專利名稱:旱半夏組織培養(yǎng)快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于生物技術(shù)工程領(lǐng)域,具體涉及一種旱半夏組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)。
背景技術(shù):
半夏[Pinellia ternate (Thunb. ) Breit.]屬天南星科半夏屬植物,以干燥塊莖入 藥,是一種重要的中藥材,具有降逆止吐、燥濕化痰、消痞散結(jié)等功能,多用于治療痰喘咳、 惡心嘔吐、眩暈等,近年發(fā)現(xiàn)半夏蛋白有抗早孕和抗腫瘤作用,目前國(guó)內(nèi)全年用量就達(dá)5000 噸,是多年來(lái)緊缺的中藥材之一。藥用旱半夏幾乎都來(lái)自野生,我國(guó)雖具有豐富的野生旱半 夏種質(zhì)資源,但由于旱半夏藥用和出口需求量大,造成野生資源日益枯竭難以滿足要求,價(jià) 格持續(xù)上揚(yáng),居高不下。目前,雖有人工栽培種植旱半夏可以緩解市場(chǎng)壓力,但由于旱半夏 生長(zhǎng)要求陰濕環(huán)境,在災(zāi)害性天氣較多的年份,會(huì)造成收獲量不足的情況,這對(duì)旱半夏的生 產(chǎn)造成極大限制。另外,旱半夏連作種植易導(dǎo)致病毒侵染,種性退后,產(chǎn)量和品質(zhì)下降。因 此,考慮使用植物組培快繁技術(shù)進(jìn)行旱半夏種苗生產(chǎn)并進(jìn)行人工種植是解決旱半夏資源短 缺的有效途徑。 目前,現(xiàn)有技術(shù)中未見(jiàn)有完整關(guān)于旱半夏外植體選擇、愈傷組織誘導(dǎo)、器官分化誘 導(dǎo)、碳源濃度選擇的整套組培技術(shù)方案的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種旱半夏組織培養(yǎng)快速繁殖方法。利用本發(fā)明的方法對(duì)
旱半夏進(jìn)行大規(guī)模快繁,以解決旱半夏在天然狀態(tài)下繁殖困難以及旱半夏資源日益匱乏問(wèn)
題,實(shí)現(xiàn)旱半夏的大規(guī)模人工種植,提高旱半夏儲(chǔ)量。 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的,本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案 旱半夏組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù),包括以下步驟 1)配制培養(yǎng)基,基本培養(yǎng)基和其它組培階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為
基礎(chǔ)培養(yǎng)基用MS培養(yǎng)基,附加蔗糖15-45g/L,瓊脂10g/L, pH5. 8 ;
愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS中添加KT 1. 0-3. Omg/L和2, 4-D 1. 0-3. Omg/L ;
分化培養(yǎng)基MS中添加KT 1. 0-3. Omg/L禾卩2, 4—D 1. 0—3. Omg/L ;
增殖培養(yǎng)基MS中添加KT 0. 2-2. Omg/L和2, 4-D 0. 2-2. Omg/L
生根培養(yǎng)基:MS中添加KT 1. 0-2. Omg/L和NAA 0-1. Omg/L ; 2)培養(yǎng)無(wú)菌苗將旱半夏塊莖滅菌處理后,將其切成5mm大小的小塊,接種在 MS+KT 2. 0mg/L+2 , 4-D 2. Omg/L培養(yǎng)基上得到愈傷組織后,移至MS+KT 3. 0mg/L+2 , 4-D 1. Omg/L培養(yǎng)基上使其分化,分化的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)后接種到MS培 養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)得到大量無(wú)菌苗; 3)誘導(dǎo)愈傷組織將步驟2)培養(yǎng)出的無(wú)菌苗的葉片、葉柄和愈傷組織塊,在無(wú)菌
條件下切成5mm大小,接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,誘導(dǎo)形成愈傷組織; 4)分化培養(yǎng)將步驟3)誘導(dǎo)形成的愈傷組織移至分化培養(yǎng)基上使其分化出芽;
5)增殖培養(yǎng)將步驟4)誘導(dǎo)形成的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)移至 增殖培養(yǎng)基上再分化出叢芽; 6)生根培養(yǎng)將步驟5)增殖形成的單芽(包含基部愈傷組織塊)切下,接種在生 根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng); 7)移栽當(dāng)步驟6)的生根組培苗生長(zhǎng)至3-5cm,根數(shù)在5根以上時(shí),移栽入基質(zhì),
在溫室中培養(yǎng)至成苗。 所述步驟2)旱半夏萌發(fā)無(wú)菌苗的方法是選旱半夏塊莖,用75X的乙醇浸泡45s 后,用0. 1 %的升汞消毒15min,無(wú)菌水沖洗5次后接種到培養(yǎng)基上,在溫度為25°C ,光照 2000Lx,光周期12h/d下培養(yǎng)30天。
所述步驟7)中栽培基質(zhì)由腐殖土 珍珠巖按體積比i : i配制而成。
本發(fā)明旱半夏組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)??筛唧w地概括為 (1)從大田直接采集旱半夏的塊莖作為外植體,消毒過(guò)后在接種到培養(yǎng)基上獲得 無(wú)菌苗,然后分別以其葉片、葉柄和塊莖作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織。旱半夏塊莖先用75%的 酒精浸泡45s,再用0. 1 %的升汞消毒15min,使用無(wú)菌水清洗5次,將其切成5mm大小的小 塊,接種在MS+KT 2. 0mg/L+2, 4-D 2. Omg/L培養(yǎng)基上得到愈傷組織后,移至MS+KT 3. Omg/ L+2,4-D 1.0mg/L使其分化,分化的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)后使其在MS培 養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)。在溫度為25°C ,光照2000Lx, 12h/d的光周期條件下培養(yǎng)30天,即可長(zhǎng)出 旱半夏無(wú)菌苗。 (2)分別以步驟(1)的旱半夏無(wú)菌苗的葉片、葉柄或愈傷組織塊為外植體,接入到 MS添加KT、2,4-D和蔗糖的培養(yǎng)基中,其中,MS培養(yǎng)基中KT的濃度為1.0-3. 0mg/L,2,4-D 的濃度為1. 0-3. Omg/L,蔗糖的濃度為15-45mg/L,培養(yǎng)基的pH值為5. 8,瓊脂量為10g/L, 在溫度12rC下滅菌20min,冷卻培養(yǎng)基,在25°C ,光照2000Lx,光周期12h/d下培養(yǎng),誘導(dǎo) 出愈傷組織。 (3)將步驟(2)中產(chǎn)生的胚性愈傷組織接入MS添加KT、2,4-D和蔗糖的培養(yǎng)基上,
其中MS培養(yǎng)基中KT的濃度為1. 0-3. 0mg/L,2,4-D的濃度為1. 0-3. Omg/L,蔗糖的濃度為
15-45g/L,在25°C ,光照2000Lx,光周期12h/d下培養(yǎng)15天,即可萌發(fā)出不定芽。 (4)將步驟(3)中萌發(fā)出的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊),接入MS添加
KT、2,4-D和蔗糖的培養(yǎng)基上,其中MS培養(yǎng)基中的濃度為KT 0. 2_2. Omg/L, 2, 4-D的濃度為
0. 2-2. Omg/L,蔗糖的濃度為30g/L,在25。C,光照2000Lx,光周期12h/d下培養(yǎng)15天,再次
萌發(fā)出大量不定芽。 (5)將步驟(4)中萌發(fā)出的單芽(包含基部愈傷組織塊)切出,轉(zhuǎn)入MS添加KT和 NAA的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)基中,其中,MS培養(yǎng)基中KT的濃度為1. 0-2. Omg/L, NAA的濃 度為0-0. 5mg/L,在25°C ,光照2000Lx,光周期12h/d下培養(yǎng)10天后生根率可達(dá)90%以上。
(6)當(dāng)步驟(5)中已生根的旱半夏組培苗生長(zhǎng)至3-5cm,根數(shù)5根以上時(shí),移栽基 質(zhì)培養(yǎng)至成苗,其中基質(zhì)是由腐殖土 珍珠巖按體積比1 : 1配制。
所述的步驟(2)是利用鹽酸或氫氧化鉀調(diào)整pH值。 本發(fā)明的優(yōu)越性在于利用大規(guī)模組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖旱半夏幼苗,通過(guò)無(wú)菌苗 的培養(yǎng)、以不同部位的外植體誘導(dǎo)愈傷組織,并使其再生出植株。本發(fā)明芽和根的最高分化 率都達(dá)90%以上,苗移栽成活率也達(dá)90%以上。通過(guò)大規(guī)模組培快繁旱半夏,可以擴(kuò)大旱
4半夏種植面積,提高旱半夏的產(chǎn)量,推動(dòng)旱半夏產(chǎn)業(yè)鏈的健康發(fā)展。
具體實(shí)施例方式
下面用本發(fā)明的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容,但并不以此來(lái)限定本發(fā)明。 實(shí)施例1 (以旱半夏葉片為外植體) 先用旱半夏塊莖使其愈傷分化培養(yǎng)得到無(wú)菌苗,然后以其葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織。 (1)旱半夏萌發(fā)無(wú)菌苗的方法為將旱半夏塊莖用75X的酒精浸泡45s,再用
0. 1 %的升汞消毒15min,最后使用無(wú)菌水沖洗5次,將其切成5mm大小的小塊,接種在MS+KT 2. 0mg/L+2 , 4-D 2. 0mg/L培養(yǎng)基上得到愈傷組織后,移至MS+KT 3. 0mg/L+2 , 4-D
1. Omg/L培養(yǎng)基上使其分化,分化的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)后使其在MS培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)。在溫度為25t:,光照2000Lx,光照12h/d下培養(yǎng)30天之后,即可得到旱半夏無(wú)菌苗。 (2)以步驟(1)的旱半夏無(wú)菌苗葉片為外植體接入到MS添加了 KT、2,4-D和蔗糖的培養(yǎng)基中,其中蔗糖的濃度為30克每升,利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH5.8,瓊脂的用量為IO克每升,在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘,冷卻培養(yǎng)基,在25t:,光照2000Lx,光周期12h/d下培養(yǎng)15天,誘導(dǎo)出旱半夏的愈傷組織,愈傷誘導(dǎo)率為52.9%。
(3)將步驟(2)中葉片誘導(dǎo)形成的胚性愈傷接入MS添加了 KT、2,4-D和蔗糖的培養(yǎng)基上,其中蔗糖的濃度為30克每升,利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH5. 8,瓊脂的用量為10克每升,在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘,冷卻培養(yǎng)基,在溫度25t:,光照2000Lx,光周期12h/d下培養(yǎng)15天,即可萌發(fā)出芽。芽分化率可達(dá)93% 。
(4)將步驟(3)中萌發(fā)出的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊),接入MS添加KT、2,4-D和蔗糖的培養(yǎng)基上,其中蔗糖的濃度為30克每升,利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH5. 8,瓊脂的用量為10克每升,在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘,冷卻培養(yǎng)基,在25t:,光照2000Lx,光周期12h/d下培養(yǎng)15天,再次萌發(fā)出芽,芽再分化率為92. 5% 。
(5)將步驟(4)中萌發(fā)出的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根,生根培養(yǎng)基是使用MS添加KT、 NAA和蔗糖的培養(yǎng)基,其中蔗糖的濃度為30克每升,利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調(diào)整培養(yǎng)基PH5. 8,瓊脂的用量為10克每升,在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘,冷卻培養(yǎng)基,在25°C ,光照2000Lx,光周期12h/d下,MS+KT 2. Omg/L+NAA0. 5mg/L培養(yǎng)10-15天后,生根率達(dá)96%。 (6)當(dāng)生根的旱半夏組培苗生長(zhǎng)至3-5cm,根數(shù)5根以上時(shí),移栽入由腐殖土 珍珠巖按體積比l : l配制而成的基質(zhì)中培養(yǎng),定期肥水管理,旱半夏長(zhǎng)勢(shì)良好,成活率可達(dá)90%以上。 實(shí)施例2 (以旱半夏葉柄為外植體) 先用旱半夏使其愈傷分化培養(yǎng)得到無(wú)菌苗,然后以其葉柄為外植體誘導(dǎo)愈傷組織。 (1)旱半夏萌發(fā)無(wú)菌苗的方法為將旱半夏塊莖用75X的酒精浸泡45s,再用0. 1 %的升汞消毒15min,最后使用無(wú)菌水沖洗5次,將其切成5mm大小的小塊,接種在MS+KT 2. Omg/L+2 , 4_D 2. 0mg/L培養(yǎng)基上得到愈傷組織后,移至MS+KT 3. Omg/L+2 , 4_D1. Omg/L使其分化,分化的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)后使其在MS培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)。在溫度為25t:,光照2000LX下培養(yǎng)30天之后,即可得到旱半夏無(wú)菌苗。
(2)以步驟(1)的旱半夏無(wú)菌苗的葉柄為外植體直接接入到MS添加了 KT、2,4-D和蔗糖的培養(yǎng)基中,其中蔗糖的濃度為30克每升,利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH5.8,瓊脂的用量為10克每升,在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘,冷卻培養(yǎng)基,在25t:,光照2000Lx,光周期12h/d下培養(yǎng),誘導(dǎo)出愈傷組織。MS+KT1. Omg/L+2. 4_D 1. Omg/L的愈傷誘導(dǎo)率為57%。 (3)將步驟(2)中葉柄誘導(dǎo)形成的胚性愈傷接入MS添加了 KT、2,4-D的培養(yǎng)基上,其中蔗糖的濃度為30克每升,利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH5. 8,瓊脂的用量為10克每升,在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘,冷卻培養(yǎng)基,在25°C ,光照2000Lx,光周期12h/d下培養(yǎng)15天,即可萌發(fā)出芽。MS+KT 3. Omg/L+2. 4-D1. Omg/L的芽分化率為93%。
(4)將步驟(3)中萌發(fā)出的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊),接入MS添加KT、2,4-D和蔗糖的培養(yǎng)基上,其中蔗糖的濃度為30克每升,利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調(diào)整培養(yǎng)基PH5. 8,瓊脂的用量為10克每升,在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘,冷卻培養(yǎng)基,在25。C,光照2000LX,光周期12h/d下培養(yǎng)15天,再次萌發(fā)出芽。MS+KT 1. Omg/L+2. 4-D0. 3mg/L的芽再分化率為97%。 (5)將步驟(4)中萌發(fā)出的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根,生根培養(yǎng)基是使用MS添加KT、 NAA和蔗糖的培養(yǎng)基,其中蔗糖的濃度為30克每升,利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH5. 8,瓊脂的用量為10克每升,在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘,冷卻培養(yǎng)基,在25°C ,光照2000Lx,光周期12h/d下,MS+KT 2. Omg/L+NAA0. 5mg/L培養(yǎng)10-15天后,生根率可達(dá)100%。 (6)當(dāng)生根的旱半夏組培苗生長(zhǎng)至3-5cm,根數(shù)5根以上時(shí),移栽入由腐殖土 珍珠巖按體積比l : l配制而成的基質(zhì)中培養(yǎng),定期肥水管理,旱半夏長(zhǎng)勢(shì)良好,成活率可達(dá)90%以上。 實(shí)施例3 (以旱半夏愈傷塊為外植體) 先用旱半夏使其愈傷分化培養(yǎng)得到無(wú)菌苗,然后以其愈傷塊為外植體繼續(xù)誘導(dǎo)成愈傷組織。 (1)旱半夏萌發(fā)無(wú)菌苗的方法為將旱半夏塊莖用75X的酒精浸泡45s,再用0. 1 %的升汞消毒15min,最后使用無(wú)菌水沖洗5次,將其切成5mm大小的小塊,接種在MS+KT 2. 0mg/L+2 , 4-D 2. Omg/L培養(yǎng)基上得到愈傷組織后,移至MS+KT 3. 0mg/L+2 , 4-D1.0mg/L使其分化,分化的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)后使其在MS培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)。在溫度為25t:,光照2000Lx下培養(yǎng)30天之后,即可得到旱半夏無(wú)菌苗。
(2)以步驟(1)的旱半夏愈傷塊為外植體直接接入到MS添加了 KT、2,4-D和蔗糖的培養(yǎng)基中,其中蔗糖的濃度為30克每升,利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH5.8,瓊脂的用量為10克每升,在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘,冷卻培養(yǎng)基,在25°C ,,光照2000Lx,光周期12h/d下培養(yǎng),誘導(dǎo)出旱半夏的愈傷組織。MS+KT 2. Omg/L+2. 4-D 2. Omg/L的愈傷誘導(dǎo)率為93%。 (3)將步驟(2)中愈傷塊誘導(dǎo)形成的胚型愈傷接入MS添加了 KT、2,4-D的培養(yǎng)基上,其中蔗糖的濃度為30克每升,利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH5. 8,瓊脂的用量為10克每升,在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘,冷卻培養(yǎng)基,在25°C,,光照2000Lx,光周期12h/d下培養(yǎng)15天,即可萌發(fā)出芽。MS+KT3. Omg/L+2. 4-D 1. Omg/L的芽分化率為96%。
(4)將步驟(3)中萌發(fā)出的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊),接入MS添加KT、2,4-D和蔗糖的培養(yǎng)基上,其中蔗糖的濃度為30克每升,利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調(diào)整培養(yǎng)基PH5. 8,瓊脂的用量為10克每升,在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘,冷卻培養(yǎng)基,在25。C,光照2000Lx,光周期12h/d下培養(yǎng)15天,再次萌發(fā)出芽。MS+KT 1. Omg/L+2. 4-D0. 3mg/L的芽再分化率為98%。 (5)將步驟(4)中萌發(fā)出的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根,生根培養(yǎng)基是使用MS添加KT、 NAA和蔗糖的培養(yǎng)基,其中蔗糖的濃度為30克每升,利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH5. 8,瓊脂的用量為10克每升,在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘,冷卻培養(yǎng)基,在25°C ,光照2000Lx,光周期12h/d下,MS+KT 2. Omg/L+NAA0. 5mg/L培養(yǎng)10-15天后,生根率可達(dá)100%。 (6)當(dāng)生根的旱半夏組培苗生長(zhǎng)至3-5cm,根數(shù)5根以上時(shí),移栽入由腐殖土 珍珠巖按體積比l : l配制而成的基質(zhì)中培養(yǎng),定期肥水管理,旱半夏長(zhǎng)勢(shì)良好,成活率可達(dá)90%以上。 實(shí)施例4(以旱半夏塊莖為外植體得出碳源濃度影響的結(jié)果) 先用旱半夏塊莖愈傷分化得到無(wú)菌苗,然后以其愈傷塊為外植體誘導(dǎo)坯性愈傷組織。 (1)旱半夏萌發(fā)無(wú)菌苗的方法為將旱半夏塊莖用75X的酒精浸泡45s,再用0. 1 %的升汞消毒15min,最后使用無(wú)菌水沖洗5次,將其切成5mm大小的小塊,接種在MS+KT 2. 0mg/L+2 , 4-D 2. Omg/L培養(yǎng)基上得到愈傷組織后,移至MS+KT 3. 0mg/L+2 , 4-D1.0mg/L使其分化,分化的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)后使其在MS培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)。在溫度為25t:,光照2000Lx下培養(yǎng)30天之后,即可得到旱半夏無(wú)菌苗。
(2)以步驟(1)的的旱半夏愈傷塊為外植體直接接入到MS添加了 KT 2. 0mg/L、2,4-D 2.0mg/L和蔗糖的培養(yǎng)基中,其中蔗糖的濃度為分別為15, 30, 45克每升,利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調(diào)整培養(yǎng)基PH5. 8,瓊脂的用量為10克每升,在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘,冷卻培養(yǎng)基,在溫度25°C ,光照2000Lx,光周期12h/d下培養(yǎng),誘導(dǎo)旱半夏產(chǎn)生愈傷組織。結(jié)果發(fā)現(xiàn),45g/L時(shí)旱半夏塊莖的愈傷組織誘導(dǎo)率為85%,在此濃度范圍內(nèi)愈傷組織誘導(dǎo)率與蔗糖濃度成正比。 (3)將步驟(2)中愈傷塊誘導(dǎo)形成的胚型愈傷組織接入MS添加KT 3. 0mg/L、2,4-D 1.0mg/L和蔗糖的培養(yǎng)基上,其中蔗糖的濃度為分別為15,30,45克每升,利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調(diào)整培養(yǎng)基PH5. 8,瓊脂的用量為10克每升,在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘,冷卻培養(yǎng)基,在25t:,光照2000Lx,光周期12h/d下培養(yǎng)15天,即可萌發(fā)出芽。蔗糖含量為40g/L時(shí),芽的分化率最高為90%。 (4)將步驟(3)中萌發(fā)出的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊),接入MS添加2,4-D、KT和蔗糖的培養(yǎng)基上,其中蔗糖的濃度為30克每升,利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調(diào)整培養(yǎng)基PH5.8,瓊脂的用量為10克每升,在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘,冷卻培養(yǎng)基,在25。C,光照2000Lx,光周期12h/d下培養(yǎng)15天,再次萌發(fā)出芽。在MS+KT 1. Omg/L+2. 4-D0. 3mg/L的芽分化率分別為98%。 (5)將步驟(4)中萌發(fā)出的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根,生根培養(yǎng)基是使用MS添加KT和NAA的培養(yǎng)基,其中蔗糖的濃度為30克每升,利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH5. 8,瓊脂的用量為10克每升,在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘,冷卻培養(yǎng)基,在25°C ,光照2000Lx,光周期12h/d下MS+KT 2. Omg/L+NAA 0. 5mg/L培養(yǎng)10-15天后,生根率可達(dá)100%。 (6)當(dāng)生根的旱半夏組培苗生長(zhǎng)至3-5cm,根數(shù)5根以上時(shí),移栽入由腐殖土 珍珠巖按體積比l : l配制而成的基質(zhì)中培養(yǎng),定期肥水管理,旱半夏長(zhǎng)勢(shì)良好,成活率可達(dá)90%以上。
權(quán)利要求
旱半夏組織培養(yǎng)快速快繁方法,包括以下步驟1)配制培養(yǎng)基,基本培養(yǎng)基和其它組培階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含量為基本培養(yǎng)基用MS培養(yǎng)基,附加蔗糖15-45g/L,瓊脂10g/L,調(diào)節(jié)pH5.8;愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS中添加KT 1.0-3.0mg/L和2,4-D 1.0-3.0mg/L;分化培養(yǎng)基MS中添加KT 1.0-3.0mg/L和2,4-D 1.0-3.0mg/L;增殖培養(yǎng)基MS中添加KT 0.2-2.0mg/L和2,4-D 0.2-2.0mg/L;生根培養(yǎng)基MS中添加KT 1.0-2.0mg/L和NAA 0-1.0mg/L;2)培養(yǎng)無(wú)菌苗將旱半夏塊莖進(jìn)行滅菌處理后,切成5mm左右的小塊,將其移至MS+KT 2.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L的培養(yǎng)基上產(chǎn)生愈傷,其后轉(zhuǎn)入MS+KT3.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L的培養(yǎng)基上使其分化,將產(chǎn)生的叢芽塊,再將其切成單芽塊移至MS基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)得到無(wú)菌苗;3)誘導(dǎo)愈傷組織在無(wú)菌條件下,將步驟2)培養(yǎng)出的無(wú)菌苗的葉片、葉柄及愈傷組織塊切成5mm大小的組織,接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,誘導(dǎo)形成愈傷組織;4)分化培養(yǎng)將步驟3)誘導(dǎo)形成的愈傷組織移至分化培養(yǎng)基上使其分化出芽;5)增殖培養(yǎng)將步驟4)生成的叢芽切成單芽(包含基部的愈傷組織塊),接種至增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng),使其再分化出芽;6)生根培養(yǎng)將步驟5)形成的叢芽塊切成單芽(包含基部的愈傷組織塊),接種在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng);7)移栽當(dāng)步驟6)的生根組培苗生長(zhǎng)至3-5cm,根數(shù)在5根以上時(shí),移栽入基質(zhì)中,在溫室中培養(yǎng)至成苗。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法,其特征在于所述步驟2)旱半夏萌發(fā)無(wú)菌苗的方法是 選旱半夏塊莖,用75 %的乙醇浸泡45s后,用0. 1 %的升汞消毒15min,無(wú)菌水沖洗5次后接 種到培養(yǎng)基上,在溫度為25t:,光照2000Lx,光周期12h/d下培養(yǎng)30天,得到無(wú)菌苗。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于所述步驟7)中栽培基質(zhì)由腐殖土 珍珠 巖按體積比l:l配制而成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于所述基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基各 組分與每升所含重量為1) 基本培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基,蔗糖15-45g/L,瓊脂10g/L, pH5. 8 ;2) 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以葉片為外植體時(shí),MS+KT 3. 0mg/L+2,4-D 1. Omg/L ; 以葉柄為外植體時(shí),MS+KT 1. Omg/L+2. 4-D 1. Omg/L ; 以土央莖為外植體時(shí),MS+KT `2. Omg/L+2. 4-D 2. Omg/L ;3) 分化培養(yǎng)基MS+KT 3. Omg/L+2. 4-D 1. Omg/L ;4) 增殖培養(yǎng)基MS+KT 1. Omg/L+2. 4-D 0. 3mg/L ;5) 生根培養(yǎng)基MS+KT 2. Omg/L+NAA 0. 5mg/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種旱半夏組織培養(yǎng)快速繁殖方法。利用組織培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)無(wú)菌旱半夏塊莖產(chǎn)生愈傷組織并分化產(chǎn)生無(wú)菌苗,然后取無(wú)菌苗的葉片、葉柄及愈傷組織塊作為外植體,再經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)、分化培養(yǎng),增殖培養(yǎng),生根培養(yǎng)后,大量繁殖旱半夏組培苗。本發(fā)明外植體來(lái)源豐富,體積較大,接種成活率高,操作簡(jiǎn)單快捷,繁殖系數(shù)高,速度快,適合工廠化育苗。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101720670SQ20091021838
公開(kāi)日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月17日
發(fā)明者屈文國(guó), 李昆志, 王藝霖, 陳麗梅 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)