接種在含有100ug/ml zeocin的BMGY液體培養(yǎng)基中，30°C，250rpm培養(yǎng)過夜至OD 600為2 6，收集菌體，去上清， 將菌體重懸于BMMY液體培養(yǎng)基中，24小時后添加甲醇，使其終濃度為0. 5%，于30°C誘導(dǎo)培 養(yǎng)36小時后收集上清。合成的重組石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽的成熟肽在畢赤酵 母工程菌pPICZO A-PACAP-X-33中已獲得高效表達。取少量細胞加2X電泳上樣緩沖液，煮沸5分鐘后跑SDS-PAGE凝膠電泳。結(jié)果見 圖5，顯示經(jīng)誘導(dǎo)的pPICZ α A-PACAP-X-33在約7kd的位置上出現(xiàn)一條新的蛋白帶且與預(yù)期 表達融合蛋白大小相符合，陰性對照PPICZ α Α-Χ-33不出現(xiàn)此帶，證明重組石斑魚垂體腺 苷酸環(huán)化酶激活多肽的成熟肽已在pPICZ α A-PACAP-X-33中誘導(dǎo)表達。將重組石斑魚pPICZ α A-PACAP-X-33采用免疫印跡(Western blot)方法進行免 疫活性鑒定。一抗為N0VAGEN公司提供的小鼠His標簽單克隆抗體，二抗為博士德生物有 限公司提供的辣根過氧化物酶標羊抗小鼠IgG。結(jié)果顯示小鼠His標簽單克隆抗體能識別 我們用畢赤酵母表達的融合PACAP蛋白，而且可以看到不管是SDS-PAGE膠還是Western blot有些克隆的表達蛋白的過程中有不同程度的磷酸化或糖基化，因而蛋白不是單一的一 條帶，證明得到的蛋白是重組斜帶石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽(圖6)。實施例5石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽的成熟肽對石斑魚苗魚苗的體重、攝 食量的影響以及相關(guān)調(diào)控基因表達量變化實驗包括(1)餌料的制作基礎(chǔ)餌料由中山大學(xué)水生經(jīng)濟動物研究所提供，重組 蛋白在純化后稀釋成不同濃度后用噴壺均勻噴灑在基礎(chǔ)餌料上面，室溫自然風(fēng)干后冷凍保 存。制成的三種餌料中重組PACAP的濃度分別約為0. 5ug/g、lug/g和2ug/g。對照組不噴 灑任何試劑，直接投喂飼料。(2)實驗魚的分組和馴養(yǎng)實驗魚按每組16 17尾分組，每個濃度梯度分三個平行 組每天于8:30和16:00用基礎(chǔ)餌料投喂兩次，喂飽為止.馴養(yǎng)時間為疒10天，直到穩(wěn)定攝 食為止。(3)投喂實驗事先測好所要投喂的石斑魚的體重體長，用不同的飼料分別對實 驗魚進行投喂，投喂時間和方法和馴養(yǎng)時一致，投喂時間為期兩個月。每天檢測攝食量，水溫。每一周測量實驗魚的體重這些表觀特征。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析見表1。(4)實驗測量與取樣最后一次投喂的次日早上8 00取樣，然后測量體長，體重，然 后用濕潤的毛巾將魚包住，迅速切開魚的顱骨和腹腔取出垂體、下丘腦、全腦、垂體、胃、腸、 肝臟和肌肉裝入DEPC水處理的離心管中，液氮速凍。所有樣品液氮速凍保存帶回實驗室， 存放于-80°C低溫冰箱備用。分子試驗所用各種試劑、消耗品和容器均用DEPC水處理，解剖 器具和玻璃器皿經(jīng)180°C烘烤5小時，以滅活RNA酶。記錄每個實驗組飼料的投喂量。(5)將取到的樣品提RNA(invitrogen)，進行cDNA反轉(zhuǎn)錄(Τ0Υ0Β0的試劑盒)，對 要檢測的目的基因進行定量PCR檢測(Τ0Υ0Β0的試劑盒)。實驗結(jié)果如圖疒9。表1餌料對石斑魚的體重及存活率的影響
對照組0.5ug/glug/g2ug/g 石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因及其成熟肽的表達系統(tǒng)、生產(chǎn)方法與應(yīng)用 SEQUENCE LISTING<110>中山大學(xué)<120>石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因及其成熟肽的表達系統(tǒng)、生產(chǎn)方法 與應(yīng)用<130><160>6<170>PatentIn version 3. 2<210>1<211>114<212>DNA<213>人工序列<400>1cactctgacg gtatcttcac cgactcttac tctcgctacc gtaagcaaat ggctgtccaa 60aagtacctgg ctgctgtcct gggtcgtcgg taccgtcaac gtgtccgtaa caag114<210>2<211>114<212>DNA<213>人工序列<220> <221>CDS<222>(1). . (114)<400>2cac tct gac ggt ate ttc acc gac tct tac tct cgc tac cgt aag caa48His Ser Asp Gly lie Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln151015atg get gtc caa aag tac ctg get get gtc ctg ggt cgt egg tac cgt96Met Ala Val Gln Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Arg Arg Tyr Arg202530caa cgtgtccgt a a c aag 114Gln Arg Val Arg Asn Lys35<210>3<211>38<212>PRT<213>人工序列<400>3His Ser Asp Gly lie Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln151015Met Ala Val Gln Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Arg Arg Tyr Arg202530Gln Arg Val Arg Asn Lys35<210>4<211>75<212>DNA<213>人工序列<400>4cgggaattcc actctgacgg tatcttcacc gactcttact ctcgctaccg taagcaaatg 60gc t g t c c a a aagtac 75
<210>5<211>74石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因及其成熟肽的表達系統(tǒng)、生產(chǎn)方法與應(yīng)用<212>DNA<213>人工序列<400>5gacgcggccg ccttgttacg gacacgttga cggtaccgac gacccaggac agcagccagg 60t a c t t t t g g acagc 74<210>6<211>114<212>DNA<213>人工序列<400>6cattcagatg ggatcttcac cgacagctac agtcgctata gaaagcagat ggccgtgcag 60
aaatacctgg cagcggttct gggaagaagg tacagacaga gagttaggaa caaa 11權(quán)利要求
一種酵母表達的重組石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因，其特征在于如SEQ ID NO1所示，該基因序列是通過上游引物SEQ ID NO4和下游引物SEQ ID NO5經(jīng)PCR擴增得到的。
2.一種表達載體，其特征在于該表達載體含有權(quán)利要求1所述的酵母表達的重組石斑 魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達載體，其特征在于所述酵母表達的重組石斑魚垂體腺苷 酸環(huán)化酶激活多肽基因位于載體的ECORI和NOTI之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達載體，其特征在于該表達載體為畢赤酵母表達載體 pPICZα A-PACAP0
5.一種重組工程菌株，其特征在于該菌株是將權(quán)利要求2所述的表達載體轉(zhuǎn)入畢赤酵 母中，形成重組畢赤酵母工程菌株。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組工程菌株，其特征在于該菌株是將權(quán)利要求3所 述的表達載體pPICZa A-PACAP轉(zhuǎn)入畢赤酵母Χ-33中，形成的重組畢赤酵母菌株 pPICZa A-PACAP-X-33。
7.利用權(quán)利要求5所述的重組畢赤酵母菌株生產(chǎn)石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽 的成熟肽的方法，其特征在于包括如下步驟(1)菌種的培養(yǎng)發(fā)酵將菌種接種在含有zeocin的BMGY液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(2)菌種的誘導(dǎo)表達將菌液沉淀去上清，收集的菌體重懸于BMGY液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 加入甲醇進行誘導(dǎo)后收集上清，得到表達產(chǎn)物；(3)將表達產(chǎn)物進行分離純化，得到重組石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽的成熟肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用重組畢赤酵母菌株生產(chǎn)石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活 多肽的成熟肽的方法，其特征在于包括如下步驟(1)菌種的培養(yǎng)發(fā)酵將菌種接種在含有zeocin的BMGY液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)過夜；(2)菌種的誘導(dǎo)表達將菌液沉淀去上清，收集的菌體重懸于BMGY液體培養(yǎng)基中，30°C 培養(yǎng)，每隔24小時加入0. 5%的甲醇進行誘導(dǎo)，36小時后收集上清，得到表達產(chǎn)物；(3)將表達產(chǎn)物進行分離純化，得到重組石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽的成熟肽。
9.權(quán)利要求1所述的石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽的成熟肽在制備石斑魚類使 用的生長與繁殖調(diào)控制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酵母表達的重組石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因，其序列如SEQ ID NO1所示，該基因序列是通過引物SEQ ID NO4和SEQID NO5經(jīng)PCR擴增得到的。本發(fā)明還構(gòu)建了含有該酵母表達的重組石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因的表達載體和重組畢赤酵母表達菌株。本發(fā)明還公開了利用重組畢赤酵母表達菌株生產(chǎn)斜帶石斑魚垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽的成熟肽序列的方法及其應(yīng)用。利用本發(fā)明可以獲得來源穩(wěn)定、成本便宜的石斑魚腺苷酸環(huán)化酶激活多肽重組蛋白，并進一步制備適合海水魚類使用的魚苗苗種促生長劑或添加劑。
文檔編號A23K1/165GK101845440SQ20091019346
公開日2010年9月29日 申請日期2009年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者李文笙, 林浩然, 歐陽靜 申請人:中山大學(xué)