專利名稱：象草的快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種象草的快速繁殖方法，屬于植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域。
二背景技術(shù)：
象草(Pennisetum Purpureum Schumach)又名紫狼尾草，為禾本科狼尾草屬多年生草本植物，原產(chǎn)熱帶非洲，適宜在熱帶和亞熱帶地區(qū)栽培。象草不僅可作為草食畜禽和水
產(chǎn)魚類的優(yōu)質(zhì)青飼料，優(yōu)質(zhì)紙漿和中高檔復(fù)合人造板的理想原料，還是重要的生物質(zhì)能源作物，國內(nèi)外種植面積正在迅速擴(kuò)大。 盡管象草為多年生草本植物，但在我國長江中下游及其相同緯度地區(qū)不能自然開
花結(jié)實(shí)，即使結(jié)實(shí)，也由于種子成熟期不一、易于落粒和發(fā)芽率極低的原因，國內(nèi)外象草繁殖通常采用生長2個(gè)月左右的莖節(jié)為材料無性擴(kuò)繁，具有繁殖系數(shù)低、操作費(fèi)力費(fèi)工的不足。江洪如等以矮象草幼嫩莖節(jié)為外植體，建立了矮象草的試管快繁技術(shù)體系(如江洪如，佘發(fā)新，王碧琴，劉騰云.矮象草的試管快繁技術(shù)研究，2003 :472，中國重要會(huì)議全文數(shù)據(jù)庫)，有效利用了幼嫩莖節(jié)，具有較高的繁殖系數(shù)；鐘小仙等以象草幼穗為外植體，建立了"象草體細(xì)胞培養(yǎng)植株再生方法"(ZL 200610085256. 2)，為利用象草幼穗進(jìn)行種苗擴(kuò)繁提供了可能，但存在現(xiàn)有幼穗離體培養(yǎng)不能誘導(dǎo)叢生苗，繁殖系數(shù)低的不足。本方法以象草幼穗為材料，通過改進(jìn)培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，經(jīng)幼穗愈傷組織誘導(dǎo)、叢生苗誘導(dǎo)以及增殖和壯根培養(yǎng)，具有繁殖率高、操作簡便的特點(diǎn)，為象草的快速繁殖提供了又一有效方法。
三
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以象草幼穗為外植體進(jìn)行快速繁殖的方法，彌補(bǔ)現(xiàn)有象草繁殖技術(shù)以利用莖節(jié)為主的不足；通過改進(jìn)培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，改進(jìn)現(xiàn)有象草幼穗離體培養(yǎng)植株再生方法，通過誘導(dǎo)叢生苗，提高繁殖系數(shù)。 本發(fā)明的技術(shù)方案如下 利用象草幼穗為外植體，通過不同激素配比和改善光照條件，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和分化，促使愈傷組織直接分化為叢生苗，經(jīng)叢生苗增殖和壯根培養(yǎng)，1個(gè)象草幼穗可產(chǎn)生85 406株細(xì)胞工程苗。 具體步驟如下 ①外植體的選擇與滅菌 選用象草的幼穗為外植體，在無菌條件下用70%的酒精徹底擦拭包在幼穗外部的葉鞘和莖，剝出幼穗，切成2 3mm長的片段；
②幼穗愈傷組織誘導(dǎo) 把幼穗的切段接種于下列培養(yǎng)基中改良的MS(MS中鐵鹽含量加倍)+4. 0mg/L2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D)+0. 05mg/L激動(dòng)素(KT)+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂條+0. 5g/L活性碳，pH值為5. 8 ;培養(yǎng)室溫度為26°C 28。C，光強(qiáng)1500 2000Lx，光照時(shí)間為16小時(shí)/天，培養(yǎng)時(shí)間為35 40d ;
③叢生苗誘導(dǎo) 將幼穗誘導(dǎo)的顆粒狀愈傷組織培養(yǎng)于下列培養(yǎng)基中改良的MS+3 4mg/L6-BA (或3 4mg/L KT) +30g/L蔗糖+8g/L瓊脂條+0. 5g/L活性碳，pH值為5. 8 ;培養(yǎng)室溫度為26°C 28。C，光強(qiáng)2500 3000Lx，光照時(shí)間為16小時(shí)/天，培養(yǎng)時(shí)間為30 35d ;
④叢生苗增殖和壯根培養(yǎng) 將叢生苗中具有3張完整葉的分蘗在無菌條件切割分離后，分別接種于下列培養(yǎng)基中:MS+4mg/L 6-BA(或4mg/L KT)+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂條+0. 5g/L活性碳，pH值為5. 8 ;培養(yǎng)室溫度為26°C 28。C，光強(qiáng)3500 45000Lx，光照時(shí)間為16小時(shí)/天，培養(yǎng)時(shí)間為25 30d。 (2)細(xì)胞工程苗的苗床移栽 將上述根系發(fā)達(dá)、生長良好的細(xì)胞工程苗，移栽至溫室或大田苗床，環(huán)境溫度控制在25 35°C ;苗床的土壤具有較好的肥力，排灌方便，去除雜草，精細(xì)整地，做畦，畦長自定，畦寬l 1.5米為宜，行株距為20 25cmX10 15cm，移栽時(shí)澆透水，7d內(nèi)保持土壤濕潤，14 20d時(shí)，可施用尿素2 3kg/666. 7m2，施肥后雍根，并把尿素埋入土中，生長30d
以后，可作為種苗向大田移栽。
有益效果 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果 以象草幼穗為外植體，1個(gè)幼穗產(chǎn)生的愈傷組織可分成2 3mm左右的愈傷組織團(tuán)60 96塊，愈傷組織塊30 40d分化培養(yǎng)，再生植株的頻率80%以上，叢生苗誘導(dǎo)率75%以上，每個(gè)叢生苗具有3張完整葉片的分蘗有2 8個(gè)，增殖和壯根培養(yǎng)后，1個(gè)幼穗1次擴(kuò)繁可產(chǎn)生細(xì)胞工程苗85 406株細(xì)胞工程苗，平均細(xì)胞工程苗繁殖系數(shù)為198株/穗；細(xì)胞工程苗溫室或大田苗床移栽成活率達(dá)98%，生長30d以后，可作為種苗用于大田種植，以1株大田生長的象草有效分蘗穗30個(gè)計(jì)，1株象草幼穗通過本方法可繁殖5811株種苗，象草按株行距40cmX40cm大田種植計(jì)，可滿足約1. 4畝大田象草種植的需要。
四

圖1幼穗誘導(dǎo)的愈傷組織
圖2愈傷組織分化的叢生苗
五具體實(shí)施例方式(1)外植體的選擇與滅菌 10月下旬至11月上旬，選用自然分化孕穗的象草N51 (公知公用，白淑娟，張運(yùn)昌，陳德新.雜交狼尾草親本花期及主要植物學(xué)性狀[J].中國草地，1996，(3) :49-52)的幼穗為外植體，在無菌條件下用70%的酒精徹底擦拭包在幼穗外部的葉鞘和莖，剝出幼穗。幼穗長度小于2cm，直接接種；幼穗長度2 5cm，切成2 3mm長的穗段；幼穗長度超過5cm，則取幼穗基部5cm以內(nèi)部分，同樣切成2 3mm長的穗段。
(2)幼穗愈傷組織誘導(dǎo) 把幼穗的切段接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)時(shí)間為30 35d，培養(yǎng)室溫度為26°C 28。C，光強(qiáng)1500 2000Lx，光照時(shí)間為16小時(shí)/天。培養(yǎng)基配方為改良的MS(MS中鐵鹽含量加倍)+4. 0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)+0. 05mg/L激動(dòng)素(KT)+30g/L蔗 糖+8g/L瓊脂條+0. 5g/L活性碳，pH值為5. 8，統(tǒng)計(jì)了 60個(gè)幼穗，愈傷組織誘導(dǎo)率為100%;
(3)叢生苗誘導(dǎo) 將幼穗誘導(dǎo)的顆粒狀愈傷組織分成2 3mm大小的愈傷組織團(tuán)，接種于叢生苗誘 導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間為30 35d，培養(yǎng)室溫度為26°C 28。C，光強(qiáng)2500 3000Lx，光照時(shí) 間為16小時(shí)；培養(yǎng)基配方為改良的MS+4mg/L 6-BA(或4mg/L KT)+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂 條+0. 5g/L活性碳，pH值為5. 8 ;統(tǒng)計(jì)了 48個(gè)幼穗誘導(dǎo)的愈傷組織，可分成2 3mm大小的 愈傷組織團(tuán)64-96塊，植株再生率(再生植株數(shù)/愈傷組織團(tuán)數(shù))平均為81%，2 8個(gè)分 蘗的叢生苗率(叢生苗數(shù)/再生植株數(shù))為75. 2% ;
(4)叢生苗增殖和壯根培養(yǎng) 將叢生苗中具有3張完整葉的分蘗在無菌條件切割分離后，分別接種于下列培養(yǎng) 基中MS+4mg/L 6-BA(或4mg/L KT)+308/1蔗糖+88/1瓊脂條+0. 5g/L活性碳，pH值為5. 8 ; 培養(yǎng)室溫度為26°C 28。C，光強(qiáng)3500 45000Lx，光照時(shí)間為16小時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間為25 30d ;1個(gè)幼穗產(chǎn)生莖和葉綠色、根系發(fā)育正常的細(xì)胞工程苗數(shù)為85 406株，30個(gè)幼穗產(chǎn) 生的細(xì)胞工程苗數(shù)總數(shù)為5930株，平均每個(gè)幼穗可生產(chǎn)細(xì)胞工程苗198株；
(5)細(xì)胞工程苗的苗床移栽 將細(xì)胞工程苗移栽至溫室，苗床環(huán)境溫度控制在25 35t:;苗床畦長6米， 畦寬1.5米，行株距為25X10cm，移栽時(shí)澆透水，7d內(nèi)保持土壤濕潤，15d時(shí)，施用尿素 2kg/666. 7m、施肥后雍根，并把尿素埋入土中，生長30d以后，可提供5811株生長健壯的種 苗供大田種植，細(xì)胞工程苗苗床移栽成活率達(dá)98%。
權(quán)利要求
象草的快速繁殖方法，其特征在于，(1)外植體的選擇與滅菌選用象草的幼穗為外植體，在無菌條件下用70％的酒精徹底擦拭包在幼穗外部的葉鞘和莖，剝出幼穗，切成2～3mm長的片段；(2)幼穗愈傷組織誘導(dǎo)把幼穗的切段接種于下列培養(yǎng)基中改良的MS+4.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D+0.05mg/L激動(dòng)素KT+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂條+0.5g/L活性碳，pH值為5.8；培養(yǎng)室溫度為26℃～28℃，光強(qiáng)1500～2000Lx，光照時(shí)間為16小時(shí)/天，培養(yǎng)時(shí)間為35～40d；其中改良的MS指的是MS中鐵鹽含量加倍；(3)叢生苗誘導(dǎo)將幼穗誘導(dǎo)的顆粒狀愈傷組織培養(yǎng)于下列培養(yǎng)基中改良的MS+3～4mg/L 6-芐基腺嘌呤6-BA或3～4mg/L KT+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂條+0.5g/L活性碳，pH值為5.8；培養(yǎng)室溫度為26℃～28℃，光強(qiáng)2500～3000Lx，光照時(shí)間為16小時(shí)/天，培養(yǎng)時(shí)間為30～35d；(4)叢生苗增殖和壯根培養(yǎng)將叢生苗中具有3張完整葉的分蘗在無菌條件切割分離后，分別接種于下列培養(yǎng)基中MS+3～4mg/L 6-BA或3～4mg/L KT+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂條+0.5g/L活性碳，pH值為5.8；培養(yǎng)室溫度為26℃～28℃，光強(qiáng)3500～45000Lx，光照時(shí)間為16小時(shí)/天，培養(yǎng)時(shí)間為25～30d；(5)細(xì)胞工程苗的苗床移栽將培養(yǎng)苗移栽至溫室或大田苗床，環(huán)境溫度控制在25～35℃；做畦，畦長自定，畦寬1～1.5米，行株距為20～25cm×10～15cm，移栽時(shí)澆透水，7d內(nèi)保持土壤濕潤，14～20d時(shí)，可施用尿素2～3kg/666.7m2，施肥后雍根，并把尿素埋入土中，生長超過30d，可作為種苗進(jìn)行大田移栽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種象草的快速繁殖方法，屬于植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域。以象草幼穗為材料，通過愈傷組織誘導(dǎo)、叢生苗誘導(dǎo)以及叢生苗增殖和壯根培養(yǎng)，進(jìn)行象草細(xì)胞工程苗的快速擴(kuò)繁；1個(gè)幼穗1次擴(kuò)繁可產(chǎn)生細(xì)胞工程苗85～406株，平均細(xì)胞工程苗繁殖系數(shù)為198株/穗，細(xì)胞工程苗溫室或大田苗床移栽成活率達(dá)98％，經(jīng)30d以上的生長，可作為種苗用于大田種植；本方法能改進(jìn)已建立的“象草體細(xì)胞培養(yǎng)植株再生方法”不能誘導(dǎo)叢生苗的不足，是現(xiàn)有象草種莖無性擴(kuò)繁和種莖細(xì)胞工程擴(kuò)繁技術(shù)的有益補(bǔ)充，具有繁殖系數(shù)高、取材方便和操作簡便的特點(diǎn)，為象草產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供技術(shù)支撐。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101703003SQ20091023492
公開日2010年5月12日 申請(qǐng)日期2009年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月20日
發(fā)明者張建麗, 梁流芳, 潘玉梅, 鐘小仙, 顧洪如 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院