專利名稱：抗除草劑的草類物種的開發(fā)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文所揭示的本發(fā)明大致涉及對選擇性除草劑具有抗性的草類和開發(fā)所述草類 的方法。
背景技術(shù)：
海雀稗(Seashore paspalum/Paspalum vaginatum)是一種溫季草坪草,一般適 合于沙丘環(huán)境。海雀稗的有利性質(zhì)包括其對鹽、水浸和干旱的耐受性。這些特征使得雀稗 屬(paspalum)成為用于任何或所有這些環(huán)境問題都會成為問題的比賽場地的優(yōu)質(zhì)草坪草 候選者。舉例來說，高爾夫球場設(shè)計師推薦海雀稗用于鹽或水質(zhì)會影響草坪草生長和維護 的熱帶或亞熱帶沿海地區(qū)的新球場。另外，許多現(xiàn)有的高爾夫球場已用雀稗屬替代狗牙根 (bermudagrass/Cynodon dactylon)。與狗牙根相比，雀稗屬需要的氮氣更少并且對用含鹽 或劣質(zhì)水沖洗的耐受性更好，這會降低管理成本并改善沖冼靈活性。用雀稗屬替代狗牙根的主要局限性是狗牙根的重新建植。狗牙根具有高競爭性并 且一旦建植就難以去除。狗牙根和其它似雜草的草類會大大降低雀稗屬草坪的審美價值和 質(zhì)量。因此，需要控制或限制雀稗屬繁殖區(qū)中的狗牙根或似雜草的草類生長。為控制雀稗 屬繁殖草坪草區(qū)中的似雜草的草類的生長，需要開發(fā)對選擇性除草劑具有抗性的雀稗屬草 坪草。過去開發(fā)抗除草劑的草坪草的方法包括使用基因工程方法。然而，由于政府關(guān)于使 用基因改造植物的條例和限制，因此通過基因工程方法制造的植物可能難以商業(yè)化。因此， 本發(fā)明的實施例包括開發(fā)對除草劑具有非轉(zhuǎn)基因抗性的草坪草栽培品種，以及具有轉(zhuǎn)基因 抗性的栽培品種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的實施例涉及一種選擇和培養(yǎng)的來自黍亞科群組的抗乙酰輔酶A羧化酶 抑制劑除草劑的植物，或其組織、種子或子代。在一些實施例中，從已經(jīng)歷選擇方法的抗 除草劑的未分化細胞再生抗乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑的植物，其中所述選擇方法包 括從黍亞科群組的植物提供未分化細胞的愈合組織，使所述愈合組織與足以延緩生長或 殺死愈合組織的量的至少一種除草劑接觸，基于所述除草劑的不同作用選擇至少一種抗性 細胞，和從所述至少一種抗性細胞再生所述品種的能生存的整個植物。在一些實施例中，所 述植物是非轉(zhuǎn)基因植物。在本發(fā)明的一些實施例中，抗乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑的植物是黍族 (Paniceae)的成員。在一些實施例中，抗乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑的植物是一種選 自以下的群組的植物地毯草屬(Axonopus)(地毯草(carpetgrass))、馬唐屬(Digiteria) (馬唐草(crabgrass))、稗屬(Echinochloa)、黍?qū)?Panicum)、雀稗屬(Paspalum)(百喜草 (Bahiagrass))(Pennisetum)(Setaria)禾口 1 卩十胃屬(Stenotaphrum) (圣奧古斯丁草(St. Augustine grass))。在一些實施例中，抗乙酰輔酶A羧化酶抑制劑 除草劑的植物是一種選自以下的群組的植物海雀稗(seashore paspalum/P. vaginatum)、剪股穎屬草(bent grass)、高羊茅草(tall fescue grass)、結(jié)縷草(Zoysiagrass)、狗 牙根(狗牙根屬(Cynodon spp))、草地早熟禾(Kentucky Bluegrass)、得克薩斯早熟 7^ (Texas Bluegrass) > H^Jft (Perennial ryegrass) > Sf 41 ^ (buffalograss/Buchloe dactyloides)、百足草(假儉草(Eremochloa ophiuroides))和圣奧古斯丁草(偏序鈍葉 胃(Stenotaphrum secundatum)) > WMM- ( WMiM-M )禾口 15 胃(Bahiagrass/Paspalum notatum)。在本發(fā)明的一些實施例中，抗乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑的植物對乙酰輔 酶A羧化酶(ACCase)抑制劑具有抗性。在一些實施例中，抗乙酰輔酶A羧化酶抑制劑 除草劑的植物對環(huán)己二酮除草劑、丙酸芳氧基苯氧酯除草劑、苯基吡唑啉除草劑或其混 合物具有抗性。在一些實施例中，抗乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑的植物對至少一 種選自以下的群組的除草劑具有抗性禾草滅(alloxydim)、丁苯草酮(butroxydim)、 氯丙氧定(cloproxydim)、環(huán)苯草酮(profoxydim)、稀禾定(sethoxydim)、環(huán)苯草酮 (clefoxydim)、克草同(clethodim)、環(huán)殺草(cycloxydim)、得殺草(tepraloxydim)、苯草 酮(tralkoxydim)、炔禾靈(chloraizfop)、炔草酸(clodinafop)、氯伏草(clofop)、賽伏草 (cyhalofop)、禾草靈(diclofop)、惡唑禾草靈(fenoxaprop)、噻唑禾草靈(fenthiaprop) > 精吡氟禾草靈(fluazaf op-butyl)、吡氟禾草靈(fluazifop)、合氯氟(haloxyfop)、異 惡草醚(isoxapyrifop)、惡唑酰草胺(metamifop)、普拔草(propaquizafop)、快伏草 (quizalofop)、三氟丙酸(trifop)和唑啉草酯(pinoxaden)。在本發(fā)明的一些實施例中，抗乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑的植物的除草劑抗 性是通過乙酰輔酶A羧化酶基因的至少一個選自以下的群組的氨基酸位置的突變來賦予 1756、1781、1999、2027、2041、2078、2099和2096。在一些實施例中，除草劑抗性是通過氨基 酸位置1781的異亮氨酸突變成亮氨酸來賦予。本發(fā)明的實施例還涉及一種如任一上述段落中所述的抗乙酰輔酶A羧化酶抑制 劑除草劑的植物的子代。在一些實施例中，所述子代是抗乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑 的植物親代有性繁殖的結(jié)果。在一些實施例中，所述子代是抗乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除 草劑的植物親代無性繁殖的結(jié)果。本發(fā)明的實施例還涉及一種如任一上述段落中所述的抗乙酰輔酶A羧化酶抑制 劑除草劑的植物的種子或其子代。本發(fā)明的實施例涉及包含如任一上述段落中所述的抗乙酰輔酶A羧化酶抑制劑 除草劑的植物或其子代或種子的草地。本發(fā)明的實施例還涉及一種包含如任一上述段落中 所述的抗乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑的植物或其子代或種子的草坪草苗圃地。在本發(fā) 明的實施例中，提供一種包含如任一上述段落中所述的抗乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑 的植物或其子代或種子的商業(yè)草坪、高爾夫球場或牧場。本發(fā)明的實施例還涉及一種從黍亞科群組中鑒別抗除草劑植物的方法，其包括 從黍亞科群組的植物提供未分化細胞的愈合組織，使所述愈合組織與足以延緩生長或殺 死愈合組織的量的至少一種除草劑接觸，基于所述除草劑的不同作用選擇至少一種抗性細 胞，和從所述至少一種抗性細胞再生所述品種的能生存的整個植物，其中所述再生植物對 至少一種除草劑具有抗性。在一些實施例中，所述方法進一步包括將至少一種抗性細胞擴 增為多種未分化細胞。在一些實施例中，從非轉(zhuǎn)基因植物提供未分化細胞的愈合組織。
7
在本發(fā)明的一些實施例中，方法中所提供的植物是一種選自黍族的植物。在一 些實施例中，所述植物是一種選自以下的群組的植物地毯草屬(地毯草)、馬唐屬(馬唐 草)、稗屬、黍?qū)?、雀稗?百喜草)、狼尾草屬、狗尾草屬和鈍葉草屬(圣奧古斯丁草)。在 一些實施例中，所述植物是一種選自以下的群組的植物海雀稗、剪股穎屬草(剪股穎屬 (Agrostis spp))、高羊茅草(tall fescue)、結(jié)縷草、狗牙根(狗牙根屬)、草地早熟禾、得 克薩斯早熟禾、黑麥草、野牛草、百足草(假儉草)和圣奧古斯丁草(偏序鈍葉草)、地毯草 (地毯草屬)和百喜草。在本發(fā)明的一些實施例中，方法中所使用的至少一種除草劑是乙酰輔酶A羧化酶 (ACCase)抑制劑。在一些實施例中，至少一種除草劑是選自以下的群組禾草滅、丁苯草 酮、氯丙氧定、環(huán)苯草酮、稀禾定、環(huán)苯草酮、克草同、環(huán)殺草、得殺草、苯草酮、炔禾靈、炔草 酸、氯伏草、賽伏草、禾草靈、惡唑禾草靈、噻唑禾草靈、精吡氟禾草靈、吡氟禾草靈、合氯氟、 異惡草醚、惡唑酰草胺、普拔草、快伏草、三氟丙酸及唑啉草酯。在本發(fā)明的一些實施例中，植物的除草劑抗性是通過乙酰輔酶A羧化酶基因的選 自以下的群組的至少一個氨基酸位置的突變來賦予1756、1781、1999、2027、2041、2078、 2099和2096。在一些實施例中，除草劑抗性是通過氨基酸位置1781的異亮氨酸突變成亮 氨酸來賦予。本發(fā)明的實施例還涉及一種抗除草劑植物的可再生細胞的組織培養(yǎng)，其是通過如 上述段落中所述的方法來進行。在本發(fā)明的實施例中，一種控制抗除草劑植物附近的雜草的方法，其中所述抗除 草劑植物是通過上述段落中所述的方法來鑒別，所述方法包括使至少一種除草劑與所述 雜草和抗除草劑植物接觸，其中所述至少一種除草劑是以足以抑制同一物種的非選擇植物 生長或足以抑制雜草生長的速率與雜草和植物接觸。在一些實施例中，抗除草劑植物對乙 酰輔酶A羧化酶(ACCase)抑制劑具有抗性。在一些實施例中，方法包括使除草劑直接與抗 除草劑植物接觸。在一些實施例中，方法包括使除草劑與抗除草劑植物所在的生長培養(yǎng)基 接觸。在一些實施例中，抗除草劑植物對環(huán)己二酮除草劑、丙酸芳氧基苯氧酯除草劑、苯 基吡唑啉除草劑或其混合物具有抗性。在一些實施例中，抗除草劑植物是非轉(zhuǎn)基因植物。在本發(fā)明的一些實施例中，植物的除草劑抗性是通過乙酰輔酶A羧化酶基因的至 少一個選自以下的群組的氨基酸位置的突變來賦予1756、1781、1999、2027、2041、2078、 2099和2096。在一些實施例中，除草劑抗性是通過乙酰輔酶A羧化酶基因的氨基酸位置 1781的異亮氨酸突變成亮氨酸來賦予。在一些實施例中，方法中所使用的至少一種除草劑是選自以下的群組禾草滅、丁 苯草酮、氯丙氧定、環(huán)苯草酮、稀禾定、環(huán)苯草酮、克草同、環(huán)殺草、得殺草、苯草酮、炔禾靈、 炔草酸、氯伏草、賽伏草、禾草靈、惡唑禾草靈、噻唑禾草靈、精吡氟禾草靈、吡氟禾草靈、合 氯氟、異惡草醚、惡唑酰草胺、普拔草、快伏草、三氟丙酸及唑啉草酯。本發(fā)明的實施例涉及一種以ATCC寄存編號_寄存的海雀稗特異性DNA標(biāo)
記，或其能夠鑒別抗除草劑的草類栽培品種的片段。在一些實施例中，海雀稗特異性DNA標(biāo) 記包含SEQ ID NO 5或其片段。本發(fā)明的實施例還涉及一種鑒別抗除草劑植物的方法，其包括獲得植物的遺傳
8學(xué)樣品，和測定所述樣品中存在或不存在乙酰輔酶A羧化酶基因的位置1781的突變，其中 存在位置1781的突變指示植物具有除草劑抗性。還涵蓋乙酰輔酶A羧化酶的位置1781的 標(biāo)記在鑒別抗除草劑植物的方法中的用途。本發(fā)明的實施例涉及一種標(biāo)記輔助育種的方法，其包括以下步驟鑒別所關(guān)注用 于育種和選擇的特征，其中所述特征與乙酰輔酶A羧化酶基因有關(guān)；提供帶有能夠賦予植 物對乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑的抗性的乙酰輔酶A羧化酶序列變異體的第一植物， 其中所述植物進一步包含所關(guān)注之特征；用第二植物培育所述第一植物；鑒別育種步驟的 子代為具有所述乙酰輔酶A羧化酶序列變異體；和基于所述鑒別步驟選擇可能具有所關(guān)注 的特征的子代。在一些實施例中，所述特征選自性狀或基因。在一些實施例中，所述性狀 是至少一種選自由以下組成的群組的性狀除草劑耐受性、疾病抗性、害蟲昆蟲抗性、脂肪 酸改變、蛋白質(zhì)或碳水化合物代謝、生長速率增加、脅迫耐受性增強、優(yōu)先成熟、感官性質(zhì)增 強、形態(tài)特征改變、不能繁殖、其它農(nóng)業(yè)性狀、工業(yè)用途的性狀或改善消費者吸引力的性狀。在本發(fā)明的一些實施例中，方法中所包括的乙酰輔酶A羧化酶序列變異體包括以 下至少一個位置的變化:1756、1783、1999、2027、2041、2078、2099和2096。在一些實施例 中，植物抗性所針對的除草劑是至少一種選自以下的群組的除草劑禾草滅、丁苯草酮、氯 丙氧定、環(huán)苯草酮、稀禾定、環(huán)苯草酮、克草同、環(huán)殺草、得殺草、苯草酮、炔禾靈、炔草酸、氯 伏草、賽伏草、禾草靈、惡唑禾草靈、噻唑禾草靈、精吡氟禾草靈、吡氟禾草靈、合氯氟、異惡 草醚、惡唑酰草胺、普拔草、快伏草、三氟丙酸及唑啉草酯.在一些實施例中，方法中所包括的鑒別步驟包括選自以下的過程序列變異體的 分子檢測、乙酰輔酶A羧化酶抑制劑抗性的觀察和通過應(yīng)用乙酰輔酶A羧化酶抑制劑進行 選擇。本發(fā)明的實施例涉及一種用包含具有從ATCC寄存編號_的序列衍生的
至少250個堿基的DNA區(qū)段轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，和其子代植物。在一些實施例中，所述子代 植物選自回交子代、雜交、克隆子代和同胞交配子代。在一些實施例中，所述DNA區(qū)段包含 從SEQ ID NO 5衍生的至少個250堿基。本發(fā)明的實施例還涉及一種含有包含從ATCC寄存編號_的序列衍生的
至少250個堿基的DNA區(qū)段的轉(zhuǎn)化細胞。在一些實施例中，所述DNA區(qū)段包含從SEQ ID NO 5衍生的至少個250堿基。在本發(fā)明的實施例中，提供一種鑒別乙酰輔酶A羧化酶基因的位置1781的突變的 方法，所述方法包括從細胞獲得遺傳學(xué)樣品，通過在擴增步驟中使用SV384F引物和SV348R 引物來選擇性擴增DNA片段，和對所述DNA片段測序以確定存在或不存在乙酰輔酶A羧化 酶基因的位置1781的突變，其中DNA片段中存在突變指示細胞中存在位置1781的突變。


所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解下文所述的圖示僅用于說明性目的。所述圖示無論如 何也不打算限制本發(fā)明教示的范圍。圖1是植物的脂肪酸生物合成路徑的圖。圖2是用于如本文所揭示的選擇非轉(zhuǎn)基因抗除草劑植物的除草劑選擇方案的一 實施例的說明。
圖3是說明海雀稗的稀禾定劑量-反應(yīng)曲線的圖。圖4是生長于含有稀禾定的愈合組織誘發(fā)培養(yǎng)基上的海雀稗的抗稀禾定愈合組 織的照片。圖5是一系列色譜圖，其說明如本文所揭示而選擇的抗除草劑海雀稗植物的乙酰 輔酶A羧化酶基因的位置1781的氨基酸突變。圖6是說明在處理后7天(DAT)對照植物和如本文所揭示而選擇的抗除草劑植物 對kgment 稀禾定的反應(yīng)的照片。圖7是說明在處理后7天(DAT) kgment 稀禾定對對照植物和如本文所揭示而選 擇的抗除草劑植物的損傷的圖。圖8是說明在處理后14天(DAT)對照植物和如本文所揭示而選擇的抗除草劑植 物對kgment 稀禾定的反應(yīng)的照片。圖9是說明在處理后9天(DAT) kgment 稀禾定對對照植物和如本文所揭示而選 擇的抗除草劑植物的損傷的圖。圖10是說明在處理后21天(DAT)對照植物和如本文所揭示而選擇的抗除草劑植 物對kgment 稀禾定的反應(yīng)的照片。圖11是說明在處理后21天(DAT) kgment 稀禾定對對照植物和抗除草劑植物的 損傷的圖。圖12是說明在處理后42天(DAT)在用kgment 稀禾定處理后對照植物和如本 文所揭示而選擇的抗除草劑植物的平均干重的圖。圖13是說明在處理后21天(DAT)Poast 稀禾定對對照植物和如本文所揭示而選 擇的抗除草劑植物的損傷的圖。圖14是說明在處理后21天(DAT)Fusilade II 精吡氟禾草靈除草劑對對照植物 和如本文所揭示而選擇的抗除草劑植物的損傷的圖。圖15是說明在處理后21天(DAT)Acclaim Extra II精惡唑禾草靈 (fenoxaprop-p-butyl)除草劑對對照植物和抗除草劑植物的損傷的圖。圖16是由植物居間分生組織獲得的愈合組織產(chǎn)生的一實施例的說明。
具體實施例方式對選擇性除草劑的抗性可提供控制各種草坪草物種中的似雜草的草類的高效方 法。已提出用于開發(fā)抗除草劑植物的基因工程方法，然而由于政府關(guān)于使用基因改造植物 的條例和限制，因此這些方法可能難以商業(yè)化。相比之下，目前通過非轉(zhuǎn)基因方法得到的具 有除草劑抗性的植物的環(huán)境釋放不服從嚴(yán)格的政府條例。因此，本發(fā)明的實施例涉及篩選 和選擇抗除草劑的草坪草植物的方法，包括不通過轉(zhuǎn)基因而有效的方法。^X除非另作說明，否則所屬相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)根據(jù)常規(guī)用途來了解術(shù)語。如本文中所使用，術(shù)語“外植體”是指包括分生組織的植物組織。其也可指包括 (但不限于)一個或一個以上胚、子葉、下胚軸、葉基、中胚軸、胚芽、原生質(zhì)體和胚軸的植物 組織。如本文中所使用，術(shù)語“愈合組織”是指可生長或維持在培養(yǎng)基中以產(chǎn)生遺傳一致細胞的未分化的植物細胞塊。如本文中所使用，術(shù)語“抗除草劑”或“除草劑耐受”(包括其任何變化形式)是 指植物從與足以引起同一物種的非抗性植物的生長延緩或死亡的量的除草劑接觸中恢復(fù)、 在接觸后存活和/或茁壯成長。足以引起非抗性植物的生長或死亡的除草劑的量通常在約 2μΜ到約100 μ M除草劑濃度的范圍內(nèi)。在一些實施例中，除草劑的足夠量在約5μ M到約 50 μ M除草劑濃度、約8 μ M到約30 μ M除草劑濃度或約10 μ M到約25 μ M除草劑濃度的范 圍內(nèi)。或者，足以引起非抗性植物的生長或死亡的除草劑的量在每公頃約25克活性成分(g ai ha-1)到約6500g ai ha—1除草劑施用的范圍內(nèi)。在一些實施例中，除草劑的足夠量在約 50g ai ha—1到約5000g ai ha"1除草劑施用、約75g ai ha"1到約2500g ai ha"1除草劑施 用、約 IOOg ai ha4 到約 1500g ai ha—1 除草劑施用、或約 250g ai ha4 到約 IOOOg ai ha-1 除草劑施用的范圍內(nèi)。如本文中所使用，術(shù)語“標(biāo)記輔助選擇”是指通過檢測與所需性狀有關(guān)的一個或一 個以上標(biāo)記來選擇植物的所需性狀的過程。所述標(biāo)記可為表型標(biāo)記，例如除草劑或抗生素 抗性。而且，所述標(biāo)記可為分子標(biāo)記，例如一種或一種以上多態(tài)現(xiàn)象(如下文所述)、DNA或 RNA酶、或容易檢測的其它序列。對于個別植物為“外源性”的多核苷酸是通過除有性雜交外的任何方法引入植物 中的多核苷酸。下文描述可用來完成的方法的實例，并且包括轉(zhuǎn)化、基因槍法、電穿孔等。所 述含有外源性核酸的植物是稱作Rtl (用于在活體外從轉(zhuǎn)化細胞再生的植物)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植 物。R。還可指無論是轉(zhuǎn)基因還是非轉(zhuǎn)基因的任何其它再生植物。如本文中所使用，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”描述含有人工改造的基因組的非天然存在的植 物，其中所述植物在其基因組中包括外源性核酸分子，所述分子可來源于相同物種或不同 物種，包括非植物物種。外源性核酸分子可為基因調(diào)控元件，諸如啟動子、增強子或其它調(diào) 控元件，或可含有可與天然或異源基因調(diào)控元件有關(guān)的編碼序列。通過有性雜交或通過自 體受精產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物是所述植物的子代。如本文中所使用，“多態(tài)現(xiàn)象”意思是在一個或一個以上個體的群體中核酸序列的 一個或一個以上基因座存在一個或一個以上變化。所述變化可包含(但不限于)一個或一 個以上堿基變化、一個或一個以上核苷酸插入或一個或一個以上核苷酸缺失。多態(tài)現(xiàn)象包 括單核苷酸多態(tài)現(xiàn)象(SNP)、簡單序列重復(fù)(SSR)、插入缺失(indel)(插入和缺失)、限制 片段長度多態(tài)現(xiàn)象、單倍體和標(biāo)記SNP。另外，多態(tài)現(xiàn)象可包括遺傳標(biāo)記、基因、DNA衍生序 列、RNA衍生序列、啟動子、基因的5 ‘未翻譯區(qū)、基因的3 ‘未翻譯區(qū)、微小RNA (microRNA)、 siRNA、定量性狀基因座(quantitative trait locus，QTL)、衛(wèi)星標(biāo)記、轉(zhuǎn)基因、mRNA、ds mRNA、轉(zhuǎn)錄概況或甲基化模式。多態(tài)現(xiàn)象可由核酸復(fù)制的隨機處理、通過突變誘發(fā)、由移動 基因組元件、由拷貝數(shù)變化和在減數(shù)分裂過程期間引起，諸如不等交換、基因組加倍和染色 體破壞和融合。變化可常見于群體中或可較低頻率地存在于群體中，前者在普通植物育種 方面具有較大效用且后者可能與稀少但重要的表型變化相關(guān)。如本文中所使用，“標(biāo)記”是指多態(tài)核酸序列或核酸特征。在更廣泛的方面，“標(biāo)記” 可為可用于區(qū)別有機體之間的可遺傳差異的可檢測特征。所述特征的實例可包括遺傳標(biāo) 記、蛋白質(zhì)組成、蛋白質(zhì)水平、油組成、油水平、碳水化合物組成、碳水化合物水平、脂肪酸組 成、脂肪酸水平、氨基酸組成、氨基酸水平、生物聚合物、藥物、淀粉組成、淀粉水平、可發(fā)酵淀粉、發(fā)酵產(chǎn)率、發(fā)酵效率、能量產(chǎn)率、次要化合物、代謝物、形態(tài)特征和農(nóng)業(yè)學(xué)特征。如本文所使用，“標(biāo)記分析”指的是一種使用特定方法檢測特定基因座的多態(tài)性的 方法，例如測量至少一種表型(例如種子顏色、花朵顏色或其他可目測的性狀)、限制性片 段長度多態(tài)性(RFLP)、單堿基延伸、電泳、序列比對、等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASO)、 隨機擴增多態(tài)DNA(RAPD)、基于微陣列的技術(shù)和核酸定序技術(shù)等。如本文所使用，“基因型”指的是表型的遺傳組成，且此可使用標(biāo)記物間接表征或 通過核酸定序直接表征。適合標(biāo)記物包括表型特征、代謝特征、遺傳標(biāo)記或一些其他類型的 標(biāo)記物?；蛐涂蓸?gòu)成至少一種遺傳標(biāo)記物基因座的等位基因或至少一種單倍體窗的單倍 體。在一些實施例中，基因型可表示單個基因座，且在其他實施例中，可表示全基因組的基 因座。在一些實施例中，基因型可以反映部分染色體、整個染色體、部分基因組和整個基因 組的序列。如本文所使用，“數(shù)量性狀基因座(QTL) ”指的是數(shù)量上控制到一定程度的基因座， 其可表示一般連續(xù)分布的形狀。如本文所使用，“核酸序列片段”指的是聚核苷酸的一部分核苷酸序列或多肽的一 部分胺基酸序列。核苷酸序列的片段可以編碼保留天然或相應(yīng)全長蛋白質(zhì)的生物活性的蛋 白質(zhì)片段。核苷酸序列的片段范圍為至少約20個核苷酸、約50個核苷酸、約100個核苷酸、 約250個核苷酸，且至多基因的全長核苷酸序列或編碼本文所揭示蛋白質(zhì)的序列。供篩選的適合植物本發(fā)明的實施例針對由除草劑抗性細胞(所述細胞已經(jīng)歷除草劑選擇過程)再 生的黍亞科(Panicodae)除草劑抗性植物，以及其識別方法。所述植物可以從以下各物 的群組中選出柳葉箬族(Isachneae tribe)、Neurachneae 族、Arundinellaeae 族和黍 族(Paniceae tribe)。在一些實施例中，所述植物可為選自表A或表B中所提供的清單的 屬的任何成員。適用于本發(fā)明的例示性(非詳盡)植物清單包括黍族的成員，例如地毯草 (Carpetgrass)、馬唐草、百喜草、圣奧古斯丁草(St. Augustine grass)和栗(millet)，包 括狐尾草(Foxtail)(谷子(Setaria italical))、珍珠粟(Pearl，Pennisetam glaucum) 禾口泰(Proso,Panicum miliaceum ；通常禾爾為“常見，，泰、高梁泰(broom corn millet)、赤泰 (hog millet)或白黍子(white millet)。在一些實施例中，所述植物為具有商業(yè)應(yīng)用價值的草坪草種類，例如高爾夫球場、 田徑場、商業(yè)綠化、商業(yè)或家庭草坪、和牧場。例示性草坪草種類包括(但不限于)海雀 稗、百喜草、狗牙根(狗牙根屬)、blue gramma grass、野牛草、地毯草(地毯草屬)、百足 草(假儉草)、克育草(kikuyugrass)、垂穗草(sideoats grama)、圣奧古斯丁草(偏序鈍 葉草)、結(jié)縷草、一年生早熟禾(annual bluegrass)、一年生黑麥草(annual ryegrass)、加 拿大早熟禾(Canada bluegrass)、細葉型羊茅(chewings fescue)、細弱剪股穎(colonial bentgrass) ^1 ' ! !! (creeping bentgrass)、^水草(crested wheatgrass)、扁 (fairway wheatgrass)、硬羊茅(hard fescue)、草地早熟禾(Kentucky bluegrass)、得克 薩斯早熟禾、果園草(orchard grass)、黑麥草、紅牛毛草(red fescue)、紅頂草(redtop)、 粗蓮苗系草(rough bluegrass)、羊茅(sheep fescue)、無芒雀麥(smooth bromegrass)、 高羊茅草、貓尾草(Timothygrass)、絨毛剪股穎(velvet bentgrass)、堿茅(weeping alkaligrass)、納托爾氏臉茅(western wheatgrass)等。
表A.黍亞科屬成員(根據(jù)族編組)
權(quán)利要求
1.一種選擇和培養(yǎng)的乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑抗性植物，其來自黍亞科 (Panicodae)群或其組織、種子或子代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑抗性植物，其由經(jīng)受選擇方 法的除草劑抗性未分化細胞再生，其中所述選擇方法包含提供來自所述黍亞科群的植物的未分化細胞的愈合組織；使所述愈合組織與至少一種足以延緩所述愈合組織生長或殺死所述愈合組織的量的 除草劑接觸；基于所述除草劑的差別作用，選擇至少一個抗性細胞；和由所述至少一個抗性細胞再生所述種類的活的全植物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑抗性植物，其中所述植物為 黍族(tribe Paniceae)的成員。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑抗性植物，其中所述植物為 選自以下群組的一種地毯草屬(Axonopus)(地毯草(carpetgrass))、馬唐屬(Digiteria) (馬唐草(Crabgrass))、稗屬(Echinochloa)、黍?qū)?Panicum)、雀稗屬(Paspalum)(百喜草 (Bahiagrass))(Pennisetum)(Setaria)禾口 1 卩十胃屬(Stenotaphrum) (圣奧古其J 丁草(St. Augustine grass))。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑抗性植物，其中所述植物 為選自以下群組的一種海濱雀稗(seashore paspalum)(海雀稗(P. vaginatum))、剪股 穎屬草(bent grass)、高羊茅草(tall fescue grass)、結(jié)縷草(Zoysiagrass)、狗牙根 (bermudagrass)(狗牙根屬(Cynodon spp))、草地早熟禾(Kentucky Bluegrass)、得克薩(Texas Bluegrass)、黑胃胃(Perennial ryegrass) > Sf 41 ^ (buffalograss/ Buchloe dactyloides)、百足草(centipede grass)(假儉草(Eremochloa ophiuroides)) 和圣奧古斯丁草(偏序鈍葉草(Menotaphrum secundatum))、地毯草(地毯草屬)和百喜 (Bahiagrass/Paspalum notatum)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑抗性植物，其中所述植物對 乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)抑制劑有抗性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑抗性植物，其中所述 植物對環(huán)己二酮(cyclohexanedione)除草劑、芳氧基苯氧基丙酸酯(aryloxyphenoxy proprionate)除草劑、苯基吡唑啉(phenylpyrazoline)除草劑或其混合物有抗性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑抗性植物，其中所述除草劑 抗性是由選自以下群組的乙酰輔酶A羧化酶基因的至少一個氨基酸位置上的突變所賦予 1756、1781、1999、2027、2041、2078、2099 和 2096。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑抗性植物，其中所述除草劑 抗性是由氨基酸位置1781上異亮氨酸突變成亮氨酸所賦予。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑抗性植物，其中所述植物 對至少一種選自以下群組的除草劑有抗性禾草滅(alloxydim)、丁苯草酮(butroxydim)、 氯丙氧定(cloproxydim)、環(huán)苯草酮(profoxydim)、稀禾定(sethoxydim)、環(huán)苯草酮 (clefoxydim)、克草同(clethodim)、環(huán)殺草(cycloxydim)、得殺草(tepraloxydim)、苯 草酮(tralkoxydim)、炔禾靈(chloraizfop)、炔草酸(clodinafop)、氯伏草(clofop)、賽伏草(cyhalofop)、禾草靈(diclofop)、精惡唑禾草靈(fenoxaprop)、噻唑禾草 靈(fenthiaprop)、精 口比氣禾草靈(fluazafop-butyl)、口比氣禾草靈(fluazifop)、 合氯氟(haloxyfop)、異惡草醚(isoxapyrifop)、惡唑酰草胺(metamifop)、普拔草 (propaquizafop)、快伏草(quizalofop)、三氟丙酸(trifop)禾口唑啉草酉旨(pinoxaden)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑抗性植物，其中所述植物為 非轉(zhuǎn)基因植物。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一權(quán)利要求所述的乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑 抗性植物的子代。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的子代，其中所述子代為所述乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草 劑抗性植物親本株有性繁殖的結(jié)果。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的子代，其中所述子代為所述乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草 劑抗性植物親本株無性繁殖的結(jié)果。
15.一種根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一權(quán)利要求所述的乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑 抗性植物的種子。
16.一種根據(jù)權(quán)利要求12所述的子代的種子。
17.一種根據(jù)權(quán)利要求13所述的子代的種子。
18.一種根據(jù)權(quán)利要求14所述的子代的種子。
19.一種草皮，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一權(quán)利要求所述的乙酰輔酶A羧化酶 抑制劑除草劑抗性植物或其子代或種子。
20.一種草皮草苗圃地，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一權(quán)利要求所述的乙酰輔酶 A羧化酶抑制劑除草劑抗性植物或其子代或種子。
21.一種商用草地、高爾夫球場或田野，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一權(quán)利要求所 述的乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑抗性植物或其子代或種子。
22.—種鑒別來自黍亞科群的除草劑抗性植物的方法，其包含提供來自所述黍亞科群的植物的未分化細胞的愈合組織；使所述愈合組織與至少一種足以延緩所述愈合組織生長或殺死所述愈合組織的量的 除草劑接觸；基于所述除草劑的差別作用，選擇至少一個抗性細胞；和由所述至少一個抗性細胞再生所述種類的活的全植物，其中所述再生植物對所述至少一種除草劑有抗性。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其另外包含將所述至少一個抗性細胞擴大至多個未 分化細胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述植物為選自黍族的一種。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中所述植物為選自以下群組的一種地毯草屬 (地毯草)、馬唐屬(馬唐草)、稗屬、黍?qū)佟⑷赴迣?百喜草)、狼尾草屬、狗尾草屬和鈍葉草 屬(圣奧古斯丁草)。
26.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中所述植物為選自以下群組的一種海濱雀稗 (海雀稗)、剪股穎屬草(剪股穎屬(Agrostis spp))、高羊茅草、結(jié)縷草、狗牙根(狗牙根 屬)、草地早熟禾、得克薩斯早熟禾、黑麥草、野牛草、百足草(假儉草)和圣奧古斯丁草(偏序鈍葉草)、地毯草(地毯草屬)和百喜草。
27.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述至少一種除草劑為乙酰輔酶A羧化酶 (ACCase)抑制劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述除草劑抗性是由選自以下群組的乙酰輔酶 A羧化酶基因的至少一個氨基酸位置上的突變所賦予1756、1781、1999、2027、2041、2078、 2099 和 2096。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的方法，其中所述除草劑抗性是由氨基酸位置1781上異亮氨 酸突變成亮氨酸所賦予。
30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述至少一種除草劑選自以下群組禾草滅、丁 苯草酮、氯丙氧定、環(huán)苯草酮、稀禾定、環(huán)苯草酮、克草同、環(huán)殺草、得殺草、苯草酮、炔禾靈、 炔草酸、氯伏草、賽伏草、禾草靈、精惡唑禾草靈、噻唑禾草靈、精吡氟禾草靈、吡氟禾草靈、 合氯氟、異惡草醚、惡唑酰草胺、普拔草、快伏草、三氟丙酸和唑啉草酯。
31.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中未分化細胞的所述愈合組織由非轉(zhuǎn)基因植物提{共。
32.—種通過根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法鑒別的除草劑抗性植物的可再生細胞的組 織培養(yǎng)物。
33.一種控制通過根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法鑒別的除草劑抗性植物附近的雜草的 方法，其包含使至少一種除草劑與所述雜草和所述除草劑抗性植物接觸，其中所述至少一 種除草劑以足以抑制同一物種的未選擇植物生長或足以抑制所述雜草生長的施用量與所 述雜草和所述植物接觸。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述除草劑抗性植物對乙酰輔酶A羧化酶 (ACCase)抑制劑有抗性。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述除草劑抗性植物對環(huán)己二酮除草劑、芳氧 基苯氧基丙酸酯除草劑、苯基吡唑啉除草劑或其混合物有抗性。
36.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述植物中的所述除草劑抗性是由選自以下 群組的乙酰輔酶A羧化酶基因的至少一個氨基酸位置上的突變所賦予1756、1781、1999、 2027、2041、2078、2099 和 2096。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述除草劑抗性是由所述乙酰輔酶A羧化酶基 因的氨基酸位置1781上異亮氨酸突變成亮氨酸所賦予。
38.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述至少一種除草劑選自以下群組禾草滅、丁 苯草酮、氯丙氧定、環(huán)苯草酮、稀禾定、環(huán)苯草酮、克草同、環(huán)殺草、得殺草、苯草酮、炔禾靈、 炔草酸、氯伏草、賽伏草、禾草靈、精惡唑禾草靈、噻唑禾草靈、精吡氟禾草靈、吡氟禾草靈、 合氯氟、異惡草醚、惡唑酰草胺、普拔草、快伏草、三氟丙酸和唑啉草酯。
39.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述除草劑抗性植物為非轉(zhuǎn)基因植物。
40.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其包含使所述除草劑直接與所述除草劑抗性植物接觸。
41.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其包含使所述除草劑與所述除草劑抗性植物所處的生長培養(yǎng)基接觸。
42.一種寄存為ATCC寄存編號_的海濱雀稗特異性DNA標(biāo)記物或其片段，其能夠鑒別除草劑抗性草栽培品種。
43.一種鑒別除草劑抗性植物的方法，其包含獲得植物的遺傳樣品；和分析所述樣品中是否存在乙酰輔酶A羧化酶基因的位置1781上的突變，其中位置1781 上存在突變表明所述植物具有除草劑抗性。
44.一種乙酰輔酶A羧化酶的位置1781上的標(biāo)記物的用途，其用于鑒別除草劑抗性植 物的方法中。
45.一種標(biāo)記物輔助的培育方法，其包含以下步驟鑒別用于培育和選擇的相關(guān)特征，其中所述特征與乙酰輔酶A羧化酶基因有關(guān)聯(lián)；提供攜帶能夠賦予所述植物乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑抗性的乙酰輔酶A羧化酶 序列變異體的第一植物，其中所述植物另外包含所述相關(guān)特征；將所述第一植物與第二植物一起培育；鑒別所述培育步驟中具有所述乙酰輔酶A羧化酶序列變異體的子代；和基于所述鑒別步驟，選擇可能具有所述相關(guān)特征的子代。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述特征選自性狀或基因。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述性狀為選自由以下組成的群組的至少一 種除草劑耐性，抗病性，抗蟲性，脂肪酸、蛋白質(zhì)或碳水化合物代謝改變，生長速度提高，脅 迫耐性增強，優(yōu)選的成熟，感官性質(zhì)增強，地貌特征改變，無菌，其他農(nóng)業(yè)性狀，工業(yè)用途的 性狀，或提高消費者吸引力的性狀。
48.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述乙酰輔酶A羧化酶序列變異體包含至少一 個以下位置的變異1756、1781、1999、2027、2041、2078、2099 和 2096。
49.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述除草劑選自禾草滅、丁苯草酮、氯丙氧定、 環(huán)苯草酮、稀禾定、環(huán)苯草酮、克草同、環(huán)殺草、得殺草、苯草酮、炔禾靈、炔草酸、氯伏草、賽 伏草、禾草靈、精惡唑禾草靈、噻唑禾草靈、精吡氟禾草靈、吡氟禾草靈、合氯氟、異惡草醚、 惡唑酰草胺、普拔草、快伏草、三氟丙酸和唑啉草酯。
50.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述鑒別步驟包含選自以下的方法序列變異 體的分子檢測、觀測對乙酰輔酶A羧化酶抑制劑的抗性、和通過應(yīng)用乙酰輔酶A羧化酶抑制 劑來選擇。
51.一種轉(zhuǎn)基因植物，其經(jīng)源于SEQ ID NO :5的包含至少250個堿基的DNA區(qū)段轉(zhuǎn)化。
52.一種根據(jù)權(quán)利要求51所述的植物的子代植物。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的子代植物，其中所述子代選自回交子代、雜種、克隆子代和 同胞交配子代。
54.一種轉(zhuǎn)化細胞，其含有源于SEQ ID NO 5的包含至少250個堿基的DNA區(qū)段。
55.一種鑒別細胞中乙酰輔酶A羧化酶基因的位置1781上的突變的方法，其包含從細胞獲得遺傳樣品；通過在擴增步驟中使用SV384F引物和SV348R引物，選擇性地擴增DNA片段；和對所述DNA片段測序，以確定所述乙酰輔酶A羧化酶基因的位置1781上是否存在突變，其中所述DNA片段中存在突變表明所述細胞中位置1781上存在所述突變。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種選擇和培養(yǎng)的來自黍亞科(Panicodae)群組的抗乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)抑制劑除草劑的植物，或其組織、種子或子代，和選擇所述植物的方法。本發(fā)明還涉及控制抗乙酰輔酶A羧化酶抑制劑除草劑的植物附近的雜草的方法。
文檔編號A01H5/00GK102083303SQ200980123049
公開日2011年6月1日 申請日期2009年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月20日
發(fā)明者保羅·L·雷默, 道格拉斯·赫卡特, 韋恩·艾倫·帕羅特 申請人:喬治亞大學(xué)研究基金會公司