專利名稱：一種簡易蛹蟲草菌種復壯的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于蛹蟲草培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種簡易蛹蟲草菌種復壯的方法。
背景技術：
近年來，很多研究表明人工培養(yǎng)的蛹蟲草化學成分及藥理作用與冬蟲夏草相似， 但價格卻遠遠低于冬蟲夏草，因此蛹蟲草的開發(fā)應用具有極大的潛在市場。人工培養(yǎng)蛹蟲 草是解決野生蟲草來源不足的良好途徑，然而人工培養(yǎng)過程中菌種退化現(xiàn)象嚴重是制約其 產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的一大瓶頸。影響人工培養(yǎng)蛹蟲草菌種退化的因素很多，簡單的可以分成兩大 類一類是菌株的遺傳特性造成菌種的退化(內(nèi)因)；另一類是培養(yǎng)條件、操作環(huán)節(jié)、環(huán)境因 素導致的菌種退化(外因)。梁宗琦(蛹蟲草的無性型及子實體人工培養(yǎng)研究，西南農(nóng)業(yè)學報，1990 (2))研究 了蛹草擬青霉(蛹蟲草無性型)的一個野生型菌株及其角變分離株的菌落特征、形態(tài)特征、 壽命及形成子實體能力的差異，結果表明角變菌株和野生型菌株除在顏色和產(chǎn)孢密度有明 顯差異外，在存活率與子實體形成能力方面也與野生型株不同，因此提出蛹蟲草無性型是 一個異核體真菌。有研究認為原因是異核體在繼代培養(yǎng)時，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的選擇作用使 真菌寄生性或腐生性核得到了不同積累。蛹蟲草菌種分離的原則是盡最大可能獲得優(yōu)良親本的遺傳特性，并通過無性繁殖 的方式保持其遺傳的穩(wěn)定性。由于最終的目的是獲得優(yōu)良形狀的子實體，所以，無論是野外 分離菌種或者是在培養(yǎng)過程中重新篩選優(yōu)良菌種，均是從子實體出發(fā)分離菌種。從整體的角度來看，蛹蟲草優(yōu)良菌種的獲得和遺傳穩(wěn)定性的保持主要取決于兩個 因素第一，有效分離物(親本完整遺傳信息)的獲得，即通過人工培養(yǎng)能夠獲得和親本性 狀一致或者更優(yōu)良的子實體；第二，親本的遺傳信息在無性繁殖增殖傳代培養(yǎng)過程中能夠 保持遺傳的穩(wěn)定性而不發(fā)生退化。目前，常用的復壯方法是采用活體蠶蛹接種來復壯蛹蟲草菌種，這種方法雖然能 夠使菌種復壯，但操作復雜、污染率高、成功率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、污染率低、生物轉化率高的蛹蟲草菌種復壯 的方法，該方法可用于規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明的蛹蟲草菌種復壯的方法包括以下步驟(1)蠶蛹的處理選取鮮活完整健康的蠶蛹，將蠶蛹僵化，在僵化的蠶蛹背部和腹 部各劃2-3個刀口。所述僵化是將鮮活完整健康的蠶蛹蒸10-15min ；或者將鮮活完整健康 的蠶蛹在60-85°C烘烤2-4小時。所述刀口的深度為表皮厚度，刀口不要太深，劃破表皮即可。(2)復壯培養(yǎng)基的制備在培養(yǎng)容器、優(yōu)選在培養(yǎng)盒中加入輔助培養(yǎng)基，將僵化的 蠶蛹背部朝上平鋪在輔助培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)容器封口，在121°C滅菌20min。所述輔助培養(yǎng)基是水瓊脂，其用來在培養(yǎng)過程中補充水分和固定蠶蛹；或者是大米培養(yǎng)基，其用來補充蠶 蛹生長過程中所需要的水分、固定蠶蛹，以及補充一部分養(yǎng)分。優(yōu)選大米培養(yǎng)基。輔助培養(yǎng) 基的量以不超過僵化的蠶蛹的三分之二為宜。(3)接種培養(yǎng)接種液體菌種，即將培養(yǎng)好的液體菌種稀釋后，接種在冷卻的培養(yǎng) 容器內(nèi)，將菌種均勻的分布在培養(yǎng)基表面。所述液體菌種是將干燥菌種在無菌狀態(tài)下粉碎 后通過搖瓶液體培養(yǎng)得到，使用前稀釋5-10倍。(4)菌絲培養(yǎng)將培養(yǎng)容器置于培養(yǎng)室中，適宜溫度為18_25°C，濕度為70_85%， 避光培養(yǎng)7-8天。(5)子實體培養(yǎng)在接種后待菌絲布滿整個蠶蛹，開始見光，但避免太陽光直射。 若培養(yǎng)室光線太暗，可補充日光燈照。菌絲見光后，在蠶蛹表面或四周見有桔黃色色素形 成，并出現(xiàn)米粒狀的桔黃色菌蕾，菌蕾伸長后即成為子實體。子實體培養(yǎng)階段，溫度應為 20-23°C，超過25°C生長緩慢，超過27°C菌絲萎縮不能出菌束。濕度應提高到80-85%。在 子實體培養(yǎng)后期，逐漸加大室內(nèi)空氣的流通和交換，在培養(yǎng)階段若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)室存在污染應 立即清除。(6)復壯菌種的獲得對從接種的蠶蛹背部切口處長出的子實體進行組織分離， 即可獲得復壯菌種。所述子實體選自條形整齊、顏色橙黃或橙紅、個體高大粗壯的子實體。本發(fā)明的蛹蟲草菌種復壯的方法操作簡單、污染率低、成功率高，而且由于培養(yǎng)基 中水分的添加，增加了培養(yǎng)容器中的小環(huán)境濕度，延長了生長時間，提高了僵化的蠶蛹的生 物轉化率。本發(fā)明不但能夠較為容易的復壯菌種，而且可以作為一種采用活蠶蛹生產(chǎn)蛹蟲 草的方法。本發(fā)明采用高溫高壓滅菌的蠶蛹，并在適當增加營養(yǎng)成分和水分后進行菌種復 壯；而傳統(tǒng)的采用活體蠶蛹注射復壯的方法，只是對蠶蛹進行表面消毒，所以污染率很高。 因此，與活體蠶蛹注射復壯的方法相比，本發(fā)明具有污染率低、成功率高、操作簡單及蠶蛹 生物轉化率高等優(yōu)點。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。所用材料菌種采用常規(guī)蛹蟲草菌株，編號為SX-08。液體搖瓶用培養(yǎng)基去皮土豆300克(煮汁)、葡萄糖10克、蛋白胨2克、磷酸二 氫鉀0. 5克、硫酸鎂1克、水1000毫升，PH自然。柞蠶蛹市售的產(chǎn)自東北的新鮮活體柞蠶蛹。大米培養(yǎng)基營養(yǎng)液(按黃豆2%、葡萄糖1%、奶粉5%、磷酸二氫鉀0.5%、硫酸 鎂0.05%、維生素BllOmg/lOOOml的比例配成營養(yǎng)液，調(diào)整pH至7. 2)與大米按照1.5 1 的比例混合。培養(yǎng)盒采用PP材料制成。實施例1蛹蟲草菌種的復壯方法將鮮活完整健康的蠶蛹50只平鋪在籠屜上開鍋蒸15min使其僵化，室溫冷卻后將 僵化的蠶蛹從頭至尾用解剖刀在背部和腹部各劃3個刀口。
在培養(yǎng)盒中加入大米40克、液體營養(yǎng)液60克，將5只僵化的蠶蛹背部朝上平鋪在 營養(yǎng)液中。然后將培養(yǎng)盒封口，在121°C滅菌20min。將干燥菌種在無菌狀態(tài)下粉碎，用液體搖瓶用培養(yǎng)基在22°C、140rpm的條件下避 光培養(yǎng)120小時。將培養(yǎng)好的液體菌種稀釋10倍后，接種在冷卻的培養(yǎng)盒內(nèi)，將菌種均勻 地分布在培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)室的溫度為18°C，濕度為70%，避光培養(yǎng)8天。待菌絲布滿整個蠶蛹，開始見 光，避免太陽光直射。菌絲見光后，在蠶蛹表面或四周可見桔黃色色素形成，并出現(xiàn)米粒狀 的桔黃色菌蕾，菌蕾伸長后即成為子實體。在子實體培養(yǎng)階段，溫度為22°C，濕度為85%。最后，從上述獲得的子實體中篩選條形整齊、顏色橙黃或橙紅、個體高大粗壯的子 實體進行組織分離，即可獲得復壯菌種。實施例2蛹蟲草菌種的復壯方法將鮮活完整健康的蠶蛹50只平鋪在搪瓷托盤上，在85°C烘箱中烘烤20分鐘，取出 托盤在室溫冷卻，然后將僵化的蠶蛹從頭至尾用解剖刀在背部和腹部各劃3個刀口。在培養(yǎng)盒中加入大米40克、液體營養(yǎng)液60克，將5只僵化的蠶蛹背部朝上平鋪在 營養(yǎng)液中。然后將培養(yǎng)盒封口，在121°C滅菌20min。將干燥菌種在無菌狀態(tài)下粉碎，用液體搖瓶用培養(yǎng)基在22°C、140rpm的條件下避 光培養(yǎng)120小時。將培養(yǎng)好的液體菌種稀釋10倍后，接種在冷卻的培養(yǎng)盒內(nèi)，將菌種均勻 地分布在培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)室的溫度為18°C，濕度為70%，避光培養(yǎng)8天。待菌絲布滿整個蠶蛹，開始見 光，避免太陽光直射。菌絲見光后，在蠶蛹表面或四周可見桔黃色色素形成，并出現(xiàn)米粒狀 的桔黃色菌蕾，菌蕾伸長后即成為子實體。在子實體培養(yǎng)階段，溫度為22°C，濕度為85%。最后，從上述獲得的子實體中篩選條形整齊、顏色橙黃或橙紅、個體高大粗壯的子 實體進行組織分離，即可獲得復壯菌種。權利要求
1.一種蛹蟲草菌種復壯的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將鮮活完整健康的蠶蛹僵化，在僵化的蠶蛹背部和腹部各劃2-3個刀口；(2)將僵化的蠶蛹背部朝上平鋪在輔助培養(yǎng)基中，在121°C滅菌20min；(3)接種液體菌種，然后進行菌絲培養(yǎng)和子實體培養(yǎng)；及(4)對從接種的蠶蛹背部切口處長出的子實體進行組織分離。
2.如權利要求1所述的蛹蟲草菌種復壯的方法，其特征在于，所述僵化是將所述蠶蛹 蒸10-15min或在60_85°C烘烤2-4小時。
3.如權利要求1所述的蛹蟲草菌種復壯的方法，其特征在于，所述刀口的深度為表皮 厚度。
4.如權利要求1所述的蛹蟲草菌種復壯的方法，其特征在于，所述輔助培養(yǎng)基是水瓊 脂或大米培養(yǎng)基。
5.如權利要求1所述的蛹蟲草菌種復壯的方法，其特征在于，所述輔助培養(yǎng)基的量不 超過所述僵化的蠶蛹的三分之二。
6.如權利要求1所述的蛹蟲草菌種復壯的方法，其特征在于，所述液體菌種是將干燥 菌種在無菌狀態(tài)下粉碎后通過搖瓶液體培養(yǎng)得到，使用前稀釋5-10倍。
7.如權利要求1-6任一項所述的蛹蟲草菌種復壯的方法，其特征在于，步驟(4)所述的 子實體為條形整齊、顏色橙黃或橙紅、個體高大粗壯的子實體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種簡易蛹蟲草菌種復壯的方法。該方法包括步驟將鮮活完整健康的蠶蛹僵化，在僵化的蠶蛹背部和腹部各劃2-3個刀口；將僵化的蠶蛹背部朝上平鋪在輔助培養(yǎng)基中，在121℃滅菌20min；接種液體菌種，進行菌絲培養(yǎng)和子實體培養(yǎng)；然后對從接種的蠶蛹背部切口處長出的子實體進行組織分離。本發(fā)明采用高溫高壓滅菌的蠶蛹，并在適當增加營養(yǎng)成分和水分后進行菌種復壯，與傳統(tǒng)的采用活體蠶蛹注射復壯的方法相比，具有污染率低、成功率高、操作簡單及蠶蛹生物轉化率高等優(yōu)點。
文檔編號A01G1/04GK102037856SQ20091023632
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月16日 優(yōu)先權日2009年10月16日
發(fā)明者王旭明, 蘇堅宏, 蘇炳豪, 邢禮軍, 馬榮才 申請人:北京農(nóng)業(yè)生物技術研究中心, 江門市鴻豪生物科技有限公司