專利名稱：三葉木通果種苗試管快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提高三葉木通果種苗快速繁殖技術(shù)領(lǐng)域的新方法，特別是涉及外植體 的處理方法。
背景技術(shù)：
三葉木通果[Akebia trifoliata(Thunb. )Koidz]是木通科木通屬的一種營養(yǎng)價 值較高的落葉或半落葉藤本野生水果，多分布在長江以南，在中國南部、長江流域和西北地 區(qū)均有分布與獼猴桃并稱野生水果大王，俗稱八月炸、八月瓜。長期以來，人們一直把木通 家族的根、莖、葉、種子視為中草藥，具有通筋活絡(luò)、解毒、生津止渴、消炎、除濕、瀉火以及通 乳等功效。其果實較大、果重150-250g，果腎型，果面紫紅色或明黃色，非常美觀。果肉乳白 透明，肉質(zhì)細(xì)嫩，濃甜可口，香氣迷人，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、淀粉、可溶性糖及礦質(zhì)元素均高 于蘋果、桔子、梨子等栽培品種的1 4倍，維生素Cd1A2^6等，與蘋果、桔子、梨子等含量 水平不相上下。其營養(yǎng)成分大體上與國內(nèi)外專家高度重視的沙棘等野生水果相當(dāng)，是頗受 人們喜愛的野生水果，是一種很有經(jīng)濟(jì)價值的植物。三葉木通果實可鮮食或釀酒、制飲料。 此外，三葉木通種子中含有36. 84%的油脂，亞油酸含量高，富含有維生素，色清味香，是值 得開發(fā)的一種保健食用油脂。但野生果實皮厚，種子多，可食率較低，需要不斷改良才能栽 培利用。傳統(tǒng)的遺傳改良方法比較費時、費力，困難大，已經(jīng)不能滿足三葉木通果產(chǎn)業(yè)發(fā)展 的需要。而運用植物細(xì)胞遺傳工程技術(shù)可極大縮短育種年限，加快育種進(jìn)程，且更有目的地 獲得具有更理想性狀的新品種。三葉木通果優(yōu)良種苗的生產(chǎn)一般采用扦插法，但存在生根困難，成活率低，繁殖速 度慢等問題，利用細(xì)胞工程技術(shù)可以在短時間內(nèi)大量繁殖優(yōu)良三葉木通果種苗，不僅可以 很好的解決三葉木通果種苗繁育的難題，而且也是利用細(xì)胞遺傳工程技術(shù)改良三葉木通果 性狀的前提和基礎(chǔ)。植物細(xì)胞在物理或化學(xué)方法的誘導(dǎo)下產(chǎn)生體細(xì)胞的變異，通過分化再 生得到變異改良的植株，其獲得的優(yōu)良植株的繁殖是新品種應(yīng)用和推廣的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種為三葉木通果高效種苗繁殖技術(shù)體系的建立提供基 礎(chǔ)的，可提高三葉木通果種苗試管快速繁殖方法。本發(fā)明的目的是通過下述方式實現(xiàn)的1)將生長健壯的木質(zhì)化程度較低的帶腋芽的三葉木通果莖段切割成1. 5cm左右 大小的莖段，消毒處理帶腋芽的莖段為外植體，接種于叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)腋芽產(chǎn)生叢 生芽；2)將材料放置于25 士 2°C，黑暗培養(yǎng)；每隔25天左右更換一次新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基；3)待叢生芽開始產(chǎn)生時放置在光照下培養(yǎng)，叢生芽長到3cm左右時及時將植株切 從基部切割，將植株轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，25士2°C，光照培養(yǎng)至植株高7cm 左右；
4)將生根培養(yǎng)基上長7cm左右的三葉木通果苗從生根培養(yǎng)基中取出，用解剖刀將 試管苗切割成Icm左右的帶腋芽的莖段，將帶腋芽的莖段接種于生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培 養(yǎng)，25士2°C，光照培養(yǎng)至植株高7cm左右；5)將所得的植株再按照上述4中方法進(jìn)行再次切割，帶腋芽莖段接種于生根培養(yǎng) 基上進(jìn)行生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，25士2°C，照光，所得植株洗盡培養(yǎng)基后移栽至栽培 基質(zhì)中進(jìn)行生長即成。自從運用植物細(xì)胞工程技術(shù)對優(yōu)良植物種苗進(jìn)行試管快繁以來，有關(guān)其植物種苗 試管快繁技術(shù)體系的建立、工廠化生產(chǎn)都有了十分廣泛的研究。但三葉木通果的試管快繁 技術(shù)，尤其是帶腋芽莖段直接生根成苗的快繁技術(shù)還未見報道。本發(fā)明具體實施過程為1.將生長健壯的木質(zhì)化程度較低的帶腋芽的三葉木通果莖段切割成1. 5cm左右 大小的莖段，消毒處理為外植體，接種于叢芽誘導(dǎo)腋芽產(chǎn)生叢生芽，經(jīng)75%酒精消毒30S 后，再用0. 升汞消毒8min，然后用無菌水沖洗4至5次，晾干后接種在叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 基上；誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加水解酪蛋白、椰子汁、TDZ，IBA和活性炭， 每隔25天更換一次新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基；25士2°C黑暗培養(yǎng)。2.待叢生芽開始產(chǎn)生時放置在光照下培養(yǎng)，叢生芽長到3cm左右時及時將植株 從基部切割，將植株轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，25士2°C光照培養(yǎng)至植株高7cm左 右，其生根培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了 IBA和活性炭。3.當(dāng)三葉木通果苗長7cm左右時從生根培養(yǎng)基中取出，用解剖刀將試管苗切割成 Icm左右的帶腋芽的莖段，將帶腋芽的莖段接種于生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，25士2°C，光 照培養(yǎng)植株高7cm左右。其生根培養(yǎng)基又是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加IBA和活性 炭。4.所得的植株再按照3)的方法進(jìn)行切割，帶腋芽莖段接種于生根培養(yǎng)基上進(jìn)行 生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，25士2°C，照光；所得植株洗盡培養(yǎng)基后移栽至栽培基質(zhì)中進(jìn) 行生長。5.自接種后，每天觀察材料，每三天作一次紀(jì)錄，紀(jì)錄內(nèi)容包括叢生芽萌動時間、 萌動數(shù)目數(shù)目、莖段萌芽時間、莖段發(fā)根時間、莖段萌芽率、莖段生根數(shù)、苗高5-7cm的時間 和質(zhì)量；25士2°C，光照培養(yǎng)至苗高5-7cm，最后記錄每三角瓶中成苗數(shù)。叢生芽誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)叢生芽的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))X 100%莖段成苗率=(誘導(dǎo)莖段成苗的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))X 100%在上述過程中叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的TDZ濃度為0. 5-1. Omg/1，IBA濃度為Hmg/ 1 ；生根培養(yǎng)基中IBA濃度為2-6mg/l ；上述過程中的培養(yǎng)基用到的水解酪蛋白的濃度為300mg/l ；椰子汁的濃度為 IOOg/1 ；活性炭的濃度為0. 3g/l。
具體實施例方式提高三葉木通果種苗試管快速繁殖的新方法(1)從湖南張家界、湖南懷化、河南洛陽三地采集的三葉木通果優(yōu)良種苗種植在 溫室中，待三葉木通果苗長出30-40cm長的枝條時，挑選健壯的枝條，將帶腋芽的部分莖段切割下來后用自來水沖洗干凈。以帶腋芽的莖段為外植體，經(jīng)75%酒精消毒30S后，再用 0. 1 %升汞消毒8min，然后用無菌水沖洗4至5次，晾干后用解剖刀進(jìn)行切割，使帶腋芽部分 的長度大約為Icm左右，按照莖的自然生長方向分別插接在叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每三角 瓶中接種5個外植體，每種外植體接種20瓶左右，25士2°C黑暗培養(yǎng)。叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是 在MS基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加了 TDZ，IBA、水解酪蛋白、椰子汁，活性炭，每隔25天左右更換 一次新鮮培養(yǎng)基。(2)待叢生芽開始產(chǎn)生時放置在光照下培養(yǎng)，叢生芽長到3cm左右時及時將植株 切從基部切割，將植株轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，每三角瓶中接種5個外植體。培 養(yǎng)過程的溫度都控制在25士2°C。(3)將生根培養(yǎng)基上長7cm左右的三葉木通果苗從生根培養(yǎng)基中取出，用解剖刀 將試管苗切割成Icm左右的帶腋芽的莖段，將帶腋芽的莖段接種于生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根 培養(yǎng)，每三角瓶接種15個莖段左右。當(dāng)植株高長到7cm左右，又從生根培養(yǎng)基中取出進(jìn)行再 次切割，將帶腋芽莖段又接種于生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根，這樣可多次重復(fù)，擴(kuò)大繁殖系數(shù)。 25士2°C，照光培養(yǎng)。當(dāng)植株數(shù)達(dá)到一定的基數(shù)后可將生根培養(yǎng)基上長根的試管苗植株洗盡 培養(yǎng)基后移栽至栽培基質(zhì)中進(jìn)行生長。(4)自接種后，每天觀察材料，每三天作一次紀(jì)錄，紀(jì)錄內(nèi)容包括叢生芽萌動時間、 萌動數(shù)目數(shù)目、莖段萌芽時間、莖段發(fā)根時間、莖段萌芽率、莖段生根數(shù)、苗高5-7cm的時間 和質(zhì)量；25士2°C，光照培養(yǎng)至苗高5-7cm，最后記錄每三角瓶中成苗數(shù)。叢生芽誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)叢生芽的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))X 100%莖段成苗率=(誘導(dǎo)莖段成苗的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))X 100%實驗結(jié)果表明從表1可以看出，三葉木通果帶腋芽莖段都能在叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 基上誘導(dǎo)出叢生芽，但誘導(dǎo)率在不同產(chǎn)地的材料中有差異，其中以河南洛陽三葉木通果的 誘導(dǎo)率最高，達(dá)到65. 38%,叢生芽誘導(dǎo)萌動時間為20-30天。利用試管苗切莖快速繁殖的 有生產(chǎn)價值，其帶腋芽莖段生根成苗70-90%，每植株平均生根數(shù)2-3之間(表2)。表1不同產(chǎn)地三葉木通果腋芽莖段叢生芽的誘導(dǎo)
品種處理方式接種數(shù)叢生芽誘導(dǎo) 數(shù)叢生芽誘導(dǎo) 率(％)叢生芽萌動時 間(天)湖南張家界 三葉木通帶腋芽莖段2107535. 7125湖南懷化三 葉木通帶腋芽莖段2306528. 2629河南洛陽三 葉木通帶腋芽莖段26017065. 3822表2三葉木通果試管苗帶腋芽莖段生根成苗的效果
權(quán)利要求
1.三葉木通果種苗試管快速繁殖方法，其特征在于A)將生長健壯的木質(zhì)化程度較低的帶腋芽的三葉木通果莖段切割成1.5cm左右大 小的莖段，消毒處理帶腋芽的莖段為外植體，接種于叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)腋芽產(chǎn)生叢生 芽；B)將材料放置于25士2°C，黑暗培養(yǎng)；每隔25天左右更換一次新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基；C)待叢生芽開始產(chǎn)生時放置在光照下培養(yǎng)，叢生芽長到3cm左右時及時將植株切從基 部切割，將植株轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，25士2°C，光照培養(yǎng)至植株高7cm左右；D)將生根培養(yǎng)基上長7cm左右的三葉木通果苗從生根培養(yǎng)基中取出，用解剖刀將試管 苗切割成Icm左右的帶腋芽的莖段，將帶腋芽的莖段接種于生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)， 25 士 2 °C，光照培養(yǎng)至植株高7cm左右；E)將所得的植株再按照上述4中方法進(jìn)行再次切割，帶腋芽莖段接種于生根培養(yǎng)基上 進(jìn)行生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，25士2°C，照光，所得植株洗盡培養(yǎng)基后移栽至栽培基質(zhì) 中進(jìn)行生長即成。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的三葉木通果種苗試管快速繁殖方法，其特征在于所述方法A中 消毒處理是經(jīng)75%酒精消毒30s后，再用0. 升汞消8min，然后用菌水沖洗4至5次，晾 干后接種在生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，所述方法A中叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上 添加水解酷蛋白、椰子汁、TDZ、IBA和活性炭，每隔25天更換一次新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基，25士2°C 黑暗培養(yǎng)，在其上述水解酷蛋白的濃度為300mg/l、椰子汁的濃度為100g/l、活性炭的濃度 為 0.3g/l。
3.據(jù)權(quán)利要求1所述的三葉木通果種苗試管快速繁殖方法，其特征在于所述方法C中 生根培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加TBA和活性炭。
4.據(jù)權(quán)利要求1所述的三葉木通果種苗試管快速繁殖方法，其特征在于所述方法D中 生根培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加IBA和活性炭。
5.據(jù)權(quán)利要求1(A中)或2所述的三葉木通果種苗試管快速繁殖方法，其特征在于叢 生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的TDZ濃度為0. 5-1. Omg/1, IBA濃度為Hmg/l。
6.據(jù)權(quán)利要求IC中或3所述的三葉木通果種苗試管快速繁殖方法，其特征在于生根培 養(yǎng)基中IBA濃度為2-6mg/l。
全文摘要
三葉木通果種苗試管快速繁殖方法，將三葉木通誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽成培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，爾后在25±2℃光照培養(yǎng)植株高7cm左右，叢生根培養(yǎng)基中取出，用解剖刀將試管苗切割成1cm左右的帶腋芽的莖段生根培養(yǎng)，再光照植株高7cm左右，既再次光照移栽至栽培基質(zhì)中進(jìn)行生長。這種方法是用植物細(xì)胞遺傳工程技術(shù)可極大縮短育種年限，加快育種進(jìn)程，且更有目的地獲得具有更理想性狀的新品種。
文檔編號A01H4/00GK102090327SQ20091022663
公開日2011年6月15日 申請日期2009年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月15日
發(fā)明者艾辛, 范立華 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)