專利名稱：固體礦物組合物在提高作物土壤或草原土壤肥力中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)和園藝學(xué)領(lǐng)域，更具體而言，涉及尤其是用于農(nóng)業(yè)、園藝、樹藝或用于牧場和草地的肥料組合物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)中已知使用分散在作物土壤表面的有機(jī)或無機(jī)組合物來增加其肥力。因此，多種有機(jī)或無機(jī)肥料組合物是已知的，并已長期用于農(nóng)業(yè)、園藝和樹藝。為了肥沃，土壤應(yīng)在其有機(jī)和無機(jī)成分之間具有最佳的平衡。目前不存在使得可能明確定量土壤肥力的精確特征的定義。但是，越來越多的考慮是測量土壤中所包含的動物、植物和微生物生物活性來體現(xiàn)土壤的自我恢復(fù)能力，該能力與其肥力特性相關(guān)。例如土壤，人們可提到基于測量代表該土壤的樣品的二氧化碳產(chǎn)生的肥力測試。根據(jù)其他研究，至少部分土壤質(zhì)量，并因此其肥力特性與該土壤的酶活性相關(guān)，其尤其反映了土壤的微生物活性。就有機(jī)施肥物質(zhì)(堆肥、肥料、流體或半液體肥料、稻草、綠肥...)而言，研究施肥方式對微生物區(qū)系和土壤酶活性的影響包含于常規(guī)方法中，因為這類物質(zhì)代表了營養(yǎng)物的直接來源，即在土壤中生活的微生物的碳源和氮源。一些研究表明，農(nóng)用土壤中的微生物區(qū)系在數(shù)量上和質(zhì)量上小于對應(yīng)的原始森林土壤中的微生物區(qū)系。可以使用多種方法進(jìn)行土壤微生物區(qū)系研究，包括通過熏蒸-提取的總提取、土壤的總體呼吸或礦化活性的測量、流式細(xì)胞術(shù)、可復(fù)蘇的總微生物區(qū)系的提取和培養(yǎng)、一些種群特異性標(biāo)記如脂肪酸、固醇如麥角固醇的分析、微量培養(yǎng)板代謝譜、土壤提取物的酶活性分析，或更新的技術(shù)，如從土壤提取總核酸(宏基因組(metagenome))后通過PCR(聚合酶鏈反應(yīng))特異性擴(kuò)增編碼核糖體RNA(細(xì)菌的16S或真菌的18 的基因，然后進(jìn)行所擴(kuò)增的片段的DGGE測定(變性梯度凝膠電泳)。由于酶反應(yīng)涉及營養(yǎng)物再循環(huán)動力學(xué)和能量轉(zhuǎn)移至多細(xì)胞植物，現(xiàn)有技術(shù)中通常認(rèn)為，酶活性可代表土壤生物學(xué)活性的重要指示物。一般認(rèn)為，酶反應(yīng)與土壤肥力質(zhì)量密切相關(guān)，因為酶反應(yīng)進(jìn)行一些營養(yǎng)物的不可代謝形式至植物和微生物生物質(zhì)可直接利用的形式的轉(zhuǎn)化。尤其是，來自土壤的酶參與對植物生長重要且不由植物自身合成的有機(jī)物的分解和合成。換言之，酶活性反映了土壤基質(zhì)內(nèi)發(fā)生的生化過程的強(qiáng)度及性質(zhì)。由于此原因，酶活性代表了土壤進(jìn)行對保護(hù)其肥力特性重要的生化過程的生物學(xué)能力的指示物。對于土壤施肥，添加外源有機(jī)物(液體或半液體肥料、堆肥、肥料、淤渣)有助于短期和中期生物多樣性，但補(bǔ)給有機(jī)肥料為期幾周或幾個月后，微生物區(qū)系組成似乎回到最初的“平衡組成”。存在許多涉及微生物區(qū)系和補(bǔ)給至土壤的有機(jī)物的分解動力學(xué)，或涉及源自富含重金屬的有機(jī)城市垃圾的淤渣的研究。已發(fā)表的關(guān)于無機(jī)施肥物質(zhì)對微生物區(qū)系和土壤酶活性的作用的現(xiàn)有研究較少， 且已有的研究主要集中在基于氮的肥料、重金屬的影響、由于密集和反復(fù)的施肥而累積在農(nóng)用土壤中的痕量元素劑量的結(jié)果，如銅的情況，其曾經(jīng)且目前仍然廣泛用于植物檢疫制劑，尤其用于葡萄園。還可提到涉及添加無機(jī)化合物如石膏肥料和水鐵礦(ferrihydrite) 的一些研究，已評估了其對稻田土壤中的產(chǎn)甲烷細(xì)菌種群的影響。然而，現(xiàn)有技術(shù)中存在對旨在維持或增加土壤肥力，且就該土壤的酶活性而言具有有益特性的組合物的持續(xù)需要。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供包含以下配方(I)的固體礦物組合物的用途
-碳酸鍋4.58%-77.8%
-白云石3.85%-69.29%
-氯化鈉5.7%-12.4%
-木質(zhì)素疏酸鹽(Lignosulphate) 4.25%-8.49% -疏酸鉀0.37%-2.44%
-氧化鎂0.01%-0.07%
-元素破υ0.009%-0.066%以上百分?jǐn)?shù)由每種化合物相對于該礦物組合物的干物質(zhì)總重的重量百分?jǐn)?shù)組成，用于通過引起包含于該土壤中的至少一種下述酶的酶活性提高來增加土壤肥力， 該酶選自(i)磷酸酶、(ii) β-木糖苷酶、(iii) α-葡糖苷酶和(iv) β-葡糖苷酶。附圖描述


圖1顯示多種土壤的酶活性測量結(jié)果。圖IA至IG分別顯示具有植被和蚯蚓而無配方(I)的礦物組合物(左棒)的土壤和用配方(I)的礦物組合物處理(右棒)的土壤的多種酶活性的測量。在縱軸上，酶活性表示為每克干土壤和每小時的活性單位。圖IA顯示總體酶活性的測量。圖IB顯示酸性磷酸酶酶活性的測量。圖IC顯示堿性磷酸酶酶活性的測量。圖ID顯示β-葡糖苷酶酶活性的測量。圖IE顯示β-木糖苷酶酶活性的測量。圖 IF顯示α -葡糖苷酶酶活性的測量。圖IG顯示N-乙酰-氨基葡糖苷酶酶活性的測量。圖2Α顯示所測量的酶活性的相關(guān)環(huán)。圖2Β顯示圖2Α的軸1和軸2上的對象投射(多個實驗生態(tài)系統(tǒng))。圖3顯示變性梯度電泳凝膠(DGGE)圖片。左泳道無任何植被且無蚯蚓的土壤。 右泳道用配方(I)的礦物組合物處理的相同土壤。圖4顯示變性梯度電泳凝膠(DGGE)圖片。左泳道無任何植被且無蚯蚓的土壤。 中央泳道具有植被而無蚯蚓的土壤。右泳道用配方(I)的礦物組合物處理的具有植被而無蚯蚓的相同土壤。圖5顯示變性梯度電泳凝膠(DGGE)圖片。左泳道無任何植被且無蚯蚓的土壤。 中央泳道無任何植被而具有蚯蚓的土壤。右泳道用配方(I)的礦物組合物處理的無任何植被而具有蚯蚓的相同土壤。圖6顯示變性梯度電泳凝膠(DGGE)圖片。左泳道無任何植被且無蚯蚓的土壤。 中央泳道具有植被且具有蚯蚓的土壤。右泳道用配方(I)的礦物組合物處理的具有植被且具有蚯蚓的相同土壤。圖7顯示說明見于所測試的多種土壤中的細(xì)菌種群譜間相似性的系統(tǒng)樹，其基于圖3至6上所示的DGGE遷移帶譜。圖8顯示變性梯度電泳凝膠(DGGE)圖片。泳道“S”:無任何植被且無蚯蚓的土壤。 泳道“S+V”:無任何植被而具有蚯蚓的土壤“S”。泳道“S+M”:用配方(I)的礦物組合物處理的土壤“S”。泳道“S+P”:具有植被而無蚯蚓的土壤“S”。泳道“S+V+M”:用配方(I)的礦物組合物處理的土壤“S+V”。泳道“S+V+P”具有植被且具有蚯蚓的土壤“S”。泳道“S+P+M” 用配方(I)的礦物組合物處理的土壤“S+P”。泳道“S+V+P+M”:用配方(I)的礦物組合物處理的土壤“S+V+P”。圖9顯示使用鄰接法的基于16S rDNA的TM7門系統(tǒng)發(fā)育重建，其包括從圖8上顯示的一些DGGE凝膠遷移帶測序的細(xì)菌組和從數(shù)據(jù)庫返回的序列。
圖10顯示配方(I)的礦物組合物對植物生物質(zhì)產(chǎn)生的作用。在縱軸上以克干重表示的植物生物質(zhì)產(chǎn)生的測量。圖IOA顯示來自(i)具有植被而無蚯蚓的土壤(左棒)和來自(ii)用配方(I)的礦物組合物處理的相同土壤的植物生物質(zhì)產(chǎn)生間的比較。圖IOB 顯示來自⑴具有植被且具有蚯蚓的土壤(左棒)和來自(ii)用配方⑴的礦物組合物處理的相同土壤的植物生物質(zhì)產(chǎn)生間的比較。發(fā)明詳述本發(fā)明已表明，添加對土壤特異的礦物組合物導(dǎo)致該土壤酶活性譜的實質(zhì)性改變并增加其肥力。
尤其是，本發(fā)明已表明，添加對土壤特異的該礦物組合物導(dǎo)致已知對肥力特性重
要的一些酶，如磷酸酶、β-木糖苷酶、α-葡糖苷酶和β-葡糖苷酶的活性增加。
因此，本發(fā)明涉及包含以下配方(I)的固體礦物組合物的用途
-碳酸鈣 -白云石 -氯化鈉 -木質(zhì)素硫酸鹽 -硫酸鉀 -氧化鎂 -元素疏
4.58%-77.8%
3.85%-69.29%
5.7%-12.4%
4.25%-8.49%
0.37%-2.44%
0.01%-0.07%
0.009%-0.066%以上百分?jǐn)?shù)由每種化合物相對于該礦物組合物的干物質(zhì)總重的重量百分?jǐn)?shù)組成，用于通過引起包含于該土壤中的至少一種下述酶的酶活性提高來增加土壤肥力， 該酶選自(i)磷酸酶、(ii) β-木糖苷酶、(iii) α-葡糖苷酶和(iv) β-葡糖苷酶。優(yōu)選地，以上固體礦物組合物還包含選自碳酸氫鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、氧化鋅、碘
5化鉀、硫酸銅和硼酸的一種或多種其他化合物的組合。更優(yōu)選地，以上一種或多種其他化合物按以下量包含于礦物組合物中-0. 007% -0. 158% 碳酸氫鈉，-0. 0009% -0. 0434%硫酸亞鐵，-0. 004% -0. 040%硫酸錳，-0. 0006% -0. 0040%氧化鋅，-0. 0004 % -0. 0032% 碘化鉀，-0. 0002% -0. 0040%硫酸銅，和-0. 0006% -0. 0040%硼酸，以上百分?jǐn)?shù)組成每種化合物相對于該礦物組合物的干物質(zhì)總重的的重量百分?jǐn)?shù)。用于本發(fā)明的優(yōu)選的礦物組合物具有以下組成-45. 78% 碳酸鈣，-38. 49% 白云石，-9. 52% 氯化鈉，-5. 66%木質(zhì)素硫酸鹽，-0.49% 硫酸鉀，-0.014 氧化鎂，-0.015% 元素硫，和-適宜量的選自碳酸氫鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、氧化鋅、碘化鉀、硫酸銅和硼酸的化合物或至少兩種化合物的組合，以使該礦物組合物包含100wt%的成分，以上百分?jǐn)?shù)組成每種化合物相對于該礦物組合物干物質(zhì)總重的重量百分?jǐn)?shù)。優(yōu)選地，對于土壤施肥，應(yīng)以至少0. 01kg/m2，至多0. 10kg/m2的量添加配方(I)的礦物組合物。在另一方面，本發(fā)明還涉及土壤施肥的方法，其包括至少一個這樣的步驟，其中以至少0. 02-0. 04kg/m2的量向該土壤添加配方(I)的礦物組合物。通常，通過簡單分散在待處理的土壤上來向待施肥的土壤添加配方(I)的礦物組合物，其有利地是聚集體形式的固體組合物。磷酸酶催化磷酸酯鍵的水解，引起無機(jī)磷酸鹽釋放，其隨后可被植物用作代謝物。 一般認(rèn)為，此酶在磷酸鹽代謝循環(huán)中發(fā)揮重要作用，且對植物生長有影響。因此，土壤磷酸酶活性越高，尤其是堿性磷酸酶活性越高，這種土壤促進(jìn)植物生長的能力越強(qiáng)，即使降低該土壤的無機(jī)磷酸鹽含量。木糖苷酶涉及木聚糖(半纖維素)的水解，能夠為土壤微生物區(qū)系提供營養(yǎng)化合物，其一旦礦化即可被植物同化。木糖苷酶活性存在于木聚糖降解的最后步驟中，木聚糖是植物細(xì)胞壁的主要成分之一，且見于土壤中所含的植物廢物中。認(rèn)為葡糖苷酶活性是土壤質(zhì)量的指示物。葡糖苷酶活性涉及纖維素的水解，對土壤的肥力特性很重要，因為纖維素在數(shù)量上是存在于土壤中的豐度最高的化合物。 β -葡糖苷酶在土壤中發(fā)揮重要作用，因為該酶負(fù)責(zé)水解存在于植物廢物，及植物廢物分解后存在于土壤中的多種葡糖苷。認(rèn)為纖維素降解是發(fā)生在土壤碳循環(huán)內(nèi)的主要過程之一。土壤中纖維素的微生物分解是復(fù)雜的過程，涉及至少三類酶，分別為內(nèi)切-1，4-葡聚糖酶、外切-β-1，4-葡聚糖酶和β-1，4_葡糖苷酶。β-1，4-葡糖苷酶活性將纖維素降解產(chǎn)物如二糖(纖維二糖)水解為可直接被土壤中的微生物同化的葡萄糖分子。因此，只有在葡糖苷酶活性的存在下，土壤中所含的纖維素才能完全分解。認(rèn)為葡糖苷酶活性是植物生物質(zhì)周轉(zhuǎn)的指示物。α -葡糖苷酶活性水解由于植物廢物在土壤中分解而存在于其中的淀粉的降解產(chǎn)生的寡糖，產(chǎn)生D-葡萄糖作為終產(chǎn)物，其可以直接被存在于土壤中的微生物同化。如本文所使用，“土壤”更尤其旨在指作物土壤或草原土壤。作物土壤包含用于植物農(nóng)業(yè)的所有領(lǐng)域，包括園藝、樹藝和葡萄園的栽培土壤。草原土壤包含非栽培土壤，其尤其用來提供用于飼養(yǎng)，尤其是家畜飼養(yǎng)的新鮮或干燥的植物物質(zhì)。大體上，土壤通常由礦物成分和有機(jī)成分的組合組成，包含可變比例的沙、粘土、 淤渣、任意大小的石灰石、腐殖質(zhì)、有機(jī)廢物、微生物、空氣和水。如本文所使用，“酶活性”旨在指將給定的底物化合物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生自催化反應(yīng)的終產(chǎn)物的催化活性。可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任意適宜的方法進(jìn)行酶類型(i)磷酸酶，(ii) 木糖苷酶，(iii) α-葡糖苷酶和葡糖苷酶的酶活性測量。有利地，將少量土壤樣品懸浮于適宜體積的蒸餾水中，以獲得隨后用于具體酶測定的粗提取物?？梢砸匀我獬Ｒ?guī)方式進(jìn)行酶測定，通過將來自待測試土壤的粗提取物的等份試樣與酶活性底物一起孵育給定的一段時間，然后，一旦酶反應(yīng)已終止，即通常通過分光光度計讀數(shù)來定量催化反應(yīng)的產(chǎn)物。作為說明，可以方便地使用以下底物-對于磷酸酶活性4-硝基苯基二或三磷酸鹽，-對于β-葡糖苷酶活性4-硝基苯基β -D-吡喃葡糖苷，-對于β-木糖苷酶活性4-硝基苯基β -木糖苷，和-對于α-葡糖苷酶活性4-硝基苯基α -葡糖苷。為了測試N-乙酰-氨基葡糖苷酶活性，可以使用4-硝基苯基N-乙酰-β -D-氨
基葡糖苷。當(dāng)使用以上底物時，在405納米波長下測定光密度(OD)，通過分光光度法進(jìn)行催化反應(yīng)終產(chǎn)物的定量。本發(fā)明已顯示，向具有植被而無蚯蚓的土壤⑴或具有植被和蚯蚓的土壤(ii)添加配方(I)的礦物組合物誘導(dǎo)堿性磷酸酶活性的顯著增加。因此已顯示，通過向以上土壤類型⑴添加配方⑴的礦物組合物，與針對缺乏配方⑴的土壤類型⑴測定的堿性磷酸酶活性相比，堿性磷酸酶活性顯示高10倍。對于以上土壤類型(ii)，與針對具有相同組成但缺乏配方(I)的礦物組合物的土壤類型(ii)測定的磷酸酶活性相比，堿性磷酸酶活性通常至少增加2倍。本發(fā)明還已顯示，向具有植被而無蚯蚓的土壤(i)、具有植被和蚯蚓的土壤(ii) 或無任何植被而具有蚯蚓的土壤(iii)添加配方(I)的礦物組合物誘導(dǎo)β-木糖苷酶活性的顯著增加。因此已顯示，通過向土壤類型(i)添加配方(I)的礦物組合物，與針對未用配方(I)的礦物組合物處理的土壤類型(i)測定的木糖苷酶活性相比，β-木糖苷酶活性顯示至少高3倍。還已顯示，添加配方(I)的礦物組合物后針對土壤類型(ii)測定的木糖苷酶活性是針對未用配方(I)的礦物組合物處理的土壤類型(ii)測定的β-木糖苷酶活性的至少2倍高。對于以上土壤類型(iii)，與針對缺乏配方(I)的礦物組合物的土壤類型(iii)測定的木糖苷酶活性相比，木糖苷酶活性通常增加至少5倍。本發(fā)明還已顯示，向⑴具有植被而無蚯蚓的土壤、(ii)具有植被且具有蚯蚓的土壤或(iii)無任何植被而具有蚯蚓的土壤添加配方(I)的礦物組合物，誘導(dǎo)α-葡糖苷酶活性的顯著增加，與針對未用配方(I)的礦物組合物處理的土壤類型(i)、(ii)、(iii)測定的α-葡糖苷酶活性相比，其高4倍。本發(fā)明還已顯示，向具有植被和蚯蚓的土壤(ii)添加配方(I)的礦物組合物誘導(dǎo)葡糖苷酶活性的顯著增加，與針對缺乏配方(I)的礦物組合物的土壤(ii)測定的 β -葡糖苷酶活性相比，其至少高1. 5倍?，F(xiàn)在參照圖2Β，本發(fā)明已顯示，無論所處理的是什么類型的土壤，配方(I)的組合物都對以上定義的酶活性(i)至(iv)的增加具有統(tǒng)計學(xué)上顯著的作用。不希望受任意理論的限制，申請人認(rèn)為，添加配方(I)的組合物引起的土壤酶潛能的增加使得能夠提高有機(jī)物的礦化地過程(mineralizationtelluric process)。如上文所述，從酶的觀點看，配方(I)的組合物主要誘導(dǎo)就與土壤總體酶活性的數(shù)量比而言稱為“次要”的酶活性，如β-木糖苷酶、α-葡糖苷酶或堿性磷酸酶活性的增加。但是應(yīng)注意，配方(I)的礦物組合物還導(dǎo)致就它們與土壤總體酶活性的數(shù)量比而言稱為“主要”的酶活性的增加，如β-葡糖苷酶。不希望受任意理論的限制，申請人認(rèn)為，配方(I)的礦物組合物通過增加一些酶活性，同時不導(dǎo)致其他酶活性的顯著降低來引起土壤酶譜的“重新平衡”。此外，本發(fā)明獲得的結(jié)果顯示，配方(I)的礦物組合物對酶活性的影響取決于添加該制劑的土壤類型而不同，這證明此制劑對酶活性的影響依賴于關(guān)于活生物，尤其是在包含于所處理的土壤中的菌群和動物區(qū)系，包括微生物，尤其是細(xì)菌和真菌微生物方面的質(zhì)量和/或數(shù)量組成。這些結(jié)果顯示，配方(I)的礦物組合物對土壤生物學(xué)活性具有刺激作用。如實施例中所示，可以在配方(I)的礦物組合物存在下在土壤類型(i)、(ii)和 (iii)中針對⑴堿性磷酸酶，(ii) β -木糖苷酶，( ) α-葡糖苷酶和(iv) β -葡糖苷酶的每種酶活性觀察到的增加不是指添加配方(I)的組合物誘導(dǎo)所處理的土壤的酶活性的總體增加。因此，顯示用配方(I)的礦物組合物處理的土壤的總體酶活性基本上與未用配方(I)的礦物組合物處理的相同土壤的總體酶活性一樣?？梢酝ㄟ^定量二乙酸熒光素底物 (FDA)的非特異性降解來測定土壤的總體酶活性。相反，以上酶活性(i)至(iv)的特異性增加引起的用配方(I)的組合物處理的土壤肥力特性的改善可通過以下事實來說明，與未用配方(I)的組合物處理的相同土壤相比，添加配方(I)的組合物誘導(dǎo)地上和地下的植物生物質(zhì)產(chǎn)生增加至少1.5倍。因此，已顯示，如根據(jù)收獲后的植物生物質(zhì)干重所計算，向具有植被而無蚯蚓的土壤(i)添加配方(I) 的組合物誘導(dǎo)地上和地下的植物生物質(zhì)產(chǎn)生增加至少1.5倍。還已顯示，如根據(jù)收獲后的生物質(zhì)干重所計算，向具有植被和蚯蚓的土壤(ii)添加配方(I)的組合物誘導(dǎo)地上和地下
8的植物生物質(zhì)產(chǎn)生增加至少2倍。一般而言，申請人觀察到，通過添加配方(I)的礦物組合物獲得的土壤質(zhì)量改善可通過大多數(shù)植物培養(yǎng)物的地上和地下植物生物質(zhì)的增加來說明，該大多數(shù)植物培養(yǎng)物據(jù)稱“用于大規(guī)模農(nóng)業(yè)”和豆類，也用于樹藝和葡萄園。此外，實施例中顯示，配方(I)的礦物組合物還導(dǎo)致存在于土壤中的細(xì)菌種群譜的改變。通過使用DGGE法(變性梯度凝膠電泳)分析16S核糖體DNA的細(xì)菌種群譜研究揭示，無論所測試的土壤是什么類型，添加配方(I)的組合物導(dǎo)致(i) 一些細(xì)菌分類單位相對豐度的增加，其通過一條或多條遷移帶的相對色密度的增加體現(xiàn)在電泳凝膠上；和(ii) 其他細(xì)菌分類單位相對豐度的降低，其通過一條或多條其他遷移帶的相對色密度的降低來體現(xiàn)。因此，實施例中給出的結(jié)果顯示，與未用配方(I)的礦物組合物處理的土壤相比， 配方(I)的礦物組合物引起多個細(xì)菌分類單位間優(yōu)勢比的實質(zhì)性可檢測的改變。如實施例中所說明，當(dāng)比較通過DGGE獲得的對應(yīng)于16S rDNA片段的條帶的遷移譜時，其顯示，配方(I)的礦物組合物在具有植物群落和動物群落復(fù)雜環(huán)境的土壤中，尤其是在具有植被和/或蚯蚓的土壤中誘導(dǎo)細(xì)菌種群譜的最重要的改變，已知配方(I)的組合物的作用隨所處理的土壤的復(fù)雜性而增加。還通過測序?qū)?yīng)于在DGGE中占優(yōu)勢的一些條帶的16S rDNA片段來進(jìn)行了研究， 其分別存在于未處理或用配方(I)的礦物組合物處理的每種具有不同生物復(fù)雜性的土壤。 然后，可以根據(jù)序列數(shù)據(jù)確定對應(yīng)的主要細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。由于許多陸生(telluric) 細(xì)菌不可培養(yǎng)因而不可鑒定，所以我們的序列與已發(fā)表的數(shù)據(jù)間的比較并非總是導(dǎo)致分類學(xué)鑒定。但是，結(jié)果顯示，對于包含植被而無蚯蚓的土壤(i)和無任何植被而具有蚯蚓的土壤(ii)，配方(I)的礦物組合物促進(jìn)與存在于根際內(nèi)和泥炭層中的TM7門細(xì)菌相關(guān)的細(xì)菌種群的優(yōu)勢。一般而言，16S rDNA測序后的分析顯示，通過促進(jìn)它們中的一些分類單位的發(fā)展和減慢其他分類單位(包括占優(yōu)勢地存在于類似的但未用配方(I)的組合物處理的土壤中的細(xì)菌分類單位)的發(fā)展，添加配方(I)的礦物組合物誘導(dǎo)細(xì)菌分類單位相對豐度的大范圍改變。在每種情況下，配方(I)的礦物組合物引起細(xì)菌種群譜發(fā)生改變，其程度與土壤生物復(fù)雜性成比例。作為說明，當(dāng)將無任何植被且無蚯蚓的土壤與具有植被和蚯蚓的土壤比較時，可以觀察到由配方(I)的組合物誘導(dǎo)的細(xì)菌種群譜越來越多的顯著改變。因此，實施例的結(jié)果顯示，取決于陸地環(huán)境的類型，尤其是取決于植被的存在或缺乏，和/或取決于蚯蚓的存在或缺乏，配方(I)的礦物組合物的作用在數(shù)量上和質(zhì)量上都可以不同。一般而言，添加配方(I)的礦物組合物引起的酶活性譜和細(xì)菌種群譜的改變代表了土壤肥力增加的指示物，其通過在地上和地下的植物生物質(zhì)產(chǎn)生中觀察到的增加來說明。利用以下實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。 實施例A.實施例的材料和方法
Α. 1.材料土壤是在Tardenois (r6gion Picardie，法國)區(qū)域采集的淤泥-粘土類型的農(nóng)用土壤。隨機(jī)進(jìn)行土壤取樣。然后在環(huán)境溫度下干燥土壤，然后在篩目尺寸為2mm的篩子上蹄選。用來產(chǎn)生土壤植被的植物是隸屬于商業(yè)上廣泛銷售的物種的黑麥草(Iolium)?？梢允褂肑ardiland公司(Logne，法國)銷售的黑麥草。用于這些實驗的蚯蚓是隸屬于Nicodrilus giardi物種(也稱為Allolobophora terrestris 或 Aporrectodea terrestris)的 anecic 螺蟲。除在對照土壤樣品中外，在每個土壤測試樣品中添加配方(I)的礦物組合物至劑量等于200kg/ha。Α. 2.對照土壤樣品(對照實驗生態(tài)系統(tǒng))和測試樣品(測試實驗生態(tài)系統(tǒng))的制備。實驗生態(tài)系統(tǒng)是各包含Ikg干土壤的塑料盆。將此土壤再濕潤至其在田野中的容
So在感興趣的盆中，加入蠕蟲至生物質(zhì)為6g/kg干土壤。用1克黑麥草種子播種感興趣的盆。黑麥小植物達(dá)到約5cm高時向盆中加入蠕蟲。實驗包含各對應(yīng)于8種形式的3個重復(fù)(或系列)，即總量為M個實驗生態(tài)系統(tǒng)。將這些實驗生態(tài)系統(tǒng)在環(huán)境溫度Q0-23°C )下放置1.5個月。此段時間之后，收獲黑麥草(地上部分和地下部分-根)，然后放置在烘箱中測量其干重。對每個盆，收集兩個土壤樣品批次來進(jìn)行生化和分子分析。A. 3.酶分析在4°C下將1克土壤重懸于5mL蒸餾水中。此懸液是用于酶測定的粗提取物。1.異苷酶測定(PNP)反應(yīng)物的制備Na2CO3 :2gr 溶解于 IOOmL 蒸餾水中。酶底物用80mg底物溶解于IOmL蒸餾水中制備溶液。-4-硝基苯基磷酸二(三)鹽(PNP-磷酸鹽)。此底物使得能夠顯示涉及有機(jī)磷酸鹽礦化的磷酸酶的酶活性。-4-硝基苯基β -D-吡喃葡糖苷(ΡΝΡ- β -葡糖苷)。水解此底物使得能夠定量涉及纖維素降解的最后步驟的葡糖苷酶的活性。-4"硝基苯基N-乙酰-β -D-氨基葡糖苷(PNP N-乙酰-β -D-氨基葡糖苷)。殼多糖是廣泛散布在土壤中的底物，衍生自節(jié)肢動物角質(zhì)層，且屬于多種真菌的膜成分。殼多糖酶和N-乙酰-氨基葡糖苷酶介導(dǎo)的此底物的降解是釋放涉及碳循環(huán)和氮循環(huán)的氨基糖的初步步驟。-通過涉及木聚糖降解的最后步驟的β-木糖苷酶水解4-硝基苯基β-木糖苷 (ΡΝΡ-β-D-木糖苷)，木聚糖是植物細(xì)胞壁的主要成分之一。-4-硝基苯基α -葡糖苷(ΡΝΡ- α -D-葡糖苷)。水解此底物的α -葡糖苷酶是涉及淀粉降解的酶之一。在4°C下于煙色管(smoked vial)中保存這些溶液。磷酸鹽緩沖液pH5 將 24. 3mL 0. IM 的檸檬酸與 25. 7mL Na2HPO4,12Η20(0· 2Μ)組
口 O硼酸鹽緩沖液ρΗ9 將IOmL 0. IM的HCl與90mL 0. IM的硼酸鈉組合。緩沖液保存于4°C下。微量培養(yǎng)板測定在微量培養(yǎng)板中進(jìn)行測定。對每種酶(酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、β-葡糖苷酶、 α -葡糖苷酶和β -木糖苷酶)，按以下完成一個空白、三個對照底物、三個對照酶和三個測定?？瞻?100 μ 1蒸餾水-25 μ 1 Mac Ilvain緩沖液，取決于測試酶pH為5或9對照底物-50 μ 1蒸餾水-25 μ 1磷酸鹽緩沖液ρΗ5或?qū)τ趬A性磷酸酶為硼酸鹽緩沖液ρΗ9-50 μ IPNP 底物對照酶-50 μ 1蒸餾水-25 μ 1 Mac Ilvain 緩沖液 pH5 或 9-50 μ 1 酶溶液(土壤)測定-50μ 1 PNP 底物-25 μ 1 Mac Ilvain 緩沖液 pH5 或 9-50 μ 1 酶溶液(土壤)在第一個底部圓錐形變細(xì)的平板中進(jìn)行此測定，將其在攪拌下于烘箱中在37°C孵育2h。孵育后，向每個孔中加入75 μ 1 2%的NA2CO315然后于2500轉(zhuǎn)/分鐘離心微量培養(yǎng)板10分鐘。對每個孔，將50 μ 1上清轉(zhuǎn)移入孔中含有250μ1 2%的NA2CO3W第二平板中。手動攪拌后，用分光光度計于405nm對微量培養(yǎng)板進(jìn)行讀數(shù)并與空白比較。從預(yù)先測定的標(biāo)準(zhǔn)范圍開始，通過下式給出OD和苯酚量之間的關(guān)系Χ(μ g 苯酚)=計算的 ODxl. 14，其中計算的OD = OD測定-(0D對照底物+OD對照酶)酶活性定義為每克土壤每小時釋放的苯酚量。2.使用FDA ( 二乙酸熒光素)的微生物活性測定反應(yīng)物的制備FDA 將溶解于IOmL丙酮的0. 3g FDA按ImL/管分裝至玻璃管中。保存在_20°C 下的此溶液為貯存液。進(jìn)行測定前按1 10臨時稀釋此貯存液。磷酸鹽緩沖液pH 7 6. 5mL 0. IM 的檸檬酸 +43. 6mL Na2HPO4,12Η20(0· 2Μ)。微量培養(yǎng)板測定在微量培養(yǎng)板中進(jìn)行測定。對每一劑量，按以下完成一個空白、三個對照底物、三個對照酶和三個測定?？瞻譥150μ1水-50 μ 1磷酸鹽緩沖液ρΗ7對照酶_50μ1水-50 μ 1 Mac Ilvain 緩沖液 pH7-100 μ 1 土壤對照底物-100μ1水-50 μ 1 Mac Ilvain 緩沖液 pH7-50 μ 1 FDA (稀釋溶液)測定-100μ 1 土壤-50 μ 1 Mac Ilvain 緩沖液 pH7-50 μ 1 FDA將微量培養(yǎng)板在37°C的烘箱中放置2小時。然后將其2500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。將每個孔的100 μ 1體積的上清轉(zhuǎn)移入預(yù)先裝有100 μ 1冰冷的Macllvain冰緩沖液pH7G°C)的第二圓底平板的孔中。與空白相比，利用分光光度計在490nm波長下進(jìn)行平板讀數(shù)。對于FDA，酶活性表示為熒光素量/克土壤/小時。測定標(biāo)準(zhǔn)范圍使得可能基于下式建立OD和熒光素量(yg)之間的關(guān)系X(yg 熒光素)=計算的 OD * 0.0863.分子分析為了隨著應(yīng)用于土壤的多種處理測序優(yōu)勢細(xì)菌種群和/或感興趣的細(xì)菌種群特異的16S核糖體DNA基因，從包含于醇中的土壤樣品再提取DNA。
3.1. 土壤 DNA 提取所選擇的用于從土壤提取DNA的方法依賴于CTAB緩沖液(十六烷基三甲基溴化銨)的使用。24 個土壤樣品(8 種形式S、S+P、S+M、S+V、S+V+P、S+P+M、S+V+M、S+V+M+P x3 個重復(fù))各收集500mg并與1000 μ L提取緩沖液CTAB組合于含陶瓷、二氧化硅和玻璃珠 (LysingMatrix E, MP Biomedicals)的管中。按 6. 5m/s 利用 FastPr印-24 型勻菜器(MP Biomedicals)來進(jìn)行細(xì)胞裂解45秒。然后將樣品在65°C的水浴中孵育1小時。用酚氯仿異戊基04 24 1)和氯仿異戊基04 1)結(jié)合WiaseLock Gel Tubes (VffR)進(jìn)行核酸的提取和純化。然后用PEG (聚乙二醇)沉淀DNA，用70°乙醇洗滌沉淀物并溶解在50 μ L EB緩沖液(Tris HCl)中。為了以足夠的量提供DNA用于隨后的反應(yīng)，將3個重復(fù)的提取的DNA組合用于8種形式的每一個。從而用分光光度計(Nanodrop)定量DNA并評估其純度(無腐殖酸，無蛋白質(zhì))。3. 2.細(xì)菌16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增用通用細(xì)菌引物通過TC-3000型熱循環(huán)儀(Techne)進(jìn)行PCR(聚合酶鏈反應(yīng))。 對于每個反應(yīng)，加入0. 25 μ M的每種引物、10 μ L 10Χ PCR緩沖液、1.5mM MgCl2、0. 2mM dNTP (脫氧核糖核苷三磷酸)、6U Taq聚合酶(Invitrogen)、15-80ng DNA基質(zhì)和無菌水至終體積為 100 μ L。用于 PCR 的引物是 518r(5，-ATT ACC GCG GCT GCT GG_3，-SEQ ID N01)和 GC-338f(5， -CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGGGCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3，-SEQ ID N02)，其精確擴(kuò)增包含于細(xì)菌中的16S核糖體DNA的可變區(qū) V3 (約200pb)。連接在引物GC-338f的5，端的富含GC的序列(GC封條)阻止完整的DNA 雙鏈在通過DGGE分離PCR片段期間變性。PCR擴(kuò)增以94°C起始變性5分鐘開始，隨后是 1)94°C變性30秒，2)54°C雜交45秒和!3)72°C延伸1. 5小時的32個循環(huán)。其以72°C最后延伸20分鐘結(jié)束。3. 3. PCR產(chǎn)物的顯示和定量按IX的濃度將PCR產(chǎn)物加樣在用STOR Safe (Invitrogen)染色的2%瓊脂糖凝膠上。在UV平板上顯示PCR片段并用SmartLadder型(Eurogentec)定量大小標(biāo)記定量。3. 4. DGGE在DCodeUniversal Mutation Detection系統(tǒng)(Bio-Rad)上進(jìn)行DG( 測定(變性梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳)。在TAE 0. 5X(Tris-乙酸-EDTA)中將PCR產(chǎn)物樣品(100 μ L， 即約500ng)加樣在8%聚丙烯酰胺凝膠上。為了獲得具有30-70%線性變性梯度的聚丙烯酰胺凝膠，將11. 2mL溶液O % (丙烯酰胺20mL, TAE 50X 2mL和H2O適量至IOOmL)與4. 8mL 溶液100% (丙烯酰胺20mL, TAE 50X 2mL,甲酰胺40mL，尿素42g和H2O適量至IOOmL)組合以獲得稀溶液(30% )。以相同的方式，將4. SmL溶液0%與11. 2mL溶液100%組合以獲得濃溶液(70% )。在60°C下75V進(jìn)行電泳16小時。遷移后，在溴化乙錠浴中顯示凝膠并在UV下拍照。用手術(shù)刀切出并收集感興趣的條帶。3.5.測序感興趣的條帶通過使切出的條帶于4°C下在50 μ L超純水中過夜靜置來單獨洗脫條帶中所包含的DNA。將2yL洗脫物用于通過之前描述的方案的PCR單獨地再擴(kuò)增條帶。為了檢驗單條帶在各PCR產(chǎn)物中的存在，將PCR產(chǎn)物緊挨著最初的樣品加樣在DGGE凝膠(梯度 30-50%)上。重復(fù)該方法直到針對各PCR產(chǎn)物獲得單條帶。然后遞送純的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序(Gexbyweb, Genome Express)。Α. 4. DGGE遷移帶譜的統(tǒng)計學(xué)分析1.譜的圖解和統(tǒng)計學(xué)分析利用Quantity One軟件v4. 6. 5 (Biorad)恢復(fù)并分析凝膠圖像，該軟件使得可能自動檢測DGGE譜上的條帶。按以下執(zhí)行代表譜帶的二元矩陣相對于可以在同一凝膠的所有樣品中檢測到的條帶，條帶的存在編碼為‘1’，其缺失編碼為‘0’。基于此二元矩陣， 通過使用相似系數(shù)產(chǎn)生距離矩陣。在此使用Dice系數(shù)6Dire = 2NAB/(NA+NB)，其中隊和隊分別代表樣品A和B中的條帶數(shù)，Nab為共有的條帶數(shù))。然后用UPGMA定組(Unweighted Pairwise Grouping with Mathematical Average)禾口鄰接法分析距離矩陣，其使得可能由此推斷描述所有不同樣品間的距離的系統(tǒng)樹。2.序列的分子和系統(tǒng)發(fā)育分析用Chromas LITE軟件2. 01版恢復(fù)和顯示序列的層析圖，也使得能夠手動校正序列。通過BLAST分析將序列與可在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得的所有序列進(jìn)行比較，返回與測試序列相比具有最高同一性得分的序列。用Ribosomal Database Project II Classifier進(jìn)行另一分類學(xué)指派分析。然后用CLUSTALW軟件將獲得的序列與可從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得的代表TM7門細(xì)菌
13的47個序列、TM6的2個序列、組I白蟻的2個序列和綠色非硫細(xì)菌的2個序列比對。用 SEAVIEW程序手動校正比對(140pb)。最后用MEGA4軟件以1000自引重復(fù)產(chǎn)生鄰接樹。B.結(jié)果實施例1 配方(I)的組合物對土壤酶活性的作用在
圖1上給出酶活性測量的所有結(jié)果，分別為總體酶活性(
圖1A)，酸性磷酸酶活性(
圖1B)，堿性磷酸酶活性(
圖1C)，β -葡糖苷酶活性(
圖1D)，β -木糖苷酶活性(圖 ΙΕ), α -葡糖苷酶活性(
圖1F)和N-乙酰-氨基葡糖苷酶活性(
圖1G)。1.Α/在土壤的存在下無論所測試的是什么酶，在用配方(I)的礦物組合物處理或未處理的無任何植被且無蚯蚓的土壤間未顯示顯著的增加。同樣，未檢測到有害作用。1.Β/在土壤和黑麥草的存在下配方(I)的礦物組合物的存在不影響FDA降解。在配方(I)的礦物組合物存在下， 酸性磷酸酶、β -葡糖苷酶和N-乙酰-氨基葡糖苷的活性比在對照中測量的活性高。但是， 由于可變性，所觀察到的差異在5%的風(fēng)險α下并不顯著。相反，堿性磷酸酶、β-木糖苷酶和α -葡糖苷酶活性分別以10、4和4的倍增因子顯著增加。這些結(jié)果顯示，在植被存在下Γ /配方(I)的礦物組合物對土壤酶活性有作用；2° /此作用適用于根據(jù)強(qiáng)度次要的酶。1. C/在土壤和蚯蚓的存在下當(dāng)在蠕蟲(蚯蚓)的存在下向土壤添加配方(I)的礦物組合物時，兩種酶的活性顯著增加。這些酶是木糖苷酶(其活性乘6)和α-葡糖苷酶(其從25Ug 土壤sePtT1 的對照活性變?yōu)?12Ug 土壤seftT1)。其他測試酶的活性未改變。1. D/在蚯蚓和黑麥草的存在下在蚯蚓和黑麥草的存在下，配方(I)的礦物組合物使得能夠以因子3增加堿性磷酸酶活性，以因子1.5增加葡糖苷酶活性，以因子2. 5增加木糖苷酶活性和以因子 4增加α-葡糖苷酶活性。1. E/主成分分析此分析目的在于在統(tǒng)計學(xué)上確認(rèn)配方(I)的礦物組合物對土壤酶活性的作用的存在，其取決于多種測試形式(植物和/或蚯蚓的存在···)。圖2Α上所示的相關(guān)環(huán)顯示，代表總方差的35%的軸1由堿性磷酸酶、α -葡糖苷酶、β-木糖苷酶活性和FDA降解定義。對應(yīng)于方差的21%的軸2反過來由酸性磷酸酶、 N-乙酰氨基葡糖苷酶和β -葡糖苷酶活性定義。如圖2Β上所示，兩個軸上的對象投射顯示配方(I)的礦物組合物處理與多種對照間的明確相反。因此，配方(I)的礦物組合物對所測試的土壤酶譜確實有作用。本說明書末尾的表1中更精確地描述了圖IA至IG上所表示的酶活性測量的結(jié)^ ο在表1中- “S”旨在指無任何植被且無蚯蚓的土壤，- “S+M”旨在指用配方(I)的礦物組合物處理的土壤“S”，
- “S+V”旨在指無任何植被而具有蚯蚓的土壤，- “S+V+M”旨在指用配方⑴的礦物組合物處理的土壤“S+V”，- “S+P”旨在指具有植被而無蚯蚓的土壤，- “S+P+M”旨在指用配方⑴的礦物組合物處理的土壤“S+P”，- “S+V+P”旨在指具有植被且具有蚯蚓的土壤，和- “S+V+P+M”旨在指用配方(I)的礦物組合物處理的土壤“S+V+P”。此研究使得可能在實驗上表明添加配方(I)的礦物組合物能夠顯著增加植物生物質(zhì)的產(chǎn)生。還已顯示，添加配方(I)的礦物組合物來增加土壤酶潛能，以優(yōu)化有機(jī)物的礦化過程還可以按通過主成分分析所證明來驗證。但是，所獲得的結(jié)果顯示，配方(I)的礦物組合物的有益作用依賴于Γ /所考慮的酶因此，兩種主要的活性，即表征此土壤的酸性磷酸酶和β -葡糖苷酶的活性不是受配方(I)的礦物組合物影響最大的酶。實際上，可以針對“次要”酶(不是就其在土壤性能中的作用而言，而是就其活性水平而言)，如β -木糖苷酶、α -葡糖苷酶或堿性磷酸酶觀察到這種有益作用。這意味著，配方(I)的礦物組合物使得可能“重新平衡” 土壤酶譜而不引起其他活性的任意降低。2° /占優(yōu)勢的方式實際上，所獲得的結(jié)果明顯取決于所測試的形式(存在或不存在黑麥草/夜魚餌蚓(night crawler)).因此，配方(I)的礦物組合物的作用取決于活生物(植物/動物)。 此結(jié)果強(qiáng)烈地表明，配方(I)的礦物組合物作為刺激土壤的一些生物活性的催化劑起作用。顯示由配方(I)的礦物組合物引起的土壤酶譜，尤其是糖類農(nóng)業(yè)聚合物 (agro-polymer)途徑中的改變產(chǎn)生了此改變是否由微生物區(qū)系的改變指定的問題。這是以下實施例2的目的。實施例2 配方(I)的礦物組合物對土壤細(xì)菌種群的作用比較針對8個實驗生態(tài)系統(tǒng)獲得的PCR擴(kuò)增的16S rRNA基因片段的DGGE分析來顯示多種處理后細(xì)菌群落遺傳多樣性的變化。DGGE譜的目檢揭示，細(xì)菌種群的數(shù)目并不由于應(yīng)用于土壤的處理而實質(zhì)性改變。相反，取決于應(yīng)用于土壤的處理，優(yōu)勢微生物種群的差異似乎非常大。A/PRP礦物溶液在土壤單獨存在下的影響結(jié)果表示在圖3中與土壤單獨(譜幻相比，添加配方(I)的礦物組合物引起細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)內(nèi)發(fā)生改變。隨著組合物(I)的添加，土壤單獨(紅色)中的優(yōu)勢種群在土壤中不再占優(yōu)勢(條帶消失或變淺)。但是，不應(yīng)總是將條帶強(qiáng)度的消失/降低解釋為相關(guān)分類單位的丟失。實際上，其可以僅反映在種群中的相對密度的改變，其中一些種群的增加可引起其他種群降低至DGGE檢測閾值以下。在添加組合物(I)的土壤中，一個細(xì)菌種群顯示占優(yōu)勢(綠色)，雖然其已存在于土壤單獨中。這可以表明此種群在組合物(I)的存在下發(fā)展，或在土壤單獨中占優(yōu)勢的種群的調(diào)節(jié)?？梢酝ㄟ^以下事實來確認(rèn)最后一種假設(shè)就條帶強(qiáng)度而言，用組合物(I)處理的土壤樣品的譜更同質(zhì)，因此組合物(I)可作為調(diào)節(jié)劑。B/PRP礦物制劑在黑麥草存在下的影響結(jié)果表示在圖4中。在黑麥草的存在下(譜S+P)，與土壤單獨相比，細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)劇烈改變。在優(yōu)勢種群中，可以觀察到在土壤單獨中未檢測到的高度優(yōu)勢種群(條帶9)。通過在黑麥草的存在下添加組合物(I)，不再可以觀察到這些優(yōu)勢種群。在此譜中似乎強(qiáng)度最高的條帶E對應(yīng)于這樣的種群，其可以已在組合物(I)的存在下活化，或由于在黑麥草單獨存在下占優(yōu)勢的那些種群的調(diào)節(jié)而變得占優(yōu)勢。同樣在此，其因此無可爭論地顯示，組合物(I)作為存在于土壤中的細(xì)菌群落的調(diào)節(jié)劑起作用。C/PRP礦物組合物在蚯蚓存在下的影響結(jié)果表示在圖5中。在蚯蚓的存在下(譜S+V)，存在于土壤中的細(xì)菌群落也似乎重建。雖然大量條帶是共有的，但種群的相對比例顯著改變。在蚯蚓存在下，尤其要提到的是三個優(yōu)勢種群(條帶1，4和7)的存在。在蠕蟲的存在下添加組合物(I)導(dǎo)致仍然不同的群落間結(jié)構(gòu)。如果確實觀察到譜 S+V共有的種群，那么其相對比例似乎已改變。實際上，對應(yīng)于條帶A和6的種群較為少見， 相反，對應(yīng)于條帶3的種群在組合物(I)的存在下變得占優(yōu)勢。此條帶3不對應(yīng)于在譜S+V 上檢測的條帶C (見序列)。雖然存在強(qiáng)條帶且因此存在優(yōu)勢組，但在組合物(I)的存在下可在整個譜上觀察到，PRP作用表現(xiàn)為具有相對同質(zhì)的密度的微生物種群更高的多樣性。同樣在該情況下，即使在蚯蚓的存在下也可以觀察到組合物(I)的調(diào)節(jié)作用。D/PRP礦物組合物在黑麥草和蚯蚓存在下的影響結(jié)果表示在圖6中。與土壤單獨(譜S)相比，黑麥草加蠕蟲的組合(譜S+V+P)對細(xì)菌群落具有實質(zhì)性影響。對應(yīng)于條帶D和8的種群變得占優(yōu)勢。蠕蟲/黑麥草組合中的其他優(yōu)勢種群對應(yīng)于條帶8。在黑麥草和蠕蟲的存在下添加組合物(I)顯著改變細(xì)菌群落。對應(yīng)于條帶D和8 的種群不再占優(yōu)勢，而另一種群(綠色，未獲得序列)似乎通過組合物(I)直接活化，或從影響其他種群的調(diào)節(jié)受益。在這種情況下，針對其他形式觀察到的組合物(I)的作用較不
顯者ο實施例3 配方(I)的礦物組合物對細(xì)菌優(yōu)勢種群的作用的特異性。通過考慮條帶的存在(因此細(xì)菌群落的存在)及其強(qiáng)度二者來進(jìn)行多種處理間的相似性研究(圖7)。此分析可以包括兩種情況Γ /組合物⑴的作用較不顯著。在這種情況下，無組合物⑴的土壤的細(xì)菌譜應(yīng)與用組合物(I)處理的相同土壤的細(xì)菌譜具有高度的相似性。那么這兩種形式在圖7上所示的相似性系統(tǒng)樹上集合在一起或彼此相距不遠(yuǎn)。2° /組合物⑴的作用非常顯著。在這種情況下，與相同的未處理的土壤的細(xì)菌譜相比，用組合物(I)處理的土壤的細(xì)菌譜具有低相似系數(shù)。那么它們各自在系統(tǒng)樹上的位置彼此距離相對遠(yuǎn)。通過圖形表示在圖7上的分析顯示，土壤( 和用組合物(I)處理的土壤單獨 (S+V)存在于同一聚簇水平中。這意味著，與其他所測試的處理相比，組合物(I)對既無夜魚餌蚓也無植物的土壤具有相對適中的作用。相反，組合物⑴對包含蚯蚓和黑麥草的土壤(S+V+P+M)的作用非常明顯，因為此處理非常不同于其他處理，尤其不同于包含蠕蟲/植物而無組合物(I)的處理(S+V+P)。 這還可以針對包含黑麥草的土壤(S+P)觀察到，因為后者相對不同于具有黑麥草和組合物 (I)的土壤(S+P+M)。對于包含蚯蚓的土壤(S+V)，與具有蚯蚓和組合物(I)的土壤(S+V+M) 相比，雖然該作用是不可否認(rèn)的，但其較不顯著。實施例4 通過測序?qū)?yīng)于細(xì)菌優(yōu)勢種群的16S rDNA片段的鑒定測定A/用于測序的DGGE凝膠圖8中呈現(xiàn)的DGGE凝膠顯示收集、純化，然后測序的多種條帶。由于其高的譜相對強(qiáng)度而選擇這些條帶。應(yīng)注意，由于純化它們的太多困難，未能測序一些優(yōu)勢條帶。B/比較土壤⑶/ 土壤+PRP (S+M)的好的序列在添加組合物⑴的土壤(S+M)中，一個細(xì)菌種群顯示占大多數(shù)(條帶15)。BLAST 分析將此組序列與不可培養(yǎng)的細(xì)菌分類單位，因此與形態(tài)學(xué)上不可鑒定的結(jié)構(gòu)的序列 (Genbank檢索號EF 157158。同一性百分?jǐn)?shù)97% )相比較。根據(jù)RDPII Classifier (可在以下網(wǎng)址下找到《http://rdp. cme.msu. edu/classifier/classifier 〃)，這種種群可以以91%的指定率(assignment rate)與細(xì)菌TM7門相關(guān)。最近已描述的此門具有廣泛散布在環(huán)境中的成員。在土壤中，TM7門的細(xì)菌因此可以顯示在根際中和泥炭層中。C/比較土壤+黑麥草(S+V) / 土壤+黑麥草+PRP (S+P+M)的好的序列測序條帶9的16S rDNA不允許鑒定在具有黑麥草的土壤中高度占優(yōu)勢的此種群。 實際上，根據(jù)BLAST分析的最類似的序列(Genbank檢索號EU134275，99%同一性)對應(yīng)于源自草原土壤的未鑒定的細(xì)菌克隆(見下文表2)。通過在黑麥草的存在下添加組合物(I)，條帶E似乎是強(qiáng)度最高的。16S rDNA測序表明，相比最接近的序列對應(yīng)于檢索號E似83406 (98 %同一性，源自活化淤渣的種群)(見本說明書末尾處的表2)。根據(jù)RDPIIClassifier，此種群以97%的指定率與細(xì)菌TM7門相關(guān)。D/比較土壤+蠕蟲(S+V) / 土壤+蠕蟲+PRP (S+V+M)的好的序列就具有蠕蟲的土壤(S+V)而言，分子分析和分類學(xué)指派顯示，三個種群(條帶1，4， 7)與細(xì)菌TM7門相關(guān)(各自的相比最接近的序列=AN EU283406，98%同一性；AN AJ232811， 99%同一性；和AN AM690M，99%同一性)(表2)。系統(tǒng)發(fā)育分析(圖2)確認(rèn)了這種分類。雖然對源自農(nóng)用土壤的序列DQ 828869具有親和力(98%同一性)，但種群C直到現(xiàn)在也不能與鑒定的細(xì)菌組結(jié)合。在蠕蟲+組合物(I) (S+V+M)的情況下，顯示了與譜S+V共有的種群，但其相對比例似乎已改變。實際上，例如，對應(yīng)于條帶A(同1，TM7門)的種群在PRP礦物制劑的存在下較少見。另一方面，雖然對應(yīng)于條帶1，4和7的種群在譜S+E中顯著占優(yōu)勢，但譜(S+E+M) 中的優(yōu)勢種群是對應(yīng)于條帶6 (相比最接近的序列AN AF269024,99%,TM7門)和3(相比最接近的序列=AN AY820689，99%同一性，TM7門)的種群。E/比較土壤+蠕蟲+黑麥草(S+V+P) / 土壤+蠕蟲+黑麥草+PRP (S+V+P+M)的好的序列有趣地，應(yīng)注意在樣品S+V+P中，對應(yīng)于條帶D的種群(在譜S+V+P中占優(yōu)勢)與條帶E (在譜S+P+M中占優(yōu)勢)、1 (在譜S+V中占優(yōu)勢)和A (在譜S+V+M中占優(yōu)勢)的種群， 即TM7門相關(guān)的細(xì)菌相同(或非常類似)?？梢酝ㄟ^分子鑒定蠕蟲/黑麥草組合(S+V+P) 中對應(yīng)于條帶8的其他優(yōu)勢種群。通過BLAST發(fā)現(xiàn)的相比最接近的序列實際上是源自與顫楊(trembling aspen)結(jié)合的土壤的未鑒定的細(xì)菌克隆(AN EF020305，97%同一性)，且 RDPII分類學(xué)指派不允許將此序列與任意門結(jié)合。在具有PRP礦物制劑的樣品(S+V+P+M)中，對應(yīng)于條帶D和8的種群不再占優(yōu)勢， DNA不可純化的另一種群(最強(qiáng)的條帶)通過PRP礦物溶液直接活化，或者從影響其他種群的調(diào)節(jié)受益。實施例中給出的分子生物學(xué)結(jié)果不可否認(rèn)地顯示，酶活性的這些改變與存在于微生物區(qū)系中的改變相聯(lián)系。這因此確認(rèn)配方(I)的礦物組合物具有生物學(xué)作用。但是，此生物學(xué)作用依賴于生物體，如已知通過其產(chǎn)生的活性球影響陸生微生物區(qū)系的植物和蠕蟲 (根際和蚯蚓反應(yīng)圈(drilosphere))。因此，微生物區(qū)系的改變產(chǎn)生自雙重處理，(i) 一方面，配方(I)的礦物組合物的處理；和(ii)另一方面，一些生物體的處理。實施例5 配方(I)的礦物組合物對植物生物質(zhì)的產(chǎn)生的影響。
結(jié)果表示在圖IOA和IOB中。黑麥草在配方(I)的礦物組合物的存在下的產(chǎn)生使得能夠顯著倍增生物質(zhì)干重。 在蚯蚓的存在下，可以觀察到相同的趨勢。表1 結(jié)果總結(jié)
權(quán)利要求
1.包含以下配方(I)的固體礦物組合物的用途-碳酸鈣4.58%-77.8%-白云石3.85%-69.29%-氯化納5.7%-12.4%-木質(zhì)素石先酸鹽4.25%-8.49% -硫酸鉀0.37%-2.44%-氧化鎂0.01%-0.07%-元素疏0.009%-0.066%以上百分?jǐn)?shù)由每種化合物相對于該礦物組合物的干物質(zhì)總重的重量百分?jǐn)?shù)組成，用于通過引起包含于所述土壤中的至少一種下述酶的酶活性提高來增加土壤肥力，所述酶選自(i)磷酸酶、(ii) β-木糖苷酶、(iii) α-葡糖苷酶和(iv) β-葡糖苷酶。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述礦物組合物誘導(dǎo)選自(i)堿性磷酸酶、( )β -木糖苷酶、(iii) α-葡糖苷酶和β-葡糖苷酶的酶活性的至少1.5倍的增加，且有利地至少2倍的增加。
3.權(quán)利要求1的用途，其中所述固體礦物組合物誘導(dǎo)磷酸酶活性的至少2倍的增加。
4.權(quán)利要求1的用途，其中所述固體礦物組合物誘導(dǎo)木糖苷酶活性的至少2倍的增加。
5.權(quán)利要求1的用途，其中所述固體礦物組合物誘導(dǎo)α-葡糖苷酶活性的至少2倍的增加。
6.權(quán)利要求1的用途，其中所述固體礦物組合物誘導(dǎo)葡糖苷酶活性的至少2倍的增加。
7.權(quán)利要求1的用途，其中所述礦物組合物誘導(dǎo)存在于土壤中的各細(xì)菌分類單位間優(yōu)勢比的可檢測的改變。
8.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述固體礦物組合物誘導(dǎo)所述土壤中植物生物質(zhì)產(chǎn)生的至少1. 5倍的增加。
9.前述權(quán)利要求中任一項的用途，其中以至少0.01kg/m2，且至多0.10kg/m2的量，優(yōu)選以0. 02至0. 04kg/m2的量向待施肥的土壤添加配方(I)的礦物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含以下配方(I)的固體礦物組合物的用途以上百分?jǐn)?shù)由每種化合物相對于該礦物組合物的干物質(zhì)總重的重量百分?jǐn)?shù)組成，用于通過引起包含于該土壤中的至少一種下述酶的酶活性提高來增加土壤肥力，該酶選自(i)磷酸酶、(ii)β-木糖苷酶、(iii)α-葡糖苷酶和(iv)β-葡糖苷酶。
文檔編號C05D5/00GK102164876SQ200980137764
公開日2011年8月24日 申請日期2009年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月28日
發(fā)明者B·達(dá)里東, D·布蘭, E·米亞姆比, P·莫拉, S·朱斯蒂, T·韋里耶, V·羅伊 申請人:P. R. P. 控股公司