專(zhuān)利名稱(chēng)：鑒定大豆中亞洲大豆銹病抗性數(shù)量性狀基因座的方法和其組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物育種和疾病抗性的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明包括培育含有數(shù)量性 狀基因座的大豆植物的方法，所述大豆植物與對(duì)豆薯層銹菌iPhakopsora pachyrhizi)和 山馬蝗層銹菌力引起的亞洲大豆銹病(ASR)的抗性相關(guān)。本發(fā)明進(jìn) 一步包括種質(zhì)、賦予對(duì)ASR的抗性的新的數(shù)量性狀基因座(QTL)，以及在為了對(duì)ASR的抗性 的育種計(jì)劃中將新的QTL種質(zhì)滲入到優(yōu)良種質(zhì)中的方法。
背景技術(shù)：
XM^Glycirw max (L. )Merril是在世界范圍內(nèi)生長(zhǎng)的作為植物油和蛋白質(zhì)的原始來(lái) 源的主要經(jīng)濟(jì)作物之一(Sinclair and Backman, Compendium of Soybean Diseases, 3rd Ed. APS Press, St. Paul, MN, p. 106 (1989))。低膽固醇和高纖維膳食的不斷增長(zhǎng)的 需求也提高了大豆作為健康食品的重要性。在美國(guó)大豆產(chǎn)量每年受到疾病的負(fù)面影響。每公頃的高產(chǎn)量對(duì)于農(nóng)戶(hù)的利潤(rùn)率是 關(guān)鍵的，特別是在大豆的低價(jià)格時(shí)期期間。由大豆疾病引起的財(cái)務(wù)損失對(duì)于農(nóng)村經(jīng)濟(jì)以及 對(duì)市區(qū)的聯(lián)合產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)是重要的。這些損失的效應(yīng)最終傳遍世界范圍內(nèi)的大豆市場(chǎng)。亞洲大豆銹病(在此稱(chēng)為ASR)已經(jīng)在東半球和西半球被報(bào)道。在東半球，ASR在 澳大利亞、中國(guó)、印度、日本、臺(tái)灣地區(qū)和泰國(guó)被報(bào)道。在西半球，ASR已經(jīng)在巴西、哥倫比 亞、哥斯達(dá)黎加和波多黎各被觀察到。ASR可能是毀滅性的疾病，如在臺(tái)灣的某些地區(qū)報(bào)道 的，引起高達(dá)70到80%的損失。嚴(yán)重感染的植物僅有更少的豆莢和質(zhì)量不良的更小的種子 (Frederick et al., Mycology 92: 217-227 (2002))。ASR 在 1994 年在美國(guó)夏威夷被首 次觀察到。后來(lái)在2004年秋季ASR傳播到美國(guó)陸地，推測(cè)是熱帶風(fēng)暴活動(dòng)的結(jié)果。模型預(yù) 測(cè)表明，ASR在整個(gè)美國(guó)東南部廣泛分布，隨后的田間和實(shí)驗(yàn)室觀察確認(rèn)了這種分布。兩個(gè)真菌物種，豆薯層銹菌Sydow和山馬蝗層銹菌(Arthur)Arthur引起ASR。不 象其他的銹病，豆薯層銹菌和山馬蝗層銹菌感染異乎尋常地廣泛的植物物種。已知豆薯層 銹菌天然地感染豆類(lèi)的17個(gè)屬中的31個(gè)物種，以及在有控制的條件下感染沈個(gè)其他屬的 60個(gè)物種。已知豆薯層銹菌天然地感染豆類(lèi)的19個(gè)屬中的42個(gè)物種，以及12個(gè)其他屬的 18個(gè)其他物種被人工地感染。19個(gè)屬中的二十四個(gè)植物物種是兩種菌的宿主(Frederick et al.，Mycology 92·. 217-227 (2002))。評(píng)估可能潛在地含有賦予對(duì)ASR的抗性的QTL的植物是費(fèi)時(shí)的，需要大量的生物學(xué)防范空間。培養(yǎng)豆薯層銹菌需要使用批準(zhǔn)的生物防范通風(fēng)櫥。此外，用于生長(zhǎng)ASR 抗性測(cè)試的植物的溫室和生長(zhǎng)箱必需以防止生物體的事故性釋放的方式建造，特別是在 還沒(méi)有觀察到這些生物體的地區(qū)。豆薯層銹菌的不同的培養(yǎng)物可能保持有不同的毒力 因子。隨著時(shí)間的過(guò)去，新的豆薯層銹菌菌株可能被引入美國(guó)。兩種主要宿主是豆薯 iPachyrhizuserosus (L. )Urban)禾口豆工豆(K/gftaiffigi/iciz/aia (L. )ffalp.),者β在佛羅里達(dá)發(fā) 現(xiàn)。豆薯層銹菌和山馬蝗層銹菌一個(gè)廣泛自然化的宿主是野葛(/^eraria mcmtana(Umr.) Merr. var. Iobata (ffilld. ) Maesen & S. Μ. Almeida ex Sanjappa & Predeep)。由于 野葛是在美國(guó)東南方部常見(jiàn)的雜草，它可能充當(dāng)接種體的持續(xù)不斷的來(lái)源。豆薯層銹菌和 山馬蝗層銹菌是同種寄生的(沒(méi)有交替寄主)和短生活史的(具有夏孢子和冬孢子芽孢期)， 僅在活的宿主上專(zhuān)性病原體存活和繁殖。其他宿主可能充當(dāng)病原體的越冬儲(chǔ)主，以及接種 體的構(gòu)建體。病原體非常適合于長(zhǎng)距離散布，因?yàn)殒咦涌梢员伙L(fēng)容易地?cái)y帶，使得它成為進(jìn) 入新的無(wú)銹病區(qū)域的理想的手段。傳播的最初的手段是孢子，其可以被風(fēng)或落下的雨水?dāng)y
市ο由于豆薯層銹菌的不同培養(yǎng)物可能保持針對(duì)已知的和懷疑的抗性基因的不同的 毒力因子，于是在大豆基因組中不同的ASR抗性基因座預(yù)期對(duì)于它們所賦予抗性的豆薯層 銹菌和/或山馬蝗層銹菌的菌株是不同的。因而，被設(shè)計(jì)以將針對(duì)ASR的抗性培育入大豆 中的任何育種計(jì)劃將可能需要涉及來(lái)自大豆基因組中不同的抗性基因座的多因子抗性，以 賦予針對(duì)ASR的強(qiáng)的抗性，無(wú)論豆薯層銹菌群體如何變化。并且，培育在其他地理位置使用 的大豆作物需要選擇對(duì)影響這些區(qū)域的具體菌株的抗性，除了提供這些區(qū)域中農(nóng)民喜歡的 那些農(nóng)學(xué)性狀之外。因此存在著強(qiáng)大的動(dòng)機(jī)來(lái)鑒定大豆中新的ASR抗性基因座，以及將期 望的等位基因種質(zhì)滲入到優(yōu)良的大豆種質(zhì)中。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了方法來(lái)評(píng)估可能潛在地含有賦予 對(duì)ASR的抗性的QTL的植物(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)NO. 20080166699)。發(fā)明概述
本發(fā)明提供了將等位基因種質(zhì)滲入到大豆植物中的方法，包括使至少一種ASR抗性 大豆植物與至少一種其他大豆植物雜交以形成群體；用來(lái)自由ASR抗性基因座14、15和16 構(gòu)成的組的至少一種核酸標(biāo)志物篩選所述群體，來(lái)確定來(lái)自所述群體的一種或更多種大豆 植物是否含有來(lái)自由ASR抗性等位基因1到8構(gòu)成的組的至少一種ASR抗性等位基因。在 各種實(shí)施方式中，所述至少一種標(biāo)志物位于所述抗性等位基因的30 cM、15 cM、5 cM或1 cM 之內(nèi)，或所述抗性等位基因的IMbUOO Kb或1 Kb之內(nèi)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)以下產(chǎn)生的優(yōu)良大豆植物，包括使至少一種 ASR抗性大豆植物與至少一種其他大豆植物雜交以形成群體；用來(lái)自由ASR抗性基因座14、 15和16構(gòu)成的組的至少一種核酸標(biāo)志物篩選所述群體，來(lái)確定來(lái)自所述群體的一種或更 多種大豆植物是否含有來(lái)自由ASR抗性等位基因1到8構(gòu)成的組的至少一種ASR抗性等 位基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述優(yōu)良大豆植物展現(xiàn)了至少一種轉(zhuǎn)基因性狀。在更具體的 實(shí)施方式中，所述至少一種轉(zhuǎn)基因性狀可以是除草劑耐受性、提高的產(chǎn)量、昆蟲(chóng)控制、真菌 病抗性、病毒抗性、線蟲(chóng)抗性、細(xì)菌病抗性、支原體病抗性、修飾的油生產(chǎn)、高油生產(chǎn)、高蛋白 質(zhì)生產(chǎn)、萌芽和幼苗生長(zhǎng)控制、增強(qiáng)的動(dòng)物和人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)、低棉籽糖、環(huán)境壓力抗性、提高的可 消化性、改進(jìn)的加工性狀、改進(jìn)的風(fēng)味、氮固定、雜交種子生產(chǎn)、降低的變應(yīng)原性或其任何組 合。在又更具體的實(shí)施方式中，除草劑耐受性可以為草甘膦、麥草畏、草銨膦、磺酰脲、溴苯腈、2，4-二氯苯氧乙酸、達(dá)草滅除草劑或其任何組合來(lái)賦予。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述優(yōu) 良大豆植物展現(xiàn)了對(duì)ASR誘導(dǎo)真菌的至少一個(gè)種類(lèi)的至少部分抗性，更具體地，所述ASR誘 導(dǎo)真菌可以是豆薯層銹菌或山馬蝗層銹菌或兩者。本發(fā)明還提供了將至少一種ASR抗性等位基因種質(zhì)滲入到大豆植物中的方法，包 括步驟使ASR抗性大豆植物與第二大豆植物雜交以形成群體；用選自由SEQ ID N0:1到 8和SEQ ID NO :73到80構(gòu)成的組的至少一種核酸標(biāo)志物篩選所述群體；從所述群體中選 擇出包含與ASR抗性大豆植物相應(yīng)的至少一種基因型的至少一種大豆植物。在特定的實(shí)施 方式中，所述選擇的大豆植物展現(xiàn)了如此處描述的、不差于約3、或不差于約2的對(duì)ASR的 抗性反應(yīng)分級(jí)。在更特別的實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括分析所述選擇的大豆植物對(duì) ASR誘導(dǎo)病原體的抗性的步驟。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，所述基因型通過(guò)單堿基延伸 (SBE)、等位基因特異性引物延伸測(cè)序(ASPE)、DNA測(cè)序、RNA測(cè)序、基于微陣列的分析、普通 PCR、等位基因特異性延伸、雜交、質(zhì)譜法、連接、延伸-連接或Flap核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的分析 來(lái)測(cè)定。在再更特定的實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括使所述選擇的大豆植物與另一種 大豆植物雜交的步驟；以及更進(jìn)一步包括從所述選擇的大豆植物獲得種子的步驟。在又一 個(gè)特定的實(shí)施方式中，所述群體中至少一種大豆植物針對(duì)選自由SEQ ID NO :1和2構(gòu)成的 組的大豆基因組DNA標(biāo)志物，以及針對(duì)SEQ ID NO :3來(lái)基因分型。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了優(yōu)良大豆植物，其通過(guò)以下產(chǎn)生
使ASR抗性大豆植物與第二大豆植物雜交以形成群體；用選自由SEQ ID NO 1到8和 SEQ ID NO :73到80構(gòu)成的組的至少一種核酸標(biāo)志物篩選所述群體；從所述群體中選擇包 含與ASR抗性大豆植物相應(yīng)的至少一種基因型的一種或更多種大豆植物。在一個(gè)實(shí)施方式 中，所述優(yōu)良大豆植物展現(xiàn)了至少一種轉(zhuǎn)基因性狀。在更具體的實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)基因性 狀可以是除草劑耐受性、提高的產(chǎn)量、昆蟲(chóng)控制、真菌病抗性、病毒抗性、線蟲(chóng)抗性、細(xì)菌病 抗性、支原體病抗性、修飾的油生產(chǎn)、高油生產(chǎn)、高蛋白質(zhì)生產(chǎn)、萌芽和幼苗生長(zhǎng)控制、增強(qiáng) 的動(dòng)物和人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)、低棉籽糖、環(huán)境壓力抗性、提高的可消化性、改進(jìn)的加工性狀、改進(jìn)的風(fēng) 味、氮固定、雜交種子生產(chǎn)、降低的變應(yīng)原性或其任何組合。在又更具體的實(shí)施方式中，除草 劑耐受性可以為草甘膦、麥草畏、草銨膦、磺酰脲、溴苯腈、2，4-二氯苯氧乙酸、達(dá)草滅除草 劑或其任何組合來(lái)賦予。在又其他的實(shí)施方式中，所述優(yōu)良大豆植物展現(xiàn)了對(duì)ASR誘導(dǎo)真 菌的至少一個(gè)種類(lèi)的至少部分抗性，更具體地，所述ASR誘導(dǎo)真菌可以是豆薯層銹菌或山 馬蝗層銹菌或兩者。本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)與ASR抗性相關(guān)的基因座的基本上純化的核酸分子，包 括選自由SEQ ID NO 1到SEQ ID NO 80和其互補(bǔ)物構(gòu)成的組的核酸序列。進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了至少15、16、17、18或20個(gè)核苷酸的分離的核酸分子，其 與包括或鄰近于多態(tài)性的大豆DNA的任一鏈中相同長(zhǎng)度的序列具有至少90%的同一性，用 于檢測(cè)代表所述多態(tài)性的分子標(biāo)志物，其中所述分子標(biāo)志物選自由SEQ ID NO :1到8構(gòu)成 的組。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了至少15、16、17、18或20個(gè)核苷酸的分離的核酸 分子，其與包括或鄰近于多態(tài)性的大豆DNA的任一鏈中相同長(zhǎng)度的序列具有至少95%、或優(yōu) 選98%、或更優(yōu)選99%或甚至100%的同一性，用于檢測(cè)代表所述多態(tài)性的分子標(biāo)志物，其中 所述分子標(biāo)志物選自由SEQ ID NO :1到8構(gòu)成的組。在特定的實(shí)施方式中，所述分離的核 酸進(jìn)一步包含可檢測(cè)標(biāo)記物，或提供了可檢測(cè)標(biāo)記物的摻入。更特別地，所述可檢測(cè)標(biāo)記物
5可以是同位素、熒光團(tuán)、氧化劑、還原劑、核苷酸或半抗原。在又更特定的實(shí)施方式中，所述 可檢測(cè)標(biāo)記物可以通過(guò)化學(xué)反應(yīng)添加到核酸上，或通過(guò)酶反應(yīng)來(lái)?yè)饺?。在本發(fā)明的另一個(gè) 實(shí)施方式中，所述分離的核酸在嚴(yán)格雜交條件下與所述分子標(biāo)志物的至少一個(gè)等位基因雜 交。在更具體的實(shí)施方式中，所述分子標(biāo)志物是SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7或8;所述分離 的核酸是至少90%相同于提供的探針的寡核苷酸，所述提供的探針相應(yīng)于所述特定的分子 標(biāo)志物，其分別是:SEQ ID NO 25 和 26,27 和 28,29 和 30,31 和 32,33 和 34,35 和 36,37 和38、或39和40。本發(fā)明還提供了一組寡核苷酸，其包含一對(duì)寡核苷酸引物，各自長(zhǎng)度至少12個(gè) 連續(xù)核苷酸，允許包含分子標(biāo)志物或處于分子標(biāo)志物之內(nèi)的DNA片段的PCR擴(kuò)增，所述分子 標(biāo)志物選自由SEQ ID NO :1到8構(gòu)成的組；以及至少一種檢測(cè)寡核苷酸，其允許所述擴(kuò)增 的片段中多態(tài)性的檢測(cè)，其中所述檢測(cè)寡核苷酸的序列至少百分之95相同于包括或鄰近 于所述多態(tài)性的大豆DNA片段的任一鏈中相同數(shù)量的連續(xù)核苷酸的序列。在一個(gè)實(shí)施方式 中，所述檢測(cè)寡核苷酸包含至少12個(gè)核苷酸，提供了可檢測(cè)標(biāo)記物的摻入或進(jìn)一步包含可 檢測(cè)標(biāo)記物。在更具體的實(shí)施方式中，所述可檢測(cè)標(biāo)記物選自由同位素、熒光團(tuán)、氧化劑、還 原劑、核苷酸和半抗原構(gòu)成的組。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述檢測(cè)寡核苷酸和所述寡核苷酸 引物在嚴(yán)格雜交條件下與所述分子標(biāo)志物的至少一個(gè)等位基因雜交。再其他的實(shí)施方式包 括第二檢測(cè)寡核苷酸，其能夠檢測(cè)所述分子標(biāo)志物的不同的第二多態(tài)性、或同一多態(tài)性的 不同的等位基因。在又更具體的實(shí)施方式中，所述分子標(biāo)志物是SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7 或8;所述寡核苷酸引物至少90%相同于提供的引物，所述提供的引物相應(yīng)于所述特定的分 子標(biāo)志物，其分別是:SEQ ID NO 9和10、11和12、13和14、15和16、17和18、19和20,21 和22、或23和M ；以及所述檢測(cè)寡核苷酸包含核酸，所述核酸至少90%相同于提供的探針， 所述提供的探針相應(yīng)于所述特定的分子標(biāo)志物，其分別是SEQ ID而25和沈、27和觀、29 和 30,31 和 32,33 和 34,35 和 36,37 和 38、或 39 和 40。本發(fā)明還提供了將等位基因種質(zhì)滲入到大豆植物中的方法，包括提供大豆植物 的群體；針對(duì)選自SEQ ID NO :1到8和SEQ ID NO :73到80的組的大豆基因組核酸標(biāo)志物， 將所述群體中的至少一種大豆植物基因分型；以及從所述群體中選擇包含與ASR抗性相關(guān) 的等位基因的一種或更多種大豆植物，其中所述ASR抗性等位基因選自由SEQ ID N0:73到 SEQ ID N0:80構(gòu)成的組。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供群體包括使ASR抗性大豆植物與第二大 豆植物雜交來(lái)形成群體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述選擇的一種或更多種大豆植物在存在 ASR的情況下展現(xiàn)了與缺乏ASR抗性等位基因的大豆植物相比提高的谷粒產(chǎn)量。更特別地， 提高的谷粒產(chǎn)量可以是在存在ASR的情況下與缺乏ASR抗性等位基因的大豆植物相比至少 0. 5 Bu/A、至少 1. 0 Bu/A 或至少 1. 5 Bu/A。核酸序列的簡(jiǎn)要說(shuō)明
SEQ ID NO 1是來(lái)自大豆max)的與ASR抗性基因座14相關(guān)的基因組序列。SEQ ID NO 2是來(lái)自大豆ffl^r)的與ASR抗性基因座14相關(guān)的基因組序 列。SEQ ID NO 3是來(lái)自大豆(glycine a^r)的與ASR抗性基因座14相關(guān)的基因組序 列。SEQ ID NO :4是來(lái)自大豆ffl^r)的與ASR抗性基因座15相關(guān)的基因組序SEQID N0:5是來(lái)自大豆ffl^)的與ASR抗性基因座15相關(guān)的基因組序
SEQID N0:6是來(lái)自大豆ffl^)的與ASR抗性基因座15相關(guān)的基因組序
SEQID N0:7是來(lái)自大豆ffl^)的與ASR抗性基因座16相關(guān)的基因組序
SEQID N0:8是來(lái)自大豆ffl^)的與ASR抗性基因座16相關(guān)的基因組序SEQIDNO9是用于SEQ ID NO 1的擴(kuò)增的正向PCR引物。
SEQIDNO10是用于SEQIDNO1的擴(kuò)增的反向PCR引物。
SEQIDNO11是用于SEQIDNO2的擴(kuò)增的正向PCR引物。
SEQIDNO12是用于SEQIDNO2的擴(kuò)增的反向PCR引物。
SEQIDNO13是用于SEQIDNO3的擴(kuò)增的正向PCR引物。
SEQIDNO14是用于SEQIDNO3的擴(kuò)增的反向PCR引物。
SEQIDNO15是用于SEQIDNO4的擴(kuò)增的正向PCR引物。
SEQIDNO16是用于SEQIDNO4的擴(kuò)增的反向PCR引物。
SEQIDNO17是用于SEQIDNO5的擴(kuò)增的正向PCR引物。
SEQIDNO18是用于SEQIDNO5的擴(kuò)增的反向PCR引物。
SEQIDNO19是用于SEQIDNO6的擴(kuò)增的正向PCR引物。
SEQIDNO20是用于SEQIDNO6的擴(kuò)增的反向PCR引物。
SEQIDNO21是用于SEQIDNO7的擴(kuò)增的正向PCR引物。
SEQIDNO22是用于SEQIDNO7的擴(kuò)增的反向PCR引物。
SEQIDNO23是用于SEQIDNO8的擴(kuò)增的正向PCR引物。
SEQIDNO24是用于SEQIDNO8的擴(kuò)增的反向PCR引物。
SEQIDNO25是用于SEQIDNO1的SNP的檢測(cè)的探針。
SEQIDNO26是用于SEQIDNO1的SNP的檢測(cè)的探針。
SEQIDNO27是用于SEQIDNO2的SNP的檢測(cè)的探針。
SEQIDNO28是用于SEQIDNO2的SNP的檢測(cè)的探針。
SEQIDNO29是用于SEQIDNO3的SNP的檢測(cè)的探針。
SEQIDNO30是用于SEQIDNO3的SNP的檢測(cè)的探針。
SEQIDNO31是用于SEQIDNO4的SNP的檢測(cè)的探針。
SEQIDNO32是用于SEQIDNO4的SNP的檢測(cè)的探針。
SEQIDNO33是用于SEQIDNO5的SNP的檢測(cè)的探針。
SEQIDNO34是用于SEQIDNO5的SNP的檢測(cè)的探針。
SEQIDNO35是用于SEQIDNO6的SNP的檢測(cè)的探針。
SEQIDNO36是用于SEQIDNO6的SNP的檢測(cè)的探針。
SEQIDNO37是用于SEQIDNO7的SNP的檢測(cè)的探針。
SEQIDNO38是用于SEQIDNO7的SNP的檢測(cè)的探針。
SEQIDNO39是用于SEQ ID NO 8
SEQIDNO40是用于SEQ ID NO 8
SEQIDNO41是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO42是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO43是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO44是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO45是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO46是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO47是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO48是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO49是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO50是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO51是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO52是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO53是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO54是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO55是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO56是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO57是相應(yīng)于SEQIDNO針。
SEQIDNO58是相應(yīng)于SEQIDNO針。
SEQIDNO59是相應(yīng)于SEQIDNO針。
SEQIDNO60是相應(yīng)于SEQIDNO針。
SEQIDNO61是相應(yīng)于SEQIDNO針。
SEQIDNO62是相應(yīng)于SEQIDNO針。
SEQIDNO63是相應(yīng)于SEQIDNO針。
SEQIDNO64是相應(yīng)于SEQIDNO針。
SEQIDNO65是相應(yīng)于SEQIDNO針。
SEQIDNO66是相應(yīng)于SEQIDNO針。
SEQIDNO67是相應(yīng)于SEQIDNO
的SNP的檢測(cè)的探針。 的SNP的檢測(cè)的探針。 1的ASR抗性等位基因的雜交探針。 1的ASR易感性等位基因的雜交探針。 2的ASR抗性等位基因的雜交探針。 2的ASR易感性等位基因的雜交探針。 3的ASR抗性等位基因的雜交探針。 3的ASR易感性等位基因的雜交探針。 4的ASR抗性等位基因的雜交探針。 4的ASR易感性等位基因的雜交探針。 5的ASR抗性等位基因的雜交探針。 5的ASR易感性等位基因的雜交探針。 6的ASR抗性等位基因的雜交探針。 6的ASR易感性等位基因的雜交探針。 7的ASR抗性等位基因的雜交探針。 7的ASR易感性等位基因的雜交探針。 8的ASR抗性等位基因的雜交探針。 8的ASR易感性等位基因的雜交探針。 1的ASR抗性等位基因的單堿基延伸(SBE)探1的ASR抗性等位基因的單堿基延伸(SBE)探2的ASR抗性等位基因的單堿基延伸(SBE )探2的ASR抗性等位基因的單堿基延伸(SBE )探3的ASR抗性等位基因的單堿基延伸(SBE )探3的ASR抗性等位基因的單堿基延伸(SBE )探
的ASR抗性等位基因的單堿基延伸(SBE)探
的ASR抗性等位基因的單堿基延伸(SBE)探5的ASR抗性等位基因的單堿基延伸(SBE )探5的ASR抗性等位基因的單堿基延伸(SBE )探
的ASR抗性等位基因的單堿基延伸(SBE)探
8針。
SEQIDNO68是相應(yīng)于SEQIDNO針。
SEQIDNO69是相應(yīng)于SEQIDNO針。
SEQIDNO70是相應(yīng)于SEQIDNO針。
SEQIDNO71是相應(yīng)于SEQIDNO針。
SEQIDNO72是相應(yīng)于SEQIDNO針。
SEQIDNO73是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO74是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO75是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO76是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO77是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO78是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO79是相應(yīng)于SEQIDNO
SEQIDNO80是相應(yīng)于SEQIDNO
附圖的 荀要說(shuō)明
的ASR抗性等位基因的單堿基延伸(SBE)探7的ASR抗性等位基因的單堿基延伸(SBE )探7的ASR抗性等位基因的單堿基延伸(SBE )探
的ASR抗性等位基因的單堿基延伸(SBE)探
的ASR抗性等位基因的單堿基延伸(SBE)探1的ASR抗性等位基因1。 :2的ASR抗性等位基因2。 :3的ASR抗性等位基因3。 :4的ASR抗性等位基因4。 :5的ASR抗性等位基因5。 :6的ASR抗性等位基因6。 :7的ASR抗性等位基因7。 :8的ASR抗性等位基因8。
附


圖1描繪了連鎖群G上的ASR基因座14的位置。右側(cè)是群體的LOD曲線的圖例。黑 色柱表明NSO 1(^630的位置的置信區(qū)間(L0D>10)?；疑砻鱊SOl 19675的位置的置信區(qū) 間(L0D>2)。附圖2描繪了連鎖群C2上的ASR基因座15的位置。右側(cè)是群體的LOD曲線的圖 例。黑色柱表明NS0093385的位置的置信區(qū)間(L0D>10)。暗色柱表明NS0118716的位置的 置信區(qū)間(L0D>2)。附圖3描繪了連鎖群D2上的ASR基因座16的位置。右側(cè)是群體的LOD曲線的圖 例?；疑砻鱊S0113966的位置的置信區(qū)間(L0D>2)。發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明
所提供的定義和方法限定了本發(fā)明，并指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實(shí)踐本發(fā)明。除非 另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)將根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域中普通技術(shù)人員常規(guī)的使用來(lái)理解。分子生物學(xué)中的常見(jiàn) 術(shù)語(yǔ)的定義還可以在 Alberts et al.，Molecular Biology of The Cell, 5th Edition, Garland Science Publishing, Inc. : New York, 2007 ；Rieger et al. , Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1991 ；King et al, A Dictionary of Genetics, 6th ed, Oxford University Press: New York, 2002 -MR Lewin, Genes IX, Oxford University Press: New York, 2007 ψJJc 到。使用在37 CFR § 1. 822中列出的DNA堿基的命名。“等位基因”是指特定基因座上選擇性的序列；等位基因的長(zhǎng)度可以小到1個(gè)核苷 酸堿基，但一般是更大的。等位序列可以作為核酸序列、或作為由所述核酸序列編碼的氨基酸序列來(lái)表示?！盎蜃笔峭ǔＭㄟ^(guò)參考點(diǎn)來(lái)找到的基因組序列上的位置；例如，作為基因、基因 的部分或基因間區(qū)域的短的DNA序列。本發(fā)明的基因座包含群體中的一種或更多種多態(tài) 性，即，在某些個(gè)體中存在的選擇性的等位基因。如在此使用的，“多態(tài)性”是指在一個(gè)或更多個(gè)個(gè)體的群體中處在一個(gè)或更多個(gè)基 因座上核酸序列的一種或更多種變異的存在。所述變異可以包括、但不限于一個(gè)或更多個(gè) 堿基改變、一個(gè)或更多個(gè)核苷酸的插入或一個(gè)或更多個(gè)核苷酸的刪除。多態(tài)性可能來(lái)自核 酸復(fù)制中的隨機(jī)過(guò)程、通過(guò)誘變、作為移動(dòng)的基因組元件的結(jié)果、來(lái)自拷貝數(shù)變異和在減數(shù) 分裂的過(guò)程期間，例如，不等交換，基因組加倍以及染色體破裂和融合。變異通?？梢栽谌?體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，或可能在群體內(nèi)以低頻率存在，前者在一般的植物育種中具有更大的實(shí)用性，后 者可能與罕有的但是重要的表型變異相關(guān)。有用的多態(tài)性可以包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)、 DNA序列中的插入或刪除(IndelS)、DNA序列的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSRs)、限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài) 性以及標(biāo)簽SNP。遺傳標(biāo)志物、基因、DNA衍生的序列、單體型、RNA衍生的序列、啟動(dòng)子、基 因的5’非翻譯區(qū)、基因的3’非翻譯區(qū)、microRNA、siRNA、QTL、衛(wèi)星標(biāo)志物、轉(zhuǎn)基因、mRNA、 ds mRNA、轉(zhuǎn)錄分布、甲基化模式可能包含多態(tài)性。如在此使用的，“標(biāo)志物”是指多態(tài)的核酸序列或核酸特征。標(biāo)志物可以由一個(gè)或 更多個(gè)特定的變體序列、或由共有序列代表。在另一種意義上，“標(biāo)志物”是分離的變體或這 樣的序列的共有體。在廣義上，“標(biāo)志物”可以是可檢測(cè)的特征，其可以用于辨別生物體之間 的可遺傳的差異。這樣的特征的實(shí)例可以包括遺傳標(biāo)志物、蛋白質(zhì)組成、蛋白質(zhì)水平、油的 組成、油水平、碳水化物組成、碳水化物水平、脂肪酸組成、脂肪酸水平、氨基酸組成、氨基酸 水平、生物聚合物、藥物、淀粉組成、淀粉水平、可發(fā)酵的淀粉、發(fā)酵產(chǎn)量、發(fā)酵效力、能量產(chǎn) 量、次級(jí)化合物、代謝物、形態(tài)學(xué)特征和農(nóng)學(xué)特征。如在此使用的，“標(biāo)志物分析”是指利用特定的方法檢測(cè)特定基因座上的多態(tài)性 的方法，例如，至少一種表型的測(cè)量(例如，種子顏色、花顏色或其他視覺(jué)上可檢測(cè)的性狀)、 限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、單堿基延伸、電泳、序列比對(duì)、等位特異性寡核苷酸雜交 (AS0)、隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA (RAPD)、基于微陣列的技術(shù)以及核酸測(cè)序技術(shù)，等等。如在此使用的，“分型”是指任何方法，通過(guò)所述方法測(cè)定給定的大豆基因組多態(tài) 性的具體等位形式。例如，單核苷酸多態(tài)性(SNP)通過(guò)測(cè)定存在哪個(gè)核苷酸(即，A、G、T或 C)來(lái)分型。插入/刪除(Indels)通過(guò)確定是否存在hdel來(lái)測(cè)定。hdels可以通過(guò)多種 分析，包括但不限于標(biāo)志物分析來(lái)分型。如在此使用的，用語(yǔ)“鄰近于”，當(dāng)用于描述與含有多態(tài)性的DNA雜交的核酸分子 時(shí)，是指一種核酸，其與直接鄰接或近乎鄰接所述多態(tài)性核苷酸堿基位置的DNA序列雜交。 例如，可以用于單堿基延伸分析的核酸分子“鄰近于”所述多態(tài)性。如在此使用的，“詢(xún)問(wèn)位置”是指固相支持物上的物理位置，其可以被查詢(xún)來(lái)獲得 一個(gè)或更多個(gè)預(yù)定的基因組多態(tài)性的基因分型數(shù)據(jù)。如在此使用的，“共有序列”是指構(gòu)建的DNA序列，其鑒定基因座上等位基因中的 SNP和hdel多態(tài)性。共有序列可以基于基因座處DNA的任一鏈，并且表明基因座中每個(gè) SNP的任一種的核苷酸堿基，以及基因座中所有hdels的核苷酸堿基。因而，雖然共有序列 可能不是實(shí)際的DNA序列的拷貝，共有序列對(duì)于精確設(shè)計(jì)用于基因座中實(shí)際多態(tài)性的引物和探針是有用的。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“單核苷酸多態(tài)性”也由縮寫(xiě)“SNP”來(lái)表示，是指在單個(gè)位點(diǎn) 處的多態(tài)性，其中所述多態(tài)性構(gòu)成了單個(gè)堿基對(duì)改變、一個(gè)或更多個(gè)堿基對(duì)的插入、或一個(gè) 或更多個(gè)堿基對(duì)的刪除。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“單體型”是指由至少一個(gè)多態(tài)性分子標(biāo)志物的等位基因所定 義的單體型窗口內(nèi)的染色體區(qū)域。在每個(gè)單體型窗口中獨(dú)特的標(biāo)志物指紋圖譜組合定義了 該窗口的個(gè)體單體型。進(jìn)一步的，由例如重組導(dǎo)致的單體型中的改變，可能引起單體型的修 飾，從而它僅包含與所述性狀可操作連接的，例如，通過(guò)與基因、QTL或轉(zhuǎn)基因的物理連接連 接的、原始(親本)單體型的一部分。單體型中的任何這樣的改變將被包括在什么構(gòu)成單體 型的我們的定義中，只要基因組區(qū)域的功能完整性不變或被改善。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“單體型窗口，，是指染色體區(qū)域，其是通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的統(tǒng)計(jì)分析來(lái)建立的，并且處于連鎖不平衡中。因而，在位于這個(gè)區(qū)域內(nèi)的一個(gè)或更多個(gè) 分子標(biāo)志物基因座處兩個(gè)近交個(gè)體(或兩個(gè)配子)之間的狀態(tài)一致(identity by state)被 作為完整區(qū)域的血統(tǒng)一致(identity-by-descent)的證據(jù)。每個(gè)單體型窗口包括至少一個(gè) 多態(tài)性分子標(biāo)志物。單體型窗口可以沿著基因組中每個(gè)染色體來(lái)作圖。單體型窗口本身不 是固定的，考慮到分子標(biāo)志物的不斷提高的密度，本發(fā)明預(yù)期單體型窗口的數(shù)量和大小是 演變的，窗口的數(shù)量提高以及它們相應(yīng)的大小降低，因而產(chǎn)生在根據(jù)標(biāo)志物基因座的狀態(tài) 一致來(lái)確定血統(tǒng)一致方面不斷提高的置信程度。如在此使用的，“基因型”是指表型的遺傳組分，它可以利用標(biāo)志物間接地表征，或 由核酸測(cè)序直接地表征。適合的標(biāo)志物包括表型特征、代謝分布、遺傳學(xué)標(biāo)志物或其他類(lèi)型 的標(biāo)志物?；蛐涂梢詷?gòu)成至少一個(gè)遺傳標(biāo)志物基因座的等位基因，或至少一個(gè)單體型窗 口的單體型。在某些實(shí)施方式中，基因型可以代表單個(gè)基因座，在其他實(shí)施方式中，它可以 代表基因座的基因組廣度上的集合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，基因型可以反映染色體的一部 分、全部染色體、基因組的一部分、全部基因組的序列。如在此使用的，“表型”是指受到基因表達(dá)的影響的細(xì)胞或生物體的可檢測(cè)的特 征。如在此使用的，“連鎖”是指在雜交中產(chǎn)生配子類(lèi)型的相對(duì)頻率。例如，如果基因座 A具有基因“A”或“a”、基因座B具有基因“B”或“b”，具有AABB的親本I與具有aabb的親 本B之間的雜交將產(chǎn)生四種可能的配子，其中基因分離為AB、Ab、aB和ab。無(wú)效的期望是存 在著進(jìn)入四種可能的基因型的每一種的獨(dú)立的相等的分離，即，沒(méi)有每個(gè)基因型的配子1/4 的連鎖。與1/4不同的配子到基因型的分離被歸因于連鎖。如在此使用的，“連鎖不平衡”是在單個(gè)世代中許多個(gè)體的群體中配子類(lèi)型的相對(duì) 頻率的情境下定義的。如果等位基因A的頻率是P、a是P’，B是q以及b是q’，則基因型 AB的期望的頻率(沒(méi)有連鎖不平衡)是pq，Ab是pq’，aB是ρ’ q, ab是ρ’ q’。與預(yù)期頻率的 任何偏離被稱(chēng)為連鎖不平衡。當(dāng)處于連鎖不平衡中時(shí)，兩個(gè)基因座被稱(chēng)為是“遺傳地連鎖 的”。如在此使用的，“數(shù)量性狀基因座(QTL)”是指基因座，其控制在某種程度上可數(shù)字 地表示的、通常連續(xù)地分布的性狀。如在此使用的，“免疫性”是指ASR疾病表型，其不展現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的病變、或不與小皰或存活的孢子相關(guān)的紅-褐色病變，和具有的長(zhǎng)度平均起來(lái)不大于在可比較條件下分析 的易感表型的平均病變長(zhǎng)度的約四分之一，并且覆蓋不超過(guò)葉子表面積約二十分之一。完 全免疫性的數(shù)字分值是1 ；具有小的但可見(jiàn)的病變或變色的免疫性，數(shù)字分值是1. 5。如在此使用的，“抗性”是指ASR疾病表型，其展現(xiàn)了免疫性或紅褐色病變，所述紅 褐色病變可能或可能不與小皰或活的孢子相關(guān)，或可能在孢子形成方面延遲，具有的長(zhǎng)度 平均起來(lái)為在可比較條件下分析的易感表型的平均病變長(zhǎng)度的約四分之一，以及與葉表面 積覆蓋的百分比成反比而變化的抗性程度。如果葉子的低于約50%被病變覆蓋，抗性的數(shù) 字分值是2，如果葉子的大于約50%被覆蓋，分值是3。如果葉子的約50%面積被紅褐色病 變覆蓋，數(shù)字分值2.5。如在此使用的，“易感性”是指ASR疾病表型，其展現(xiàn)了與含有活的孢子的小皰 相關(guān)的棕黃色病變，具有在使用的標(biāo)準(zhǔn)分析條件下平均約2 mm到5 mm的長(zhǎng)度(美國(guó)申請(qǐng) 11805667)，易感性的程度與葉表面積覆蓋的百分比成正比地變化。如果葉子的低于約50% 被病變覆蓋，易感性的數(shù)字分值是4，如果葉子的大于約50%被覆蓋，分值是5。如果葉子的 約50%面積被棕黃色病變覆蓋，數(shù)字分值4. 5。響應(yīng)分值也可以反映多個(gè)葉片或測(cè)試的平均分值，從而這樣的分值可能具有整數(shù) 之間的數(shù)字值，一般表示為小數(shù)。如在此使用的，“抗性等位基因”是指分離的核酸序列，其包括與對(duì)ASR的抗性相關(guān) 的多態(tài)的等位基因。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“大豆”是指Glycine max,包括可以用大豆育種的所有植物品 種，包括野生大豆物種。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“包含”是指“包括但不限于”。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“優(yōu)良系”是指任何系，其來(lái)自對(duì)優(yōu)越的農(nóng)學(xué)性能的培育和選 擇。優(yōu)良植物是來(lái)自?xún)?yōu)良系的任何植物。本發(fā)明提供了 ASR抗性QTL，其作圖在靠近Rppl的連鎖群G上的區(qū)域；然而，本發(fā) 明的稱(chēng)為ASR抗性基因座14與Rppl不同在于覆蓋葉子的約低于25%表面積的病變的紅褐 色表型，而Rpp 1 —般賦予對(duì)ASR的免疫性。本發(fā)明還提供了用于選擇和種質(zhì)滲入來(lái)自源于 PI291309C的來(lái)源的能賦予對(duì)ASR的抗性的QTL的方法和組合物。提供了位于ASR抗性基 因座14上的QTL。本發(fā)明提供了 ASR抗性QTL，其作圖在連鎖群C2上的區(qū)域；本發(fā)明的稱(chēng)為ASR抗 性基因座15具有覆蓋葉子的約低于25%表面積的病變的紅褐色表型。本發(fā)明進(jìn)一步提供 了 ASR抗性QTL，其作圖在連鎖群D2上的區(qū)域；本發(fā)明的稱(chēng)為ASR抗性基因座16具有覆蓋 葉子的約低于25%表面積的病變的紅褐色表型。本發(fā)明還提供了用于選擇和種質(zhì)滲入來(lái)自 源于PI507009的來(lái)源的能賦予對(duì)ASR的抗性的QTL的方法和組合物。提供了位于ASR抗 性基因座15和16上的QTLs。在本發(fā)明中，一種ASR抗性基因座，ASR抗性基因座14位于連鎖群G上。用于 監(jiān)視ASR抗性基因座14的種質(zhì)滲入的SNP標(biāo)志物包括選自由NS0119675、NS0095012和 NS01(^630構(gòu)成的組的那些。說(shuō)明性的ASR抗性基因座14 SNP標(biāo)志物DNA序列SEQ ID NO: 1可以利用SEQ ID NO 9和10標(biāo)明的引物來(lái)擴(kuò)增，用SEQ ID NO 25和沈標(biāo)明的探針來(lái)檢 測(cè)；SEQ ID NO :2可以用SEQ ID NO :11和12標(biāo)明的引物擴(kuò)增，用SEQ ID而27和沘標(biāo)明的探針來(lái)檢測(cè)；SEQ ID NO :3可以用SEQ ID N0:13禾口 14標(biāo)明的引物擴(kuò)增，用SEQ ID NO: 29和30標(biāo)明的探針來(lái)檢測(cè)。類(lèi)似地，本發(fā)明，一種ASR抗性基因座，ASR抗性基因座15位于連鎖群C2上。用 于監(jiān)視ASR抗性基因座15的種質(zhì)滲入的SNP標(biāo)志物包括選自由NS0093385、NSOl 18716和 NS0127833構(gòu)成的組的那些。說(shuō)明性的ASR抗性基因座15 SNP標(biāo)志物DNA序列SEQ ID NO: 4可以利用SEQ ID NO 15和16標(biāo)明的引物來(lái)擴(kuò)增，用SEQ ID NO 31和32標(biāo)明的探針來(lái) 檢測(cè)；SEQ ID NO :5可以用SEQ ID NO 17和18標(biāo)明的引物擴(kuò)增，用SEQ ID N0:33和34標(biāo) 明的探針來(lái)檢測(cè)；SEQ ID NO :6可以用SEQ ID NO 19和20標(biāo)明的引物擴(kuò)增，用SEQ ID NO: 35和36標(biāo)明的探針來(lái)檢測(cè)。在本發(fā)明中，一種ASR抗性基因座，ASR抗性基因座16位于連鎖群D2上。用于監(jiān) 視ASR抗性基因座16的種質(zhì)滲入的SNP標(biāo)志物包括選自由NS0113966和NS0118536構(gòu)成 的組的那些。說(shuō)明性的ASR抗性基因座16 SNP標(biāo)志物DNA序列SEQ ID NO 7可以用SEQ ID NO :21和22標(biāo)明的引物擴(kuò)增，用SEQ ID NO 37和38標(biāo)明的探針檢測(cè)；SEQ ID NO :8可 以用SEQ ID NO 23和M標(biāo)明的引物擴(kuò)增，用SEQ ID NO 39和40標(biāo)明的探針檢測(cè)。本發(fā)明還提供了包含選自由SEQ ID NO :73到80和其互補(bǔ)物構(gòu)成的組的核酸分子 的大豆植物。本發(fā)明還提供了包含選自由SEQ ID NO :1到8、其片段和兩者的互補(bǔ)物構(gòu)成 的組的核酸分子的大豆植物。本發(fā)明還提供了包含選自由SEQ ID NO :9到72、其片段和兩 者的互補(bǔ)物構(gòu)成的組的核酸分子的大豆植物。在一個(gè)方面，所述大豆植物包含SEQ ID NO :73到75的3種核酸分子和其互補(bǔ)物。 在另一個(gè)方面，所述大豆植物包含SEQ ID NO :1到3的3種核酸分子、其片段和兩者的互補(bǔ) 物。在進(jìn)一步的方面，所述大豆植物包含選自由SEQ ID NO 9到14和25到30、其片段和 其互補(bǔ)物構(gòu)成的組的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12種核酸分子。在另一個(gè)方面，所述大豆植物包含SEQ ID NO 76到78的3種核酸分子和其互補(bǔ) 物。在另一個(gè)方面，所述大豆植物包含SEQ ID NO :4到6的3種核酸分子、其片段和兩者的 互補(bǔ)物。在進(jìn)一步的方面，所述大豆植物包含選自由SEQ ID NO 15到20和31到36、其片 段和其互補(bǔ)物構(gòu)成的組的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12種核酸分子。在另一個(gè)方面，所述大豆植物包含SEQ ID NO 79和80的2種核酸分子和其互補(bǔ) 物。在另一個(gè)方面，所述大豆植物包含2種核酸分子SEQ ID NO :7和8，其片段和兩者的互 補(bǔ)物。在進(jìn)一步的方面，所述大豆植物包含選自由SEQ ID N0:21到對(duì)和37到40、其片段 和其互補(bǔ)物構(gòu)成的組的2、3、4、5、6、7或8種核酸分子。在另一個(gè)方面，所述大豆植物包含SEQ ID NO 76到80的5種核酸分子和其互補(bǔ) 物。在另一個(gè)方面，所述大豆植物包含SEQ ID NO :4到8的5種核酸分子、其片段和兩者的 互補(bǔ)物。在進(jìn)一步的方面，所述大豆植物包含選自由SEQ ID而15到對(duì)和31到40，其片 段和其互補(bǔ)物構(gòu)成的組的 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 種核
酸分子。在另一個(gè)方面，所述大豆植物包含SEQ ID NO 73到78的6種核酸分子和其互補(bǔ) 物。在另一個(gè)方面，所述大豆植物包含SEQ ID NO :1到6的6種核酸分子、其片段和兩者的 互補(bǔ)物。在進(jìn)一步的方面，所述大豆植物包含選自由SEQ ID NO 9到20和25到36，其片 段和其互補(bǔ)物構(gòu)成的組的 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或M種核酸分子。在另一個(gè)方面，所述大豆植物包含SEQ ID NO :73、74、75、79和80的5種核酸分子 和其互補(bǔ)物。在另一個(gè)方面，所述大豆植物包含SEQ ID N0:l、2、3、7和8的5種核酸分子， 其片段和兩者的互補(bǔ)物。在進(jìn)一步的方面，所述大豆植物包含選自由SEQ ID NO :9到14和 21到30和37到40，其片段和其互補(bǔ)物構(gòu)成的組的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19或20種核酸分子。本發(fā)明還提供了包含ASR抗性基因座14的大豆植物。所述等位基因可以是純合 的或雜合的。本發(fā)明還提供了包含ASR抗性基因座15的大豆植物。所述等位基因可以是 純合的或雜合的。本發(fā)明還提供了包含ASR抗性基因座16的大豆植物。所述等位基因可 以是純合的或雜合的。本發(fā)明還提供了包含來(lái)自由ASR抗性基因座14、15和16構(gòu)成的組 的兩種或更多種ASR抗性基因座的大豆植物。所述等位基因可以是純合的或雜合的。在一個(gè)實(shí)施方式中，任何單獨(dú)的ASR抗性基因座14、15或16，或這些ASR抗性基因 座的任何組合，可以與育種計(jì)劃中的一種或更多種其他ASR抗性基因座組合，來(lái)產(chǎn)生具有 至少兩種ASR抗性基因座的大豆植物，如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)11/805667中描述的。如在此使用的，ASR是指任何ASR變體或分離物。本發(fā)明的大豆植物可以對(duì)能夠 引起或誘導(dǎo)ASR的一種或更多種真菌有抗性。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了對(duì)ASR有抗性或 耐受的植物，以及用于篩選對(duì)層銹菌屬引起的ASR有抗性或易感性的大豆植物的方法和組 合物。在優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了用于篩選對(duì)豆薯層銹菌有抗性或易感性的大豆植物的 方法和組合物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了對(duì)原始分離自密蘇里州東南部的豆薯層銹菌 菌株“MBH1”有抗性的植物，以及用于篩選大豆植物對(duì)豆薯層銹菌菌株“MBH1”的抗性或易 感性的方法和組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了，選擇的植物來(lái)自大豆屬的成員構(gòu)成的組，更具體地來(lái) 自 Glycine arenaria^ Glycine argyrea、Glycine canescens^ Glycine clandestine、 Glycine cur vata ^ Glycine cyrtoloba、Glycine falcate^ Glycine Iati folia、Glycine Iatrobeana^ Glycine max、Glycine microphylla、Glycine pescadrensis^ Glycine pindanica、Glycine rubiginosa、Glycine soja、Glycine sp.、Glycine stenophita、 Glycine tabacina 禾口tomentella當(dāng)通過(guò)任何方法分析對(duì)ASR的抗性或易感性、并根據(jù)此處描述數(shù)字分值的來(lái)分級(jí) 時(shí)，本發(fā)明的植物包括具有1到5的抗性水平的大豆植物，1是完全免疫，2是基本上抵抗的 抗性，3是部分抵抗的中度抗性，4是中度易感的，5是易感的。在優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了要分析對(duì)ASR的抗性或易感性的大豆植物，通過(guò)確 定大豆植物是否具有1到5的抗性水平的任何方法，根據(jù)在此描述的數(shù)字分值，1是完全免 疫，2是基本上抵抗的抗性，3是部分抵抗的中度抗性，4是中度易感的，5是易感的。根據(jù)ASR對(duì)產(chǎn)量的一般公認(rèn)的影響，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了具有一種或更多 種ASR抗性基因座的大豆植物或其衍生物，其展現(xiàn)了與缺乏ASR抗性基因座的大豆植物相 比在存在ASR的情況下提高的谷粒產(chǎn)量。在某些實(shí)施方式中，在存在ASR的情況下本發(fā)明 的植物的谷粒的提高與缺乏ASR抗性基因座的大豆植物相比是至少0. 5、1、1. 5,2. 0、2. 5或 3蒲式耳/英畝。本發(fā)明的疾病抗性QTL可以導(dǎo)入優(yōu)良大豆自交系中?！皟?yōu)良系”是指任何系，其來(lái)自對(duì)優(yōu)越的農(nóng)學(xué)性能的培育和選擇。對(duì)農(nóng)民或大豆育種者商業(yè)上可獲得的優(yōu)良大豆品種的 非限制性實(shí)例包括 AG00802、A0868、AG0902、A1923、AG2403、A2824、A3704、A4324、A5404、 AG5903 和 AG6202 (Asgrow Seeds, Des Moines, Iowa, USA);BPR0144RR、BPR 4077NRR和 BPR 4390NRR(Bio Plant Research, Camp Point, Illinois, USA);DKB17_51和 DKB37-51 (DeKalb Genetics, DeKalb, Illinois, USA)；和 DP 4546 RR 和 DP 7870 RR (Delta & Pine Land Company, Lubbock, Texas, USA) JG 03R50U JG 32R606C ADD 和 JG 55R503C (JGL Inc., Greencastle, Indiana, USA);NKS13_K2 (NK Division of Syngenta Seeds, Golden Valley, Minnesota, USA) ；90M01、91M30、92M33、93M11、94M30、95M30 和 97B52 (Pioneer Hi-Bred International, Johnston, Iowa, USA) ；SG4771NRR 和 SG5161NRR/ STS (Soygenetics, LLC, Lafayette, Indiana, USA) ;S00_K5、S11-L2、S28-Y2、S43-B1、 S53-A1、S76-L9 和 S78-G6 (Syngenta Seeds, Henderson, Kentucky, USA)。優(yōu)良植物是 來(lái)自?xún)?yōu)良品種的代表性的植物。本發(fā)明的ASR抗性基因座還可以導(dǎo)入包含一種或更多種轉(zhuǎn)基因的優(yōu)良大豆植物 中，所述轉(zhuǎn)基因賦予除草劑耐受性、提高的產(chǎn)量、昆蟲(chóng)控制、真菌病抗性、病毒抗性、線蟲(chóng)抗 性、細(xì)菌病抗性、支原體病抗性、修飾的油生產(chǎn)、高油生產(chǎn)、高蛋白質(zhì)生產(chǎn)、萌芽和幼苗生長(zhǎng) 控制、增強(qiáng)的動(dòng)物和人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)、低棉籽糖、環(huán)境壓力抗性、提高的可消化性、工業(yè)酶、藥物蛋 白質(zhì)、肽和小分子、改進(jìn)的加工性狀、改進(jìn)的風(fēng)味、氮固定、雜交種子生產(chǎn)、降低的變應(yīng)原性、 生物聚合物和生物燃料等等。在一個(gè)方面，所述除草劑耐受性選自由草甘膦、麥草畏、草銨 膦、磺酰脲、溴苯腈和達(dá)草滅除草劑構(gòu)成的組。這些性狀可以通過(guò)植物生物技術(shù)的方法作為 大豆中的轉(zhuǎn)基因來(lái)提供。單種或復(fù)數(shù)種疾病抗性QTL等位基因可以從含有所述等位基因的任何植物(供體) 導(dǎo)入任何接受者大豆植物。在一個(gè)方面，接受者大豆植物可以含有其他的ASR抗性基因座。 在另一個(gè)方面，接受者大豆植物可以含有轉(zhuǎn)基因。在另一個(gè)方面，當(dāng)維持導(dǎo)入的QTL時(shí)，提 供疾病抗性QTL的植物的遺傳貢獻(xiàn)可以通過(guò)回交或其他適合的方法來(lái)降低。在一個(gè)方面， 大豆植物中來(lái)自供體材料的核遺傳材料可以小于或約50%、小于或約25%、小于或約13%、小 于或約5%、3%、洲或1%，但是該遺傳材料含有感興趣的ASR抗性基因座。含有所描述的一種或更多種ASR抗性基因座的植物可以是供體植物。含有抗性基 因座的大豆植物可以，例如，通過(guò)利用能夠檢測(cè)與抗性相關(guān)的標(biāo)志物多態(tài)性的核酸分子來(lái) 篩選。在一個(gè)方面，供體植物選自由PI291309C和PI507009構(gòu)成的組。在另一個(gè)方面，供 體植物來(lái)源于PI291309C或PI507009。在另一個(gè)方面，供體植物通過(guò)將至少一種ASR抗性 基因從這些系中的每一個(gè)中一起帶入供體植物中的有性雜交、轉(zhuǎn)化或其他基因組合方法而 來(lái)源于PU91309C和PI507009兩者。供體植物可以是易感的系。在一個(gè)方面，供體植物也 可以是接受者大豆植物。進(jìn)一步理解的是，本發(fā)明的大豆植物可以展現(xiàn)任何相對(duì)成熟群體的特征。在一個(gè) 方面，所述成熟群體選自由000、00、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10構(gòu)成的組。當(dāng)然，QTL的等位基因可以包含多個(gè)基因或其他遺傳因子，甚至是處于連續(xù)基因組 區(qū)域或連鎖群，例如單體型之內(nèi)的。如在此使用的，疾病抗性基因座的等位基因因而可以包 括超過(guò)一種基因或其他遺傳因子，其中每個(gè)單獨(dú)的基因或遺傳組分也能夠展現(xiàn)等位變異， 其中每個(gè)基因或遺傳因子也能夠引發(fā)對(duì)所討論的數(shù)量性狀的表型效應(yīng)。在本發(fā)明的一個(gè)
15方面，QTL的等位基因包含也能展現(xiàn)等位變異的一種或更多種基因或其他遺傳因子。術(shù)語(yǔ) "QTL的等位基因”的使用因而不意圖排除包含超過(guò)一種基因或其他遺傳因子的QTL。特別 地，本發(fā)明中的“QTL的等位基因”可以指單體型窗口內(nèi)的單體型，其中表型可以是疾病抗 性。單體型窗口是連續(xù)的基因組區(qū)域，其可以用一組一種或更多種多態(tài)性標(biāo)志物來(lái)定義和 追蹤，其中所述多態(tài)性表明血統(tǒng)一致性。窗口內(nèi)的單體型可以由每個(gè)標(biāo)志物處等位基因的 獨(dú)特的指紋圖譜來(lái)定義。如在此使用的，等位基因是占據(jù)染色體上給定基因座的基因的幾 種可選擇形式之一。當(dāng)存在于染色體上的給定基因座處的所有等位基因相同時(shí)，該植物在 該基因座處是純合的。如果存在于染色體上的給定基因座處的等位基因不同，該植物在該 基因座處是雜合的。本發(fā)明的植物可以是在任何特定的ASR基因座處、或?qū)τ谔囟ǖ亩鄳B(tài) 性標(biāo)志物是純合的或雜合的。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的植物的部分。植物部分無(wú)限制地包括種子、胚乳、胚珠、 花粉、莖、插枝、細(xì)胞、原生質(zhì)體和組織培養(yǎng)物。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的方面中，所述植物部 分是種子。本發(fā)明還提供了大豆種子的容器，其中所述種子的大于50%、60%、70%、80%、90%、 95%或99%包含選自由ASR抗性基因座14、15和16構(gòu)成的組的至少一種基因座。大豆種子的容器可以含有任何數(shù)量、重量或體積的種子。例如，容器可以含有至 少、或大于約 10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、80、90、1000、1500、2000、2500、 3000、3500、4000顆或更多顆種子。在另一個(gè)方面，容器可以含有約、或大于約1克、5克、10 克、15克、20克、25克、50克、100克、250克、500克或1000克的種子。做為選擇，所述容器 可以含有至少或大于約0盎斯、1盎斯、5盎斯、10盎斯、1磅、2磅、3磅、4磅、5磅、10磅、15 磅、20磅、25磅或50磅或更多種子。大豆種子的容器可以是本領(lǐng)域可獲得的任何容器。例如，容器可以是盒子、袋子、 罐子、包、小袋、膠卷、桶或管。在另一個(gè)方面，大豆種子的容器中含有的種子可以是處理的或未處理的大豆種 子。在一個(gè)方面，所述種子可以被處理以改善萌芽，例如，通過(guò)引發(fā)所述種子，或通過(guò)消毒來(lái) 對(duì)抗種子攜帶的病原體。在另一個(gè)方面，種子可以包被任何可獲得的包被物來(lái)改善，例如， 種植性、出苗以及對(duì)抗種子攜帶的病原體的保護(hù)。種子包被物可以是任何形式的種子包被 物，包括但不限于，丸化、薄膜包被物或外殼。本發(fā)明的植物或其部分可以在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)和再生。從各種組織類(lèi)型再生大豆 植物的方法，以及大豆的組織培養(yǎng)的方法是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)，例如Widholm et al., In Vitro Selection and Culture-induced Variation in Soybean, In Soybean: Genetics, Molecular Biology and Biotechnology, Eds. Verma and Shoemaker, CAB International, Wallingford, Oxon, England (1996))。植物例如大豆的再生技術(shù)可以 用作多種組織或細(xì)胞類(lèi)型的起始材料。特別是對(duì)于大豆，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了從某些分化的組織類(lèi) 型例如分生組織 Cartha ei ai, Can. J. Bot.你1671-1679 (1981 )、胚軸部分 Cameya et al.，Plant Science Letters 21: 289—294 (1981)禾口莖節(jié)部分 Saka et al.，Plant Science Letters, 19: 193—201 (1980) ；Cheng et al., Plant Science Letters, 19·. 91-99 (1980)開(kāi)始的再生過(guò)程。已經(jīng)報(bào)道了來(lái)自體細(xì)胞胚的完整性成熟的大豆植物的再 生，所述體細(xì)胞胚從不成熟的大豆胚的外植體產(chǎn)生(Ranch et al., In Vitro Cellular &Developmental Biology 21 653-658 (1985)。還報(bào)道了通過(guò)器官發(fā)生和胚胎發(fā)生從組織 培養(yǎng)物再生成熟的大豆植物(Barwale et al., Planta 167.. 473-481 (1986) ；Wright et al.，Plant Cell Reports 5·. 150—154 (1986)。本發(fā)明還提供了通過(guò)篩選疾病抗性或易感性從大豆植物中選擇的疾病抗性大豆 植物，所述選擇包括詢(xún)問(wèn)基因組核酸中標(biāo)志物分子分子的存在，所述標(biāo)志物分子與大豆植 物中疾病抗性相關(guān)的QTL的等位基因是遺傳連鎖的，其中QTL的等位基因也位于與ASR抗 性相關(guān)的連鎖群上。將等位基因種質(zhì)滲入到大豆植物中的方法，包括(A)使包含選自由SEQ ID NO 73 到80構(gòu)成的組的核酸分子的至少一種第一大豆植物與至少一種第二大豆植物雜交以形成 群體，(B)篩選具有一種或更多種核酸標(biāo)志物的所述群體，來(lái)確定來(lái)自所述群體的一種或更 多種大豆植物是否含有所述核酸分子，和(C)從所述群體中選擇包含選自由SEQ ID Ν0:73 到80構(gòu)成的組的核酸分子的一種或更多種大豆植物。本發(fā)明還包括將等位基因種質(zhì)滲入到大豆植物中的方法，包括(Α)使至少一種 ASR抗性大豆植物與至少一種ASR敏感性大豆植物雜交以形成群體；(B)篩選具有一種或更 多種核酸標(biāo)志物的所述群體，來(lái)確定來(lái)自所述群體的一種或更多種大豆植物是否含有至少 一種ASR抗性等位基因，其中每種ASR抗性等位基因處在選自由ASR抗性基因座14、15和 16構(gòu)成的組的抗性基因座上。本發(fā)明包括分離的核酸分子。這樣的分子包括能夠檢測(cè)與ASR基因座遺傳地或物 理地連鎖的多態(tài)性的那些核酸分子。這樣的分子可以稱(chēng)為標(biāo)志物?？梢酝ㄟ^(guò)可用的技術(shù)獲 得與選自由ASR抗性基因座14、15和16構(gòu)成的組的基因座連鎖的其他標(biāo)志物。在一個(gè)方 面，所述核酸分子能夠檢測(cè)位于距離選自由ASR抗性基因座14、15和16構(gòu)成的組的基因座 小于30、20、10、5、2、或1厘摩(centimorgans)的標(biāo)志物的存在或缺乏。具有相應(yīng)的作圖 位置的示范性的核酸分子在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)NO. 2005/0204780,2005/0216545和系列號(hào)NO. 60/932，533中提供了，其可以用于方便本發(fā)明的基因座的選擇和種質(zhì)滲入。在另一個(gè)方面， 標(biāo)志物展現(xiàn)了 2或更大、3或更大、或4或更大的ASR抗性的LOD分值，利用本領(lǐng)域已知的方 法，例如Qgene Version 2.23 (1996)和默認(rèn)參數(shù)測(cè)量。在另一個(gè)方面，所述核酸分子能夠 檢測(cè)選自由ASR抗性基因座14、15和16構(gòu)成的組的基因座中的標(biāo)志物。在進(jìn)一步的方面， 核酸分子選自由SEQ ID NO :1到SEQ ID NO :80、其片段、其互補(bǔ)物和能夠與一種或更多種 這些核酸分子特異性雜交的核酸分子構(gòu)成的組。在優(yōu)選的方面，本發(fā)明的核酸分子包括在中度嚴(yán)格條件，例如，約2. OXSSC和約 65°C下與SEQ ID NO 1到SEQ ID NO 80中列出的核酸分子或其互補(bǔ)物或任一者的片段的 一種或更多種特異性雜交的那些。在特別優(yōu)選的方面中，本發(fā)明的核酸將在高度嚴(yán)格條件 下與SEQ ID NO :1到SEQ ID NO :80中列出的核酸分子、或互補(bǔ)物或任一者的片段的一種或 更多種特異性雜交。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，本發(fā)明的優(yōu)選的標(biāo)志物核酸分子具有SEQ ID NO :1到SEQ ID NO :80中所列的核酸序列，或其互補(bǔ)物或任一者的片段。在本發(fā)明的另一 個(gè)方面，本發(fā)明的優(yōu)選的標(biāo)志物核酸分子與SEQ ID NO :1到SEQ ID NO :80中所列核酸序 列或其互補(bǔ)物或任一者的片段具有80%到100%或90%到100%之間的序列同一性。在本 發(fā)明的進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明的優(yōu)選的標(biāo)志物核酸分子與SEQ ID NO :1到SEQ ID NO 80 中所列序列或其互補(bǔ)物或任一者的片段享有95%到100%之間的序列同一性。在本發(fā)明的更優(yōu)選的方面，本發(fā)明的優(yōu)選的標(biāo)志物核酸分子與SEQ ID NO :1到SEQ ID N0:80中所列核 酸序列或其互補(bǔ)物或任一者的片段享有98%到100%之間的序列同一性。在本發(fā)明的更優(yōu) 選的方面，本發(fā)明的優(yōu)選的標(biāo)志物核酸分子與SEQ ID NO :1到SEQ ID NO :80中所列核酸序 列或其互補(bǔ)物或任一者的片段享有99%到100%之間的序列同一性。在本發(fā)明的更優(yōu)選的 方面中，本發(fā)明的優(yōu)選的標(biāo)志物核酸分子與SEQ ID NO :1到SEQ ID NO :80中所列核酸序列 或其互補(bǔ)物或任一者的片段享有100%的序列同一性。核酸分子或其片段能夠在某些情況下與其他核酸分子特異性雜交。如此處使用 的，如果兩個(gè)分子能形成反平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，則稱(chēng)為兩個(gè)核酸分子能相互特異性的雜 交。如果核酸分子顯示出完全的互補(bǔ)性，則稱(chēng)核酸分子是另一個(gè)核酸分子的“互補(bǔ)物”。如 此處使用的，當(dāng)分子之一的每一個(gè)核苷酸與另一個(gè)分子的核苷酸互補(bǔ)時(shí)，稱(chēng)為分子顯示出 “完全的互補(bǔ)性”。如果分子以足夠的穩(wěn)定性相互雜交以使它們?cè)谥辽俪Ｒ?guī)的“低嚴(yán)格”條 件下保持相互退火，稱(chēng)為兩個(gè)分子是“最低度互補(bǔ)的”。類(lèi)似地，如果分子可以以足夠的穩(wěn)定 性相互雜交以允許它們?cè)诔Ｒ?guī)的“高嚴(yán)格”條件下保持相互退火，稱(chēng)為分子是“互補(bǔ)的”。由 Sambrook^)\j^Molecular Cloning，A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)中，以及 Haymes 等人在 Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)描述 了常規(guī)的嚴(yán)格條件。因而從完全互補(bǔ)的偏離是可允許的，只要這種偏離不完全地排除了分 子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力。為了使核酸分子作為引物或探針，僅需在序列中充分的互補(bǔ)，以使 得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。如此處使用的，基本上同源的序列是在高度嚴(yán)格條件下同與其相比較的核酸序列 的互補(bǔ)物特異性的雜交的核酸序列。本發(fā)明的核酸探針和引物在嚴(yán)格條件下與目標(biāo)DNA序 列雜交。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格雜交條件”被定義為一些條件，在所述條件下探針或引物與目標(biāo)序列而 不與非目標(biāo)序列特異性地雜交，其可以經(jīng)驗(yàn)性地確定。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”是根據(jù)Sambrook et al.，1989,9.52-9.55節(jié)中討論的具體雜交操作，對(duì)于核酸探針與目標(biāo)核酸(S卩，與感興趣 的特定核酸序列)的雜交功能性地定義的。還參見(jiàn)Sambrook et al.，1989，9.47-9.52， 9. 56-9. 58 ；Kanehisa 1984 Nucl. Acids Res. 12 203—213 ；禾口 Wetmur et al. 1968 J. Mol. Biol. 31:349-370。促進(jìn)DNA雜交的適合的嚴(yán)格條件，例如，6. O X氯化鈉/檸 檬酸鈉(SSC)約45°C，之后是在50°C用2. OXSSC洗滌，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是公知的， 或可在 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. 1989, 6. 3. 1-6. 3. 6中找到。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以選自50°C下的約2. OXSSC的低嚴(yán)格 度，到50°C下約0. 2XSSC的高嚴(yán)格度。此外，洗滌步驟中的溫度可以從室溫下、約22°C的 低嚴(yán)格條件提高到約65°C的高嚴(yán)格條件。溫度和鹽可以都變化，或者溫度或鹽濃度保持不 變而另一個(gè)變量發(fā)生改變。例如，對(duì)于高嚴(yán)格度，利用DNA或RNA探針或引物的雜交可以在65°C 6 X SSC,0. 5% SDS、5 XDenhardt，s、100 μ g/mL非特異性的DNA (例如，超聲化的鮭魚(yú)精子DNA)下進(jìn)行， 65°C下 0.5X SSC、0. 5% SDS 洗滌。期待的是，如果保持探針或引物與目標(biāo)序列的結(jié)合的特異性，低嚴(yán)格雜交條件，例 如，低雜交和/或洗滌溫度，可以用于鑒定具有低序列相似性程度的相關(guān)序列。因而，本發(fā) 明的核苷酸序列可以利用它們的能力來(lái)與DNA、RNA或cDNA片段的互補(bǔ)段選擇性地形成雙螺旋分子。核酸分子的片段可以是任何大小的片段，說(shuō)明性的片段包括SEQ ID NO :1到SEQ ID NO :80中列出的核酸序列和其互補(bǔ)物的片段。在一個(gè)方面，片段可以是15到25、15到 30、15 到 40、15 到 50、15 到 100,20 到 25,20 到 30,20 到 40,20 到 50,20 到 100,25 到 30、 25到40、25到50、25到100、30到40、30到50和30到100個(gè)核苷酸。在另一個(gè)方面，片段 可以大于 10、15、20、25、30、35、40、50、100 或 250 個(gè)核苷酸。其他遺傳學(xué)標(biāo)志物可以用于選擇具有與本發(fā)明的大豆的真菌病抗性相關(guān)的QTL 的等位基因的植物。公眾標(biāo)志物數(shù)據(jù)庫(kù)的實(shí)例包括，例如，Soykise，美國(guó)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究所 (Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture)。本發(fā)明的遺傳學(xué)標(biāo)志物包括“顯性”或“共顯性”標(biāo)志物?！肮诧@性標(biāo)志物”揭示了 兩種或更多種等位基因的存在(每個(gè)二倍體個(gè)體兩個(gè))?！帮@性標(biāo)志物”揭示了僅單個(gè)等位基 因的存在。顯性標(biāo)志物表型的存在(例如，DNA的條帶)是等位基因以純合或雜合的狀態(tài)存 在的指示。顯性標(biāo)志物表型的缺乏(例如，沒(méi)有DNA條帶)僅是存在“某些其他的”不確定的 等位基因的證據(jù)。對(duì)于其中個(gè)體主要是純合的、基因座主要是二態(tài)的群體來(lái)說(shuō)，顯性和共顯 性的標(biāo)志物是同樣地重要的。隨著群體變得更為雜合和多等位性，共顯性標(biāo)志物常常變得 比顯性標(biāo)志物更代表基因型的信息。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以利用與本發(fā)明的QTL的等位基因遺傳連鎖或相關(guān)的標(biāo) 志物，例如單序列重復(fù)標(biāo)志物(SSR)、AFLP標(biāo)志物、RFLP標(biāo)志物、RAPD標(biāo)志物、表型標(biāo)志物、 同工酶標(biāo)志物、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、插入或刪除(Indels)、單特征多態(tài)性(SFPs，例如， Borevitz et al. 2003 Gen. Res. 13:513-523中描述的)、微陣列轉(zhuǎn)錄作用分布、DNA衍生 的序列和RNA衍生的序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)于遺傳多態(tài)性的存在或缺乏的基于核酸的分析可以用于培 育群體中種子的選擇。用于遺傳多態(tài)性分析的各種各樣的遺傳學(xué)標(biāo)志物是可獲得的，是本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。所述分析可以用于選擇包含或與遺傳學(xué)標(biāo)志物連鎖的基因、QTL、等 位基因或基因組區(qū)域(單體型)。在此，核酸分析方法是本領(lǐng)域已知的，包括，但不限于，基于PCR的檢測(cè)方法(例 如，TaqMan分析)、微陣列方法和核酸測(cè)序方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，DNA、RNA或cDNA的樣 品中多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)可以通過(guò)核酸擴(kuò)增方法的運(yùn)用來(lái)促成。這些方法特異性地提高跨越 多態(tài)性位點(diǎn)、或包括所述位點(diǎn)的多核苷酸、以及位于多態(tài)性位點(diǎn)的遠(yuǎn)端或近端的序列的濃 度。這樣的擴(kuò)增的分子可以通過(guò)凝膠電泳、熒光檢測(cè)方法或其他手段容易地檢測(cè)。實(shí)現(xiàn)這樣的擴(kuò)增的方法采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) (Mullis et al. 1986 Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 ；歐洲專(zhuān)利 50，4 ；歐洲專(zhuān)利 84，796 ； 歐洲專(zhuān)利258，017 ；歐洲專(zhuān)利237，362 ；歐洲專(zhuān)利201，184 ；美國(guó)專(zhuān)利4，683，202 ；美國(guó)專(zhuān)利 4，582，788 ；和美國(guó)專(zhuān)利4，683，194)，利用能夠與近端序列雜交的引物對(duì)，所述近端序列在 其雙鏈形式中限定了多態(tài)性。DNA序列中的多態(tài)性可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的多種有效方法，包括但不限于，在美國(guó) 專(zhuān)利 5，468，613 和 5，217，863 ；5，210，015 ；5，876，930 ；6，030，787 ；6，004，744 ；6，013，431 ； 5，595，890 ；5，762，876 ；5，945，283 ；5，468，613 ；6，090，558 ；5，800，944 ；和 5，616，464 中公
開(kāi)的那些來(lái)檢測(cè)或分型，所有這些通過(guò)將它們完全引用來(lái)合并在本文中。然而，本發(fā)明的組合物和方法可以與任何多態(tài)性分型方法一起使用，來(lái)對(duì)大豆基因組DNA樣品中的多態(tài)性 分型。使用的這些大豆基因組DNA樣品包括但不限于，直接從大豆植物分離的大豆基因組 DNA、克隆的大豆基因組DNA、或擴(kuò)增的大豆基因組DNA。例如，DNA序列中的多態(tài)性可以通過(guò)與等位基因特異性寡核苷酸(ASO)探針雜交 來(lái)檢測(cè)，如美國(guó)專(zhuān)利5，468，613和5，217，863中公開(kāi)的。美國(guó)專(zhuān)利5，468，613公開(kāi)了等位 基因特異性寡核苷酸雜交，其中核酸序列中的單個(gè)或多個(gè)核苷酸變異可以通過(guò)一種過(guò)程在 核酸中檢測(cè)，在所述過(guò)程中含有所述核苷酸變異的序列被擴(kuò)增，點(diǎn)在膜上，并用標(biāo)記的序列 特異性寡核苷酸探針處理。目標(biāo)核酸序列也可以通過(guò)如美國(guó)專(zhuān)利5，800, 944中公開(kāi)的探針連接方法來(lái)檢測(cè)， 其中感興趣的序列被擴(kuò)增并與探針雜交，隨后連接來(lái)檢測(cè)探針的標(biāo)記的部分。微陣列也可以用于多態(tài)性檢測(cè)，其中寡核苷酸探針集以重疊方式組裝來(lái)呈現(xiàn)單個(gè) 序列，從而在一個(gè)點(diǎn)上目標(biāo)序列中的差異將引起部分探針雜交(Borevitz et al. , Genome Res. 13:513-523 (2003) ；Cui et al. , Bioinformatics 21:3852-3858 (2005)。在任一 種微陣列上，預(yù)期的是將存在復(fù)數(shù)個(gè)目標(biāo)序列，其可以代表基因和/或非編碼區(qū)域，其中每 個(gè)目標(biāo)序列通過(guò)一系列重疊寡核苷酸而不是通過(guò)單個(gè)探針來(lái)呈現(xiàn)。這種平臺(tái)提供了多種多 態(tài)性的高通量篩選。單特征多態(tài)性(SFP)是通過(guò)寡核苷酸陣列中單個(gè)探針檢測(cè)的多態(tài)性， 其中特征是陣列中的探針。通過(guò)基于微陣列的方法的目標(biāo)序列分型在美國(guó)專(zhuān)利6，799，122 ； 6，913，879 和 6，996，476 中公開(kāi)。目標(biāo)核酸序列也可以通過(guò)如美國(guó)專(zhuān)利5，616，464中公開(kāi)的探針連接方法、采用至 少一對(duì)探針來(lái)檢測(cè)，所述探針具有與目標(biāo)核酸序列的鄰近部分同源的序列，并具有側(cè)鏈，所 述側(cè)鏈在所述探針與所述目標(biāo)核酸序列堿基配對(duì)時(shí)非共價(jià)地結(jié)合來(lái)形成莖。所述側(cè)鏈的至 少一種具有可光活化的基團(tuán)，其可以與所述莖的另一側(cè)鏈成員形成共價(jià)的交聯(lián)。檢測(cè)SNP和hdels的其他方法包括單堿基延伸(SBE)方法。SBE方法的實(shí)施例包 括，但不限于，美國(guó)專(zhuān)利 6，004，744,6, 013，431,5, 595，890,5, 762，876 和 5，945，283 中公開(kāi) 的那些。SBE方法基于鄰近于多態(tài)性的核苷酸引物的延伸，來(lái)在引物的延伸時(shí)摻入可檢測(cè)的 核苷酸殘基。在某些實(shí)施方式中，SBE方法利用三種合成的寡核苷酸。寡核苷酸中的兩種 充當(dāng)PCR引物，并與大豆基因組DNA的基因座的序列互補(bǔ)，所述序列側(cè)翼于含有要分析的多 態(tài)性的區(qū)域。在含有多態(tài)性的大豆基因組的區(qū)域擴(kuò)增之后，PCR產(chǎn)物與第三寡核苷酸(稱(chēng)為 延伸引物)混合，所述第三寡核苷酸被設(shè)計(jì)為在存在DNA聚合酶和兩種差異化標(biāo)記的二脫氧 核苷三磷酸的情況下與擴(kuò)增的鄰近多態(tài)性的DNA雜交。如果模板上存在所述多態(tài)性，標(biāo)記 的二脫氧核苷三磷酸之一可以在單堿基鏈延伸中添加給引物。然后通過(guò)測(cè)定兩種差異的標(biāo) 記物的哪一種被添加到延伸引物中來(lái)推斷存在的等位基因。純合的樣品將僅引起兩種標(biāo)記 的堿基之一被摻入，將僅檢測(cè)到兩種標(biāo)記物之一。雜合的樣品存在兩種等位基因，因而將指 導(dǎo)兩種標(biāo)記物的摻入(到延伸引物的不同分子中)，因而將檢測(cè)到兩種標(biāo)記物。在檢測(cè)多態(tài)性的優(yōu)選的方法中，SNPs和^idels可以通過(guò)美國(guó)專(zhuān)利5，210，015 ； 5，876，930 ；和6，030, 787中公開(kāi)的方法來(lái)檢測(cè)，其中寡核苷酸探針具有與探針的5’和3’ 末端共價(jià)連接的5’熒光報(bào)告物染料和3’猝滅染料。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告物染料與猝滅染 料的接近引起報(bào)告物染料熒光的抑制，例如，通過(guò)i^orster型能量轉(zhuǎn)移。在PCR正向和反向 引物與側(cè)翼于多態(tài)性的目標(biāo)DNA的特異性序列雜交期間，雜交探針與擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物內(nèi)含有多態(tài)性的序列雜交。在隨后的PCR循環(huán)中，具有5’ 一3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶 裂解探針，并從猝滅染料上分離報(bào)告物染料，產(chǎn)生報(bào)告物的提高的熒光。對(duì)于QTL作圖，包括的標(biāo)志物應(yīng)當(dāng)是有來(lái)源診斷性的，以作出關(guān)于后來(lái)的群體的 推理。SNP標(biāo)記物對(duì)于作圖是理想的，因?yàn)樘囟⊿NP等位基因來(lái)自特定物種中現(xiàn)存群體的獨(dú) 立來(lái)源的可能性是非常低的。因而，SNP標(biāo)志物對(duì)于跟蹤和輔助QTL的種質(zhì)滲入，特別是對(duì) 于單體型來(lái)說(shuō)，是有用的。其他標(biāo)志物分子的遺傳連鎖可以通過(guò)基因作圖模型來(lái)建立，例如，無(wú)限制地， Lander等人所報(bào)道的側(cè)翼標(biāo)志物模型(Lander ei ai 1989 Genetics, 121 185-199)，以 及基于其中描述的最大可能性方法和在軟件包MAPMAKER/QTL中實(shí)現(xiàn)的間隔作圖(Lincoln and Lander, Mapping Genes Con trolling Quantitative Traits Using MAPMAKER/QTL， Whitehead Institute for Biomedical Research, Massachusetts, (1990)。其他軟件包 括 Qgene, Version 2. 23 (1996)，Department of Plant Breeding and Biometry, 266 Emerson Hall, Cornell University, Ithaca, NY)。使用 Qgene 軟件是特別優(yōu)選的方法。與假定沒(méi)有QTL效應(yīng)的MLE —起，計(jì)算標(biāo)志物的存在的最大可能性估計(jì)(MLE)，來(lái) 避免假陽(yáng)性。然后根據(jù)LOD = Iogltl來(lái)計(jì)算機(jī)會(huì)比率的Iogltl (LOD)(假定沒(méi)有連鎖的QTL 的QTL/MLE存在的MLE)。LOD值基本上代表了相比QTL的缺乏，更可能出現(xiàn)假定QTL的存 在的數(shù)據(jù)的程度。以給定的置信度，比方說(shuō)95%來(lái)避免假陽(yáng)性的LOD閾值，將取決于標(biāo)志物 的數(shù)量和基因組的長(zhǎng)度。表明LOD閾值的圖形在Lander et al. (1989)中闡述，由Arts and Moreno-Gonzalez^ Plant Breeding, Hayward, Bosemark, Romagosa (eds. )Chapman & Hall, London, pp. 314-331 (1993)進(jìn)一步描述?？梢允褂闷渌哪Ｐ?。已經(jīng)報(bào)道了間隔作圖的的許多修改版和可選擇的方法，包 括利用非參數(shù)方法。(Kruglyak et al. 1995 Genetics, 139:1421-1428)。也可以使用 多重回歸方法或模型，其中性狀在大量的標(biāo)志物上回歸(Jansen，Biometrics in Plant Breed, van Oijen, JansenCeds. ^Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding, The Netherlands, pp. 116-124(1994);ffeber and ffricke, Advances in Plant Breeding, Blackwell, Berlin, 16 (1994))。操作組 合了間隔作圖和回歸分析，從而表型以給定的標(biāo)志物間隔在單個(gè)推定的QTL上、同時(shí)在充 當(dāng)“輔助因子”的多個(gè)標(biāo)志物上回歸，已經(jīng)由Jansen等(Jansen et al. 1994 Genetics, 136:1447-1455)和 Zeng (Zeng 1994 Genetics 136 1457-1468)報(bào)道。一般地，輔助因子 的使用降低了估計(jì)的QTL位置的偏見(jiàn)和采樣誤差(Utz and Melchinger, Biometrics in Plant Breeding, van Oijen, Jansen (eds. ) Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding, The Netherlands, pp.195-204 (1994)，從而改善了 QTL作圖的精確性和效率(Zeng 1994)。這些模型可以延伸到多環(huán)境實(shí) 驗(yàn)來(lái)分析基因型-環(huán)境相互作用(Jansen ei 1995 Theor. Appl. Genet. 91:33-3)。合適的作圖群體的選擇對(duì)于圖譜構(gòu)建是重要的。合適的作圖群體的選擇取決于采 用的標(biāo)志物系統(tǒng)的類(lèi)型(Tanksley et al., Molecular mapping in plant chromosomes, chromosome structure and function: Impact of new concepts J. P. Gustafson and R. Appels (Eds. ) Plenum Press, New York, pp. 157-173 (1988))。必需考慮作圖群體中 使用的親本的來(lái)源(適應(yīng)的對(duì)比外來(lái)的)。染色體配對(duì)和重組率在遠(yuǎn)緣雜交(適應(yīng)的X外來(lái)的)中可能被嚴(yán)重地?cái)_動(dòng)(抑制)，一般產(chǎn)生大大降低的連鎖距離。當(dāng)與近緣雜交(適應(yīng)的X 適應(yīng)的)中的子代相比時(shí)，遠(yuǎn)緣雜交通常將提供分離群體，具有相對(duì)大的多態(tài)性系列。&群體是自我授粉(自交)的第一代。通常，單獨(dú)的F1植物自交來(lái)產(chǎn)生孟德?tīng)柺?(1:2:1)式分離所有基因的群體。利用共顯性標(biāo)志物系統(tǒng)從完全分類(lèi)的F2群體獲得最大的 遺傳信息(Mather，Measurement of Linkage in Heredity: Methuen and Co. , (1938))。 對(duì)于顯性標(biāo)志物來(lái)說(shuō)，需要子代測(cè)試(例如，F(xiàn)3, BCF2)來(lái)鑒定雜合子，使得它相當(dāng)于完全分類(lèi) 的F2群體。然而，這個(gè)過(guò)程常常是禁止性的，因?yàn)楹蟠鷾y(cè)定中涉及的成本和時(shí)間。F2個(gè)體 的后代測(cè)試常常在圖譜構(gòu)建中使用，其中表型不一致地反映基因型(例如，疾病抗性)，或其 中性狀表達(dá)受QTL控制。來(lái)自后代測(cè)試群體(例如，F(xiàn)3或BCF2)的分離數(shù)據(jù)可以用于圖譜構(gòu) 建。標(biāo)志物輔助的選擇然后可以用于根據(jù)標(biāo)志物-性狀圖譜相關(guān)來(lái)交配子代(F2，F(xiàn)3)，其中 連鎖群沒(méi)有通過(guò)重組事件完全地分離(即，最大不平衡)。重組自交系(RIL)(遺傳相關(guān)的系；通常>F5，從連續(xù)自交的F2系發(fā)展向純合)可 以用作作圖群體。從顯性標(biāo)志物獲得的信息可以通過(guò)利用RIL來(lái)最大化，因?yàn)樗械幕?座是純合的或幾乎是純合的。在緊密連鎖的情況下(即，約<10%重組)，在RIL群體中評(píng)估 的顯性和共顯性標(biāo)志物提供了相比回交群體中的任一標(biāo)志物類(lèi)型更多的每個(gè)個(gè)體的信息 (Reiter et al. 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:1477-1481)。然而，隨著標(biāo)志物 之間的距離變得更大(即，基因座變得更為獨(dú)立)，RIL群體中的信息顯著地降低?；亟蝗后w(例如，從成功的品種(輪回親本)和帶有前者中不存在的性狀的另一個(gè) 品種(供體親本)之間的交配產(chǎn)生的)可以用作作圖群體?？梢赃M(jìn)行對(duì)輪回親本的一系列回 交來(lái)恢復(fù)大部分它的期望的性狀。因而，產(chǎn)生了由幾乎同輪回親本一樣的個(gè)體組成的群體， 但是每個(gè)個(gè)體帶有來(lái)自供體親本的基因組區(qū)域的改變的數(shù)量或嵌合性。如果輪回親本中的 所有基因座是純合的，以及供體和輪回親本具有相反的多態(tài)性標(biāo)志物等位基因，回交群體 對(duì)于作圖顯性標(biāo)志物可能是有用的(Reiter et al. 1992)。利用共顯性或顯性標(biāo)志物從 回交群體獲得的信息小于從F2群體獲得的，因?yàn)槊總€(gè)植物采樣了一個(gè)、而不是兩個(gè)重組配 子。然而，隨著RIL群體中連鎖的基因座之間的距離提高(S卩，約.15%重組)，當(dāng)與RIL相比 時(shí)，回交群體是更為情報(bào)性的(在低標(biāo)志物飽和度下)。提高的重組可能對(duì)于緊密連鎖的拆 分是有益的，但是在具有低標(biāo)志物飽和度的圖譜的構(gòu)建中可能是不希望的。通過(guò)多次回交來(lái)產(chǎn)生一系列個(gè)體而產(chǎn)生的近等基因系(NIL)可以用作作圖群體， 所述個(gè)體除了詢(xún)問(wèn)中的性狀或基因組區(qū)域之外在遺傳組成方面幾乎是相同的。在用NIL作 圖時(shí)，僅一部分多態(tài)的基因座預(yù)計(jì)被作圖到選擇的區(qū)域。批量分離子分析(BSA)是為快速鑒定標(biāo)志物和感興趣的性狀之間的連鎖而開(kāi)發(fā)的 方法(Michelmore ei a義 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A. ) 889828—9832)。在 BSA中，兩種批量的DNA樣品從來(lái)自單次交配的分離群體中抽取。這些批量含有特定性狀 (對(duì)特定疾病的抗性或易感性)或基因組區(qū)域相同、但在不連鎖的區(qū)域中隨機(jī)的個(gè)體(即，雜 合的)。與目標(biāo)區(qū)域不連鎖的區(qū)域在BSA的許多個(gè)體的批量樣品之間將不會(huì)不同。本發(fā)明的植物可以是來(lái)自育種計(jì)劃的一部分或從育種計(jì)劃產(chǎn)生的。育種方法的 選擇取決于植物繁殖的方式、要改善的性狀的遺傳率、以及商業(yè)上使用的栽培種的類(lèi)型(例 如，F(xiàn)l雜交栽培種、純系栽培種，等等)。栽培種是植物物種的種類(lèi)或品種，其是通過(guò)培育有 意地產(chǎn)生或選擇并維持的。
如在此使用的，術(shù)語(yǔ)子代是指遺傳學(xué)的后代。本發(fā)明提供了通過(guò)有性或營(yíng)養(yǎng)生殖 產(chǎn)生的、從種子生長(zhǎng)的、從上述植物部分再生的、或從栽培種或子代植物的組織培養(yǎng)物再生 的子代。分子培育常常被稱(chēng)為標(biāo)志物輔助的選擇(MAS)和標(biāo)志物輔助的培育(MAB)，其中 MAS是指在分子標(biāo)志物基因型的基礎(chǔ)上進(jìn)行培育判定，MAB是代表植物育種中分子標(biāo)志物 的運(yùn)用的通稱(chēng)。在這些類(lèi)型的分子育種計(jì)劃中，遺傳標(biāo)志物等位基因可以用于鑒定在一個(gè) 標(biāo)志物基因座、幾個(gè)基因座或單體型上含有期望的基因型的植物，預(yù)計(jì)其將會(huì)將期望的基 因型以及期望的表型轉(zhuǎn)移給它們的子代。標(biāo)志物在植物育種中是高度有用的，因?yàn)橹灰?立了，它們不受環(huán)境或上位相互作用的影響。此外，某些類(lèi)型的標(biāo)志物適合于高通量檢測(cè)， 允許以低成本的方式快速鑒定。以下列出了培育本發(fā)明的植物的選擇的、非限制性方法。育種計(jì)劃可以利用標(biāo) 志物輔助的選擇(MAS)對(duì)任何交配的子代來(lái)增強(qiáng)。MAS是一種選擇過(guò)程，其中感興趣的性 狀不根據(jù)性狀本身、而是根據(jù)與之連鎖的標(biāo)志物來(lái)選擇。例如，如果MAS被用于選擇患有 疾病的個(gè)體，疾病的水平不被定量，而是與疾病連鎖的標(biāo)志物等位基因被用于測(cè)定疾病存 在。假定是，連鎖的等位基因與感興趣的基因和/或數(shù)量性狀基因座(QTL)相關(guān)。MAS對(duì) 于難以測(cè)量的性狀、表型昂貴的、展現(xiàn)低遺傳率的和/或在晚期植物發(fā)育中表達(dá)的性狀是 有用的。要理解的是，本發(fā)明的核酸標(biāo)志物可以用于MAS (培育)計(jì)劃中。進(jìn)一步理解的 是，任何商業(yè)的和非商業(yè)的栽培種可以在育種計(jì)劃中使用。一些因素，例如，出苗活力、營(yíng)養(yǎng) 活力、壓力耐受性、疾病抗性、分支、開(kāi)花、結(jié)實(shí)率(seed set)、種子大小、種子密度、直立性 (standability)、可脫粒性等等，一般將支配所述選擇。對(duì)于高度可遺傳的性狀，在單個(gè)位置上評(píng)估的優(yōu)越的個(gè)體植物的選擇將是有效 的，而對(duì)于具有低遺傳率的性狀，選擇應(yīng)當(dāng)基于從相關(guān)植物的科的復(fù)本評(píng)估中獲得的平均 值。流行的選擇方法通常包括譜系選擇、修改的譜系選擇、混合選擇和輪回選擇。在優(yōu)選的 方面，進(jìn)行回交或輪回育種計(jì)劃。遺傳的復(fù)雜性影響了育種方法的選擇。回交育種可以用于將高度可遺傳的性狀的 一個(gè)或幾個(gè)有利的基因轉(zhuǎn)移到期望的栽培種中。這種方法已經(jīng)廣泛地用于培育疾病抗性栽 培種。各種輪回選擇技術(shù)被用于改善由許多基因控制的數(shù)量性遺傳的性狀。培育系可以在代表商業(yè)目標(biāo)區(qū)域的環(huán)境中測(cè)試和與合適的標(biāo)準(zhǔn)物比較兩個(gè)或更 多個(gè)世代。最好的系是新的商業(yè)栽培種的候選物；在性狀方面仍然缺陷的那些可以用作親 本來(lái)產(chǎn)生用于進(jìn)一步選擇的新的群體。系譜育種和輪回選擇育種方法可以用于從培育群體開(kāi)發(fā)栽培種。育種計(jì)劃將來(lái)自 兩個(gè)或更多個(gè)栽培種或各種廣泛來(lái)源的期望的性狀組合到培育庫(kù)中，通過(guò)自交和期望的表 型的選擇從所述培育庫(kù)中開(kāi)發(fā)栽培種?？梢栽u(píng)估新的栽培種來(lái)確定其具有商業(yè)潛力。回交育種已經(jīng)被用于將簡(jiǎn)單地遺傳的、高度可遺傳的性狀轉(zhuǎn)移到期望的純合栽培 種或自交系中，其是輪回親本。要轉(zhuǎn)移的性狀的來(lái)源被稱(chēng)為供體親本。在初始的交配中，保 持了供體親本的表型的個(gè)體被選擇，并與輪回親本重復(fù)地交配(回交)。產(chǎn)生的植物預(yù)計(jì)具 有輪回親本(例如，栽培種)的大多數(shù)特質(zhì)，此外，期望的性狀從供體親本轉(zhuǎn)移。單籽傳操作嚴(yán)格地說(shuō)是指種植分離群體，每個(gè)植物收獲一個(gè)種子的樣品，利用一 個(gè)種子的樣品來(lái)種植下一代。當(dāng)群體從F2推進(jìn)到期望的近交水平時(shí)，系所衍生于的植物將各自追查到不同的F2個(gè)體。由于某些種子發(fā)芽或某些植物產(chǎn)生至少一個(gè)種子的失敗，每個(gè) 世代群體中植物的數(shù)量降低。結(jié)果，當(dāng)世代推進(jìn)完成時(shí)，不是所有的在群體中原始采樣的F2 植物都被子代代表。通常用于不同性狀和作物的其他育種方法的描述可以在幾本參考書(shū)之一中找到 (Allard, "Principles of Plant Breeding,，，John Wiley & &)ns，NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98, 1960 ；Simmonds, "Principles of crop improvement,，，Longman, Inc., NY, 369-399, 1979 ；Sneepand Hendriksen, "Plant breeding perspectives, ” Wageningen (ed) , Center for Agricultural Publishing and Documentation, 1979 ；Fehr, In: Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2nd Edition, Monograph., 16:249， 1987 ；Fehr, "Principles of variety development,，，Theory and Technique, (Vol. 1) and Crop Species Soybean (Vol. 2) , Iowa State Univ. , Macmillan Pub. Co. , NY, 360-376, 1987)。對(duì)傳統(tǒng)的QTL作圖的替代涉及通過(guò)對(duì)比單獨(dú)的標(biāo)志物對(duì)單體型作圖來(lái)實(shí)現(xiàn)更高 的分辨率(Fan et al. 2006 Genetics 172663-686)。這種方法追蹤稱(chēng)為單體型的DNA塊， 如多態(tài)標(biāo)志物所定義的，其在作圖群體中被假定是血統(tǒng)一致的。這種假定產(chǎn)生了更大的有 效樣品大小，提供了 QTL的更大的分辨率。測(cè)定表型和基因型之間的相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)顯著性 的方法，在單體型的情況下，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何統(tǒng)計(jì)測(cè)試，使用需要的任何公認(rèn)的 統(tǒng)計(jì)顯著性閾值來(lái)測(cè)定。特定方法和顯著性的閾值的應(yīng)用是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力之 內(nèi)的。進(jìn)一步理解的是，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的核酸分子的細(xì)菌、病毒、微生物、昆 蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物和植物細(xì)胞。如在此使用的，“核酸分子”，其是天然發(fā)生的分子或另外地可以是“基本上純化 的”，如果希望，是指從在其天然狀態(tài)下與之通常相關(guān)的基本上所有其他分子中分離的分 子。更優(yōu)選的，基本上純化的分子是制品中存在的優(yōu)勢(shì)物質(zhì)?；旧霞兓姆肿涌梢允谴?于約60%地沒(méi)有、優(yōu)選的約75%地沒(méi)有、更優(yōu)選的約90%地沒(méi)有、以及最優(yōu)選的約95%地沒(méi) 有天然混合物中存在的其他分子(不包括溶劑)。術(shù)語(yǔ)“基本上純化的的”不意圖涵蓋以它 們的天然狀態(tài)存在的分子。對(duì)于結(jié)構(gòu)性特質(zhì)，例如，核酸與另一個(gè)核酸分子雜交的能力，或蛋白質(zhì)被抗體結(jié)合 (或與其他分子競(jìng)爭(zhēng)這樣的結(jié)合)的能力，本發(fā)明的試劑優(yōu)選的是“生物學(xué)活性的”。做為選 擇，這樣的特質(zhì)可以是催化的，因而涉及試劑介導(dǎo)化學(xué)反應(yīng)或應(yīng)答的能力。本發(fā)明的試劑也可以是重組的。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)重組是指任何試劑(例如， DNA、肽，等等)，其間接地來(lái)自或產(chǎn)生于核酸分子的人類(lèi)操作。本發(fā)明的試劑可以用便于試劑的檢測(cè)的試劑來(lái)標(biāo)記(例如，熒光標(biāo)記物(Prober et al. 1987 Science 238:336-340 ；Albarella et al.,歐洲專(zhuān)利 144914)、化學(xué)標(biāo)記物 (Sheldon et al.，美國(guó)專(zhuān)利 4，582，789 ；Albarella et al.，美國(guó)專(zhuān)利 4，563，417)、修飾的 堿基(Miyoshi et al.,歐洲專(zhuān)利 119448)。現(xiàn)在一般性地描述了本發(fā)明，通過(guò)參考以下的實(shí)施例將更容易地理解本發(fā)明，實(shí) 施例通過(guò)舉例的方式提供，而不意圖是本發(fā)明的限制，除非指明了。實(shí)施例實(shí)施例1.利用離脫葉分析對(duì)大豆登記物的ASR抗性的測(cè)試
四十種推定的ASR抗性登記物被篩選ASR抗性。對(duì)ASR的抗性的葉片分析對(duì)這40個(gè) 系進(jìn)行，適合的易感的登記物作為對(duì)照，如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)11/805667中描述的。植物按照從 1到5的數(shù)字分值表明的抗性程度來(lái)計(jì)分，1-是免疫的，2-展現(xiàn)小于葉面積的約50%的紅色 /褐色病變，3-展現(xiàn)大于葉面積的約50%的紅色/褐色病變，4-展現(xiàn)小于葉面積的約50% 的棕色病變，5-展現(xiàn)大于葉面積的約50%的棕色病變，即，完全易感的。當(dāng)用來(lái)自密蘇里州 東南部的豆薯層銹菌MBHl的北美分離物感染時(shí)，對(duì)于登記號(hào)PU91309C、成熟的-組-2系， 以及對(duì)于PI507009、成熟的-組-6系，獲得在多個(gè)測(cè)試中平均銹病嚴(yán)重度分值為1. 5。PI291309C和PI507009各自與大豆系MV0079雜交來(lái)產(chǎn)生F2作圖群體，其個(gè)體用 104種SNP來(lái)基因分型，并測(cè)試ASR抗性。SNP根據(jù)親本的指紋圖譜分布和基因組覆蓋度 來(lái)選擇。在PU91309C中發(fā)現(xiàn)的ASR抗性基因座，稱(chēng)為ASR抗性基因座14，被作圖到靠近 Rppl基因的公眾大豆遺傳連鎖圖譜上的連鎖群G (附
圖1)。PI291309C中表征的ASR抗性 基因座在單體型基礎(chǔ)上不同于含有稱(chēng)為Rppl的ASR抗性基因座的大豆系，以及在對(duì)密蘇里 州東南部豆薯層銹菌菌株MBHl的表型應(yīng)答方面不同。發(fā)現(xiàn)三種SNP標(biāo)志物，NS0095012 (P < 0. 0050)和 NS01(^630 和 NS0119675 (每一個(gè)的 P < 0. 0010)處于與 ASR 抗性基因座 14 疾病表型應(yīng)答的高度連鎖不平衡中，因而與ASR抗性基因座14相關(guān)。所有三種SNP標(biāo)志物 被鑒定為在監(jiān)視ASR抗性基因座14的陽(yáng)性種質(zhì)滲入方面是有用的。SNP標(biāo)志物NS0095012 相應(yīng)于 SEQ ID NO 1 ；NSOl 19675 相應(yīng)于 SEQ ID NO :2 ；以及 NS0102630 相應(yīng)于 SEQ ID NO: 3。ASR抗性基因座15在PI507009中發(fā)現(xiàn)，作圖到公眾大豆遺傳連鎖圖譜的連鎖群 C2(附圖 2)。發(fā)現(xiàn)三種 SNP 標(biāo)志物，NS0127833 (R Sq > 0. 050)和 NS0118716 和 NS0093385 (每一個(gè)的R Sq > 0.200)處于與ASR抗性基因座15疾病表型應(yīng)答的高度連鎖不平衡中， 因而與ASR抗性基因座15相關(guān)。所有三種SNP標(biāo)志物被鑒定為在監(jiān)視ASR抗性基因座15 的陽(yáng)性種質(zhì)滲入方面是有用的。SNP標(biāo)志物NS0093385相應(yīng)于SEQ ID NO :4 ;NS0118716相 應(yīng)于 SEQ ID NO :5 ；以及 NS0127833 相應(yīng)于 SEQ ID NO :6。ASR抗性基因座16在PI507009中發(fā)現(xiàn)，作圖到公眾大豆遺傳連鎖圖譜的連鎖群 D2 (附圖 3)。發(fā)現(xiàn)兩種 SNP 標(biāo)志物，NSOl 18536 (R Sq > 0. 050)和 NS0113966 (R Sq > 0. 150)處于與ASR抗性基因座16疾病表型應(yīng)答的連鎖不平衡中，因而與ASR抗性基因座16 相關(guān)。兩種SNP標(biāo)志物被鑒定為在監(jiān)視ASR抗性基因座16的種質(zhì)滲入方面是有用的。SNP 標(biāo)志物 NS0113966 相應(yīng)于 SEQ ID NO 7 ；NS0118536 相應(yīng)于 SEQ ID NO :8。表 1 列出了 SNP 標(biāo)志物、它們的染色體位置、SNP位置、抗性等位基因和每種SNP的抗性等位基因的SEQ ID NO 編號(hào)。實(shí)施例2.檢測(cè)ASR抗性的示范性的標(biāo)志物分析
在一個(gè)實(shí)施方式中，DNA、RNA或cDNA的樣品中多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)可以通過(guò)核酸擴(kuò)增方 法的運(yùn)用來(lái)促成。這些方法特異性地提高跨越多態(tài)性位點(diǎn)、或包括所述位點(diǎn)的多核苷酸、以 及位于多態(tài)性位點(diǎn)的遠(yuǎn)端或近端的序列的濃度。這樣的擴(kuò)增的分子可以通過(guò)凝膠電泳、熒 光檢測(cè)方法或其他手段容易地檢測(cè)。用于擴(kuò)增和檢測(cè)與ASR抗性相關(guān)的基因組區(qū)域的示范 性的引物和探針在表2中給出。
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實(shí)施例3.對(duì)檢測(cè)具有ASR抗性基因座的大豆植物有用的寡核苷酸雜交探針
寡核苷酸也可以用于利用基于雜交的SNP檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)或分型與在此公開(kāi)的ASR抗 性基因座相關(guān)的多態(tài)性。提供了能夠與包括多態(tài)性的分離的核酸序列雜交的示范性的寡核 苷酸。設(shè)計(jì)以實(shí)驗(yàn)上確定的嚴(yán)格度來(lái)辨別在此提出的多態(tài)性的等位狀態(tài)的分析，處在本領(lǐng) 域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。示范性的分析包括Southern印跡、Northern印跡、微陣列、原位 雜交和基于雜交的多態(tài)性檢測(cè)的其他方法。用于基于雜交的SNP檢測(cè)的示范性的寡核苷酸 在表3中提供。這些寡核苷酸可以用放射性標(biāo)記物、熒光團(tuán)或其他化學(xué)發(fā)光的手段可檢測(cè) 地標(biāo)記，來(lái)幫助利用本發(fā)明的方法、與來(lái)自一種或更多種大豆植物的基因組的或擴(kuò)增的核 酸的樣品的雜交的檢測(cè)。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)ASR抗性大豆植物的方法，包括a.進(jìn)行標(biāo)志物輔助的選擇來(lái)鑒定具有ASR抗性基因座14的大豆植物，其中ASR抗性 基因座14可從PI291309C獲得；和b.產(chǎn)生所述大豆植物的子代，其中具有所述ASR抗性基因座14的子代至少展現(xiàn)了對(duì) ASR的部分抗性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中ASR抗性基因座14是可通過(guò)標(biāo)志物NS0095012、NS0119675 和NS01(^630的一種或更多種鑒定的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述標(biāo)志物輔助的選擇利用選自由單堿基延伸(SBE)、等位 基因特異性引物延伸測(cè)序(ASPE)、DNA測(cè)序、RNA測(cè)序、基于微陣列的分析、普通PCR、等位基 因特異性延伸、雜交、質(zhì)譜法、連接、延伸-連接以及Flap核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的分析構(gòu)成的組 的分析來(lái)進(jìn)行。
4.一種生產(chǎn)ASR抗性大豆植物的方法，包括a.進(jìn)行標(biāo)志物輔助的選擇來(lái)鑒定具有ASR抗性基因座15的大豆植物，其中ASR抗性 基因座15可從PI507009獲得；和b.產(chǎn)生所述大豆植物的子代，其中具有所述ASR抗性基因座14的子代至少展現(xiàn)了對(duì) ASR的部分抗性。
5.權(quán)利要求4的方法，其中ASR抗性基因座15是可通過(guò)標(biāo)志物NS0093385、NS0118716 和NS0127833的一種或更多種鑒定的。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述標(biāo)志物輔助的選擇利用選自由單堿基延伸(SBE)、等位 基因特異性引物延伸測(cè)序(ASPE)、DNA測(cè)序、RNA測(cè)序、基于微陣列的分析、普通PCR、等位基 因特異性延伸、雜交、質(zhì)譜法、連接、延伸-連接以及Flap核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的分析構(gòu)成的組 的分析來(lái)進(jìn)行。
7.一種生產(chǎn)ASR抗性大豆植物的方法，包括a.進(jìn)行標(biāo)志物輔助的選擇來(lái)鑒定具有ASR抗性基因座16的大豆植物，其中ASR抗性 基因座16可從PI507009獲得；和b.通過(guò)標(biāo)志物輔助的培育來(lái)產(chǎn)生大豆植物，其中所述大豆植物的每一個(gè)包含ASR抗 性基因座16以及ASR抗性基因座1-15的至少一種，每個(gè)所述大豆植物至少展現(xiàn)了對(duì)ASR 的部分抗性。
8.權(quán)利要求7的方法，其中ASR抗性基因座16是可通過(guò)標(biāo)志物NS0113966和 NS0118536之一或兩者鑒定的。
9.通過(guò)權(quán)利要求1、4或7的方法生產(chǎn)的、至少展現(xiàn)對(duì)ASR的部分抗性的大豆植物。
10.權(quán)利要求9的大豆植物，其中所述大豆植物至少展現(xiàn)了對(duì)ASR誘導(dǎo)真菌的至少一個(gè) 種類(lèi)的部分抗性。
11.權(quán)利要求9的大豆植物，其中所述ASR誘導(dǎo)的真菌是豆薯層銹菌或山馬蝗層銹菌。
12.一種用于檢測(cè)與ASR抗性相關(guān)的基因座的基本上純化的核酸分子，包括選自由SEQ ID NO 1到SEQ ID NO 80和其互補(bǔ)物構(gòu)成的組的核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物育種和疾病抗性的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明包括培育含有數(shù)量性狀基因座的大豆植物的方法，所述數(shù)量性狀基因座與對(duì)亞洲大豆銹病(ASR)的抗性相關(guān)，亞洲大豆銹病是與層銹菌屬物種相關(guān)的真菌病。本發(fā)明進(jìn)一步包括種質(zhì)、以及含有賦予對(duì)疾病抗性的數(shù)量性狀基因座(QTL)的種質(zhì)的用途，用于在ASR抗性的育種計(jì)劃中種質(zhì)滲入到優(yōu)良種質(zhì)中。
文檔編號(hào)A01H5/10GK102098909SQ200980124059
公開(kāi)日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2009年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月24日
發(fā)明者J. 拉瓦利 B., J. 巴利 G., C. 孔奇比多 V. 申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司