專利名稱：：一種煙草秸稈降解真菌及其菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種煙草秸稈降解真菌及其菌劑，屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)技術(shù)，專用于降解廢棄煙草秸稈生產(chǎn)有機(jī)肥料，實(shí)現(xiàn)有機(jī)廢棄物的資源化利用。二
背景技術(shù)：
：我國(guó)是世界煙草栽培面積最多的國(guó)家，每年煙葉產(chǎn)量約為450-500萬噸，與此同時(shí)產(chǎn)生了大量的廢棄煙稈。煙草秸稈中有機(jī)物含量約為90%_95%，礦物質(zhì)含量為5%_10%;其中氮含量0.5-1.2%，磷含量0.1%-0.25%，鉀含量0.8%-1.8%。煙草生產(chǎn)帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，也產(chǎn)生了大量的農(nóng)業(yè)廢棄物煙草秸稈。因此，煙稈是一種十分寶貴的農(nóng)業(yè)資源，合理利用這種資源是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一項(xiàng)重要任務(wù)。然而，煙草秸稈中含有大量的木質(zhì)素、纖維素和尼古丁，因此普通菌株難以分解，不能就地還田處理，也不適用于造紙和作飼料。于是，絕大部分煙草秸稈都作為廢棄物被丟棄或被焚燒，不同程度地污染了當(dāng)?shù)氐纳?、生產(chǎn)環(huán)境，也造成了資源的浪費(fèi)。大量的研究表明，高溫堆肥是目前有機(jī)廢棄物無害化處理和資源化利用最安全有效的途徑之一。利用微生物降解可以將廢棄煙稈制成優(yōu)良的有機(jī)堆肥。此外，煙稈中含有較高含量的煙堿，使得堆腐后的有機(jī)肥具有一定的抗病和生防作用，同時(shí)也可以作為植物生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)劑，還具有減少肥料中銨態(tài)氮流失的作用。在高溫堆肥過程中，加快升溫速度、縮短堆肥腐熟時(shí)間是商品有機(jī)肥產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵。煙稈中含有大量較難被生物降解的木質(zhì)纖維素，因此木質(zhì)纖維素的降解是限制煙稈堆肥腐熟的主要因素。而木質(zhì)纖維素主要在高溫階段被分解利用。由于溫度的影響，高溫階段的微生物種群受到很大的抑制，表現(xiàn)為種類單一，數(shù)量減少，極大地限制了木質(zhì)纖維素物質(zhì)的快速降解。通過接種纖維素降解菌菌劑，特別是高溫菌菌株，可以加速堆體升溫，加快堆肥底物中木質(zhì)纖維類物質(zhì)的分解，從而縮短堆肥腐熟的周期。在高溫堆肥過程中，真菌產(chǎn)生的胞外纖維素分解酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素分解酶活性。若能篩選到相應(yīng)的功能菌株，將其用于廢棄煙稈的降解和肥料生產(chǎn)，將會(huì)有很好的應(yīng)用前景。三
發(fā)明內(nèi)容1.技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于篩選一種能夠分解煙草秸稈的高溫微生物，使其能高效降解煙稈，并利用其生產(chǎn)有機(jī)肥，確?？沙掷m(xù)農(nóng)業(yè)的順利發(fā)展。2.技術(shù)方案—種能降解煙草秸稈的高溫真菌，該菌株P(guān)-l屬于灰綠曲霉(Aspergi1lusglaucus)，2009年9月22日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCCNO.3304。初期菌落表面淺色、平坦，呈細(xì)小顆粒狀，隨著時(shí)間推移顆粒逐漸變密，顏色逐漸變?yōu)樯罹G色，并產(chǎn)生大量的分生孢子。分生孢子梗頂端膨大呈球形，表面以放射狀生出小梗，圓形的分生孢子串生于小梗頂端。煙草秸稈降解菌P-l能在CMC-剛過紅培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并產(chǎn)生透明的水解圈。CMC-剛果紅培養(yǎng)基配方為羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)5g，(NH4)2S042g，KH2P04lg，MgS047H200.5g，剛果紅0.2g，瓊脂20g，水1000ml，pH自然，121。C高壓滅菌20min。煙草秸稈降解菌P-l孢子懸液(菌劑)的制備方法為1)煙稈粉培養(yǎng)基配方為干燥粉碎后的煙草秸稈粉末5g，(NH4)2S042g，KH2P04lg，MgS047H200.5g，水1000ml，pH自然，121。C高壓滅菌20min。2)液體培養(yǎng)基的配制烘干粉碎后的煙草秸稈粉末(粉碎后過30目篩，含水量1X以下)5g，(NH4)2S042g，KH2P04lg，MgS047H200.5g，CaCl20.lg，蛋白胨0.lg，酵母膏0.lg，水1000ml，pH自然，121。C高壓滅菌20min;3)將上述菌株P(guān)-l接種至煙稈粉固體培養(yǎng)基上，45t:條件下培養(yǎng)3-4d，取直徑0.8cm的菌餅1塊接種于上述液體培養(yǎng)基中，裝液量1/5，轉(zhuǎn)速170r/min，45。C條件下振蕩培養(yǎng)5d，培養(yǎng)物經(jīng)無菌紗布過濾后即為孢子懸液菌劑。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后可濃縮或用無菌水稀釋以達(dá)到使用濃度，一般為106個(gè)/ml。所用烘干粉碎后的煙草秸稈粉末指的是粉碎后過30目篩，含水量1%以下。上述孢子懸液菌劑可用于降解煙草秸稈。3.有益效果本發(fā)明提供了一種能高效分解煙草秸稈的高溫真菌，該菌株P(guān)-l可在CMC-剛果紅平板上生長(zhǎng)并產(chǎn)生透明的水解圈，可在以煙稈為唯一碳源的煙稈粉平板上生長(zhǎng)。將孢子懸液接種于煙草秸稈進(jìn)行固體發(fā)酵后，煙稈失重率為40.5%，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解率分別為50.6%、47.4%和35.2%;而對(duì)照組的煙稈失重率為27.7%，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素降解率分別為31.4%、27.8%和20.7%(表1)。煙草秸稈降解菌P-1可將廢棄煙草秸稈發(fā)酵分解后制成有機(jī)肥料，不僅可以變廢為寶、保護(hù)環(huán)境，還可以促進(jìn)可持續(xù)發(fā)展，具有廣闊的應(yīng)用前景。具體實(shí)施例方式1)高效菌株的分離該降解菌是從江蘇常熟地區(qū)生產(chǎn)的豬糞堆肥中篩選到的。將樣品進(jìn)行梯度稀釋，然后將菌懸液涂布到CMC-剛果紅平板上，45t:培養(yǎng)篩選降解菌。上述CMC-剛果紅培養(yǎng)基配方為羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)5g，(NH4)2S042g，KH2P04lg，MgS047H200.5g，剛果紅0.2g，瓊脂20g，水1000ml，pH自然，12TC高壓滅菌20min。挑選在CMC-剛果紅平板上產(chǎn)生透明圈較大的菌株，再分別接種到煙稈粉培養(yǎng)基上，選擇生長(zhǎng)較快的菌株，最終得到能高效降解煙草秸稈的高溫真菌P-1。該菌菌落初期表面淺色、平坦，呈細(xì)小顆粒狀，隨著時(shí)間推移顆粒逐漸變密，顏色逐漸變?yōu)樯罹G色，并產(chǎn)生大量分生孢子。分生孢子梗頂端膨大呈球形，表面以放射狀生出小梗，圓形的分生孢子串生于小梗頂端。鑒定為灰綠曲霉(Aspergillusgl塞us)。該菌株能在以煙草秸稈為唯一碳源的煙稈粉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。煙稈粉培養(yǎng)基配方為烘干粉碎后的煙草秸稈粉末(粉碎后過30目篩，含水量l^以下)5g，(NH4)2S042g，KH2P04lg，MgS047H200.5g，瓊脂20g，水lOOOml，pH自然，121。C高壓滅菌20min2)煙草秸稈降解菌P-l孢子懸液菌劑的制備接種降解菌P-l在煙稈粉培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)3-4d，挑取直徑0.8cm的菌餅1塊接種至液體培養(yǎng)基中，45t:條件下振蕩培養(yǎng)5d(裝液量1/5、轉(zhuǎn)速170r/min)，培養(yǎng)物用無菌紗布過濾后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用無菌水將孢子懸液調(diào)整至106個(gè)/ml。液體培養(yǎng)基配方為烘干粉碎后的煙草秸稈粉末(粉碎后過30目篩，含水量1%以下)，(NH4)2S042g，KH2P04lg，MgS04*7H200.5g，CaCl20.lg，蛋白胨0.lg，酵母膏0.lg，水lOOOml，pH自然，121。C高壓滅菌20min。3)煙草秸稈降解采用三角瓶固體發(fā)酵的方法研究菌株對(duì)煙草秸稈的降解效果。每個(gè)150ml三角瓶分裝烘干的、剪碎至1cm寬、2-3cm長(zhǎng)的煙稈5g，(NH4)2S040.2g，MgS047H200.05g，每瓶加5mMpH7.0的磷酸緩沖液(PBS)15ml。各瓶接種0.25ml106個(gè)/ml濃度的孢子懸液，以接種等量無菌水作為對(duì)照，混勻后置于45t:恒溫培養(yǎng)。定期觀察煙稈的形態(tài)變化，7天后，洗去煙稈上的菌絲，測(cè)定其失重率以及纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解率。纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的測(cè)定方法纖維素將煙稈粉碎后過30目篩，稱取0.2g煙稈粉末于燒杯中，將燒杯置冷水浴中，加入60%H2S0460ml，并消化30min，然后將消化好的纖維素溶液轉(zhuǎn)入100ml容量瓶，并用60%H2S04定容至刻度，搖勻后用布氏漏斗過濾至另一燒杯中。取濾液5ml，放入100ml容量瓶中，在冷水浴上加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，取2ml于具塞試管中，加入0.5ml2%蒽酮試劑，并沿管壁加5ml濃H2S04，塞上塞子，搖勻，靜置10min，然后在620nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。根據(jù)纖維素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的纖維素含量。半纖維素將煙稈粉碎后過30目篩，稱取0.lg煙稈粉末于燒杯中，加入10ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%硝酸*丐溶液，置電爐上加熱，小火煮沸5min。冷卻后離心；將沉淀用熱水沖洗3次，然后向沉淀中加10ml濃度為2mol/L的鹽酸，蓋上玻蓋，混勻，置沸水浴中，不時(shí)攪拌下沸騰45min;冷卻后離心，將上清液移入100ml容量瓶中；向容量瓶中加1滴酚酞，用NaOH中和至顯玫瑰色，稀釋至刻度，隨后將其過濾至燒杯中，棄去最初濾出的幾滴濾液。用DNS法測(cè)定溶液中的還原糖，即取2ml濾液于試管中并加入1.5mlDNS試劑，于沸水浴中5min，冷卻，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，并對(duì)照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的半纖維素含量。DNS試劑的配制方法6.3g3，5_二硝基水楊酸和262ml2mol/LNaOH溶液，加到500ml含185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解。冷卻后加蒸餾水定容至1000ml，貯于棕色瓶中備用。木質(zhì)素將煙稈粉碎后過30目篩，稱取O.lg煙稈粉末，裝入離心管中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%醋酸10ml，搖勻后離心。將沉淀用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%醋酸5ml洗一次，然后加3-4ml乙醇和乙醚混合液(體積比l:1)，浸泡3min，棄去上清液，共浸洗3次。將離心管中的沉淀在沸水浴中蒸干，然后向沉淀中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)72%的硫酸3ml，用玻棒攪勻，室溫下靜置16h，使全部纖維素溶解。然后向試管中加入10ml蒸餾水，用玻棒攪勻，置沸水浴中5min，冷卻后加5ml蒸餾水和0.5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的氯化鋇溶液，搖勻，離心。沉淀用蒸餾水沖洗2次，再向沖洗過的木質(zhì)素沉淀中加10ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的硫酸和0.lmol/L重鉻酸鉀溶液，將試管放入沸水浴中15min，不時(shí)攪拌。冷卻后將試管中所有物質(zhì)轉(zhuǎn)入燒杯中作滴定用，并用15-20ml蒸餾水洗滌殘余部分。然后向燒杯中加入5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%KI溶液和lml質(zhì)量分?jǐn)?shù)O.5%淀粉液，用硫代硫酸鈉滴定。另外單獨(dú)滴定加入了10ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硫酸的0.lmol/L的重鉻酸鉀溶液10ml作為空白樣。木質(zhì)素含量按下式計(jì)算X=K(a-b)/(nX48)式中，"48"為lmolCnH1204相當(dāng)于硫代硫酸鈉的當(dāng)量數(shù)；K為硫代硫酸鈉濃度，mol/L;a為空白滴定所耗硫代硫酸鈉體積，ml;b為滴定溶液所耗硫代硫酸鈉體積，ml;n為煙稈粉質(zhì)量，g。結(jié)果表明，接種后24h煙稈上開始出現(xiàn)白色菌絲，至48h時(shí)已經(jīng)長(zhǎng)出大量的白色菌絲，而對(duì)照此時(shí)只有少量菌絲。培養(yǎng)48h時(shí)菌絲基本長(zhǎng)滿，而對(duì)照組此時(shí)僅有少量白色菌絲。隨后，布滿葉脈表面的菌絲大約可持續(xù)34天，同時(shí)產(chǎn)生大量的孢子。7天后，各處理的煙稈變軟、腐爛。接種P-l的煙稈降解率為40.5%，對(duì)照的降解率為27.7%(表1)。接種P-l后秸稈底物纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的分解率分別為50.6%、47.4%和35.2%，而對(duì)照組的分解率分別為31.4%、27.8%和20.7%。從以上數(shù)據(jù)可以看出接種高溫降解菌P-1可以顯著加快煙草秸稈的分解和其中成分的轉(zhuǎn)化，加速底物的分解和腐熟。表1煙草秸稈P-l固體發(fā)酵后煙稈、纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求一種煙草秸稈降解真菌，該菌株P(guān)-1屬于灰綠曲霉(Aspergillusglaucus)，2009年9月22日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCCNO.3304；其生物學(xué)特性為，初期菌落表面淺色、平坦，呈細(xì)小顆粒狀，隨著時(shí)間推移顆粒逐漸變密，顏色逐漸變?yōu)樯罹G色，并產(chǎn)生大量的分生孢子，分生孢子梗頂端膨大呈球形，表面以放射狀生出小梗，圓形的分生孢子串生于小梗頂端。2.權(quán)利要求1所述煙草秸稈降解真菌在降解煙稈方面的應(yīng)用。3.用權(quán)利要求1所述真菌制備降解煙草秸稈的菌劑，制備方法如下1)煙稈粉培養(yǎng)基的配制煙草秸稈粉末5g，(NH4)2S042g，KH2P04lg，MgS04*7H200.5g，瓊脂20g，水1000ml，pH自然，121。C高壓滅菌20min;2)液體培養(yǎng)基的配制煙草秸稈粉末5g，(NH4)2S042g，KH2P04lg，MgS047H200.5g，CaCl20.lg，蛋白胨0.lg，酵母膏0.lg，水1000ml，pH自然，121。C高壓滅菌20min;3)將權(quán)利要求1所述菌株P(guān)-l接種至煙稈粉固體培養(yǎng)基上，45t:條件下培養(yǎng)3-4d，取直徑0.8cm的菌餅1塊接種于上述液體培養(yǎng)基中，裝液量為體積比1/5、轉(zhuǎn)速170r/min，45t:條件下?lián)u床培養(yǎng)5d，培養(yǎng)物經(jīng)4層無菌紗布過濾后獲得孢子懸液菌劑。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的菌劑，其生產(chǎn)方法中所用烘干粉碎后的煙草秸稈粉末為粉碎后過30目篩，含水量質(zhì)量比1%以下。5.權(quán)利要求3或4所述菌劑在降解煙稈方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種煙草秸稈降解真菌及其菌劑，屬于廢棄物資源利用
技術(shù)領(lǐng)域：
。從豬糞堆肥中篩選得到一種能降解煙草秸稈的高溫真菌，該菌株P(guān)-1在CMC-剛果紅培養(yǎng)基上可產(chǎn)生水解圈，可以煙草秸稈為唯一碳源生長(zhǎng)。該菌株接種于液體培養(yǎng)基，接種量1％，45℃條件下?lián)u床培養(yǎng)5天(裝液量1/5，170r/min)，過濾出菌絲體獲得孢子懸液。試驗(yàn)表明，煙稈接種孢子懸液后，45℃條件下培養(yǎng)7天，煙稈失重率為40.5％，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解率分別為50.6％、47.4％和35.2％。本發(fā)明是利用微生物發(fā)酵方法降解廢棄煙草秸稈使其轉(zhuǎn)化為有機(jī)肥料，變廢為寶、保護(hù)環(huán)境，具有廣闊的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C05F11/08GK101701192SQ20091023357公開日2010年5月5日申請(qǐng)日期2009年10月29日優(yōu)先權(quán)日2009年10月29日發(fā)明者冉煒,張楠,楊興明,沈其榮,沈標(biāo),黃啟為申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)