專利名稱：用作植物化學(xué)劑的植物提取物的制作方法
用作植物化學(xué)劑的植物提取物本發(fā)明涉及葡萄(Vitis vinifera)籽提取物作為試劑用于治療和預(yù)防由病原體 (特別是真菌和卵菌)引起的植物疾病。本發(fā)明由此提供了用于感染了病原體或易受感染(特別是真菌或卵菌)的植物的包含葡萄提取物的殺真菌組合物。
背景技術(shù)：
由病原體例如真菌、霉菌、卵菌、細菌和病毒引起的許多植物疾病是已知的。它們之中有許多通常與適于其攻擊和擴散的氣候條件有關(guān)聯(lián)并具有嚴重的后果，導(dǎo)致作物產(chǎn)量的下降，當(dāng)這可能對農(nóng)業(yè)經(jīng)濟產(chǎn)生深刻的，有時為災(zāi)難性的影響，特別是當(dāng)疾病呈現(xiàn)流行性狀態(tài)時。歷史上導(dǎo)致災(zāi)難性后果的植物疾病實例是由晚疫病菌(Phytophthora infestans)引起的馬鈴薯感染(晚疫病)，其是造成19世紀40年代晚期著名的愛爾蘭饑荒的原因。另一種卵菌，霜霉病菌(Plasmopara viticola)是造成名為霜霉病的原因，霜霉病是最廣泛分布的感染之一，其影響和導(dǎo)致酒生產(chǎn)者和葡萄種植者的巨大損失，負面影響生
產(chǎn)的產(chǎn)量以及質(zhì)量。一種類似的名為白粉病的葡萄樹疾病是由真菌Erysiphe necator又稱葡萄白粉菌(Uncinula necator)弓丨起的。類似的感染影響其他植物例如大豆、向日葵、萵苣、番茄、馬鈴薯、橡樹、觀賞植物、 結(jié)果植物、煙草、瓜類植物(cucurbits)。^t European Handbook of Plant Diseases, I. M. Smith ^A^, 1988, Blackwell Scientific Publications中報導(dǎo)了有關(guān)植物疾病的全面綜述。已經(jīng)提議了一些天然和合成試劑用于治療上述植物疾病，并且這些試劑是可以得到的。除了硫磺和銅鹽或復(fù)合物以外，用于農(nóng)用化學(xué)品用途的合成的殺真菌劑屬于非常廣泛和不同的化學(xué)品類型(苯酰胺、苯并咪唑衍生物、二羧酰亞胺、氨基甲酸酯、苯氨基甲酸、二硫代氨基甲酸酯、二硝基苯胺等等)。所述合成試劑的使用被眾所周知的抗性現(xiàn)象以及所述試劑在人和動物中引起的毒性作用和其環(huán)境污染潛力限制。因此，研究工作致力于開發(fā)對環(huán)境更友好的、如有可能是天然來源的殺真菌劑，其可能取代已知的合成殺真菌劑或至少其可與合成的殺真菌劑組合使用以降低抗性現(xiàn)象和/ 或其環(huán)境影響。已知一些油類例如肉桂精油、迷迭香油和印度楝樹油是有效的殺真菌劑。此外US 6，174，920公開了荷荷芭蠟在控制白粉病感染中的用途。在CA 2，103,014中也報導(dǎo)了荷荷芭提取物作為預(yù)處理劑在葡萄植物中預(yù)防白粉病感染，而US 2007/0071831公開了用于預(yù)防和/或治療感染的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品通過來源于制酒過程中的沉淀物的部分或全部中和得到。WO 2006/006878公開了殺真菌組合物，其包含無水脂肪乳，任選地與一種或多種大豆油、橄欖油和椰子油的組合。發(fā)明詳述現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)葡萄籽或含籽榨渣提取物在控制植物病原體，特別是真菌和卵菌中是有效的。本發(fā)明由此提供了包含葡萄籽或含籽榨渣提取物作為有效成分的植物藥物組合物。本發(fā)明對世界范圍的經(jīng)濟具有非常重大的利益，即通過在提取后通?？赡艿倪M一步現(xiàn)有物價穩(wěn)定措施如油回收、蒸餾、燃燒生物質(zhì)或堆肥的熱產(chǎn)生之前通過葡萄酒釀酒廠的廢料再利用提供新的物價穩(wěn)定措施。本發(fā)明的組合物在治療和/或預(yù)防植物的病原生物感染中有用，所述植物包括可能被所述病原體感染的葡萄樹和其他作物。本發(fā)明還涉及預(yù)防或治療真菌或卵菌引起的植物感染的方法，其包含對待治療的植物應(yīng)用有效量的葡萄籽或含籽榨渣提取物。下面報導(dǎo)的實驗性檢驗顯示了葡萄籽提取物對抗2種最常見的葡萄樹病原體即霜霉病菌和葡萄白粉菌的顯著活性。然而，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不僅限于治療這2種病原體引起的葡萄樹感染，而是可應(yīng)用于感染其他目的植物的多種其他真菌和卵菌。以下是感染目的植物的示例性病原體列表。1-粉孢子Erysiphe necator =葡萄白粉菌(葡萄)禾谷類白粉菌(Erysiphegraminis)(谷類)白叉絲單囊殼菌(Podosphaera leucotricha)(喬本作物，水果樹)薔薇單絲殼菌(Sphaerotheca pannosa)(玫瑰植物)2-霉病霜霉病菌(Plasmopara viticola)(葡萄)向日葵霜霉病菌(Plasmopara helianthi)(向日葵)晚疫病菌(Phytophthora infestans)(馬鈴暮)寄生疫β (Phytophthora parasitica)(番)3-水果樹瘡棚病蘋果黑星菌(Venturiainaequalis)(蘋果樹)梨黑星菌(Venturiapirina)(梨樹)4-桃葉卷曲畸形外囊菌(Taphrina deformans)5-褐斑病(Septoriosis)穎枯殼針孢(Septorianodorum)和小麥殼針孢(Septoria tritici)(谷類)殼針孢屬物種(S^toria sp.)(油菜)6-銹病禾柄繡菌(Puccinia graminis)，隱匿柄繡菌(Puccinia recondita)禾口小麥條繡病菌(Puccinia striiformis)(谷類)7~黑穗病
小麥散黑粉菌(Ustilagotritici)(小麥)玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)(玉米)大麥堅黑粉菌(Ustilago hordei)(大麥)8-腥黑穗病(Bunt)小麥腥黑粉菌(Tilletia tritici)，小麥網(wǎng)腥黑粉菌(Tilletia caries)和小麥光腥黑粉菌(Tilletia foetida)(谷類)9-疫腐病(Collar rot)黑脛病菌(Phoma lingam)(十字花科植物，油菜)立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)(馬鈴薯)菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)(番爺)10-炭疽病膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)(豌豆)豆刺盤孢(Colletotrichum lindemuthianum)(豆)11-灰霉灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)(葡萄)特別有趣的是本發(fā)明的提取物對抗所列的第1，2，3，4，9，10和11種病原體的作用?？杀黄咸烟崛∥镉行Э刂频牧硪环N病原體的示例為例如晚疫病菌，其感染多種茄科植物，例如馬鈴薯、番茄和一些觀賞植物。可通過用不同溶劑例如水、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、丁醇或其混合物在不同提取參數(shù)和技術(shù)下提取和純化新鮮或干燥的種子或含籽榨渣制備根據(jù)本發(fā)明的葡萄籽或含籽榨渣提取物。許多提取物是已知的并可商業(yè)獲得的。例如，在WO 2007/017037中公開了通過用水_乙醇混合物的提取獲得的葡萄籽提取物。鑒于這些溶劑的低成本和低毒性，使用例如水和乙醇的溶劑當(dāng)然是優(yōu)選的。還發(fā)現(xiàn)可通過下述過程得到特別適于根據(jù)本發(fā)明的用途的提取物，所述過程包括_用熱水提取葡萄籽；-去除水不溶性成分；-在吸附樹脂柱上純化；-濃縮；-噴霧干燥。通過所述過程得到的提取物具有從5至30%的兒茶素和表兒茶素含量(HPLC)，范圍從90至110% (Folin-Ciocalteau分光光度法)的多酚總含量。所述提取物是新穎的并且是本發(fā)明的另一個目的。葡萄籽提取物可這樣使用，即合適地溶解或懸浮在適于對植物應(yīng)用的載體中，或可將它們與合適的賦形劑(例如濕潤添加劑、佐劑)或其他活性成分(例如已知的殺真菌劑、銅化合物、油等等)組合配制。組合物中的葡萄籽提取物的量的范圍可從5至25克/升，但可根據(jù)所述組合物的功用、待治療的病原體、待保護的植物和治療技術(shù)調(diào)整此范圍。
組合物可通過任意合適的技術(shù)對植物施用，例如通過用傳統(tǒng)設(shè)備噴灑，可每周一次或根據(jù)種植者決定的時序?qū)嵤┲委煟鰰r序取決于一些因素例如氣候條件、感染程度、 感染生物的毒性、其他植物化學(xué)劑的使用等等。作為一個示例，在被霜霉病感染的情況下，一般以每株植物和每次治療從0. 1至 10克范圍的量將葡萄籽提取物噴灑在葉子上面和下面，每周至三周一次，從早春持續(xù)到晚夏，甚至持續(xù)到收獲期。當(dāng)然精確的量將取決于植物的密度，其根據(jù)地理區(qū)域和葡萄樹的品種變化很大例如在托斯卡納為約3000株/公頃，在香檳為約7500株/公頃或在勃艮第為約10000株/公頃。此外，噴灑在植物上的總“即用”溶液體積可根據(jù)產(chǎn)品和技術(shù)而變化 從300至750升/公頃，相當(dāng)于5克/升x300升/公頃/10000株/公頃=0. 15克/株至最多25克/升x750升/公頃相當(dāng)于3000株/公頃=6. 25克/株。在下面的實施例中更詳細的說明本發(fā)明。實施例1-葡萄籽的水提取物VITIVAC的制備用75°C的熱水覆蓋1000克干燥的葡萄籽。在帶保溫套的靜態(tài)滲濾器或配備攪拌器的帶保溫套的反應(yīng)器中進行4小時。然后用75°C的熱水滲濾生物質(zhì)，連續(xù)排放回收的滲濾液直至總體積為7. 5升。滲濾流理想地為約1升每小時。將全部回收的滲濾液冷卻至20°C并用50微米的濾器過濾以去除細顆粒。然后將水溶液連續(xù)上樣至含有1升Rhom and Haas AMBERLITE XAD7HP樹脂或以前重生的等同物的層析柱上端并用水填充。關(guān)注通過柱底部的水的電導(dǎo)率。在固定步驟的最后，理想地用4升水漂洗樹脂，然后理想地用4升70% ν/ν乙醇連續(xù)洗脫，并緊接著用4升水再漂洗一次。關(guān)注通過柱底部的水的電導(dǎo)率。收集得到的酒精溶液，在真空下濃縮，并用水清洗以去除乙醇。然后在真空下濃縮溶液并在低于85°C的溫度下噴霧干燥。將得到的粉末混合、檢查并在密封和不透明的袋子中包裝。標準產(chǎn)量為93克，對應(yīng)于起始物料的產(chǎn)量為9. 30% w/w0但是此產(chǎn)量可根據(jù)使用的生物質(zhì)而變化。此產(chǎn)物具有8. 5%的兒茶素(兒茶素+表兒茶素)HPLC含量和98%的總多酚含量。實施例2-葡萄籽提取物VITIVAC的殺真菌活性植物使用霞多麗葡萄(Vitis vinifera cv. Chardormay)研究殺真菌劑對霜霉病的作用。從種子開始培養(yǎng)植物(每0.1-1盆1株)并置于培養(yǎng)箱(23°C白天/19°C夜晚， 100-120 μ Ε. πΓ2· s-1，每天 16 小時光照)。使用 1 升 0. 2g/l 的 N-P-K 肥料(20-20-20)每周 2次對幼苗施肥。使用具有至少4片完全發(fā)育的葉的8周大幼苗研究VITIVAC的生物學(xué)活性。病原體在“霞多麗”的分離的表面已消毒的葉上維持霜霉病菌Pvl分離株，2007年從位于法國香檳區(qū)域的葡萄園的感染植物中獲得所述菌株。將葉置于培養(yǎng)皿中并置于培養(yǎng)箱中 (230C白天/19°C夜晚，100-120 μ Ε. m_2. s-1，每天16小時光照)。從接種后8-12天的新鮮地形成孢子的葉上獲得接種物。在4°C的蒸餾水中懸浮孢子囊并在血球計數(shù)儀的輔助下將濃度調(diào)整為每毫升水5xl05孢子囊。殺真菌處理在整個實驗中以25g/l的比例使用如實施例1中所描述的制備的天然產(chǎn)物 (VITIVAC)。將VITIVAC的效力與以4. Okg配制的產(chǎn)品/公頃的比例使用的(Mikal Flash WG, Bayer CropScience)參考殺真菌劑混合物 Fosetyl-Al (500g/kg)+Folpel (250g/kg)比較。將表面已消毒的“霞多麗”葉背軸側(cè)向上置于14cm直徑的塑料培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿含有用8ml水濕潤的濾紙。使用配備了錐形噴嘴(Teejet XR 110015 VS)的實驗室噴霧器(Euro-Pulve)以2 bar的氣壓噴灑葉。對Mikal Flash和VITIVAC分別以每公頃400 和720升的體積應(yīng)用殺真菌制品。每個試驗重復(fù)3次。使用Newman-Keuls檢驗(XLS_Stat， Addinsoft)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。處理后的葉在層流下放置30分鐘以干燥應(yīng)用在葉背軸面的殺真菌劑。干燥后，將含有處理的或未處理(對照)的葉的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)箱中(23°C白天/19°C夜晚， 100-120 μ Ε. πΓ2· s-1，每天16小時光照)保存24小時。霜霉病菌的接種用木塞穿孔器從每片處理的或未處理的(對照)葉中切割出10個葉圓片(每個直徑IOmm)并背軸側(cè)向上置于9cm直徑的塑料培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中含有用4ml無菌蒸餾水濕潤的濾紙。通過加入1滴(20 μ 1)接種物(5 X IO5孢子囊.ml—1)接種圓片。接種后， 含有10片葉圓片的培養(yǎng)皿在黑暗中于19°C培養(yǎng)24小時，然后在培養(yǎng)箱中(23°C白天/19°C 夜晚，100-120 μ Ε. m_2. s—1，每天16小時光照)保存以用于疾病的發(fā)展。在實驗的最后，將培養(yǎng)皿在19°C黑暗保存24小時以誘導(dǎo)孢子形成。接種后10天，對每種檢測的形態(tài)測定了展示霜霉病發(fā)展的葉圓片數(shù)目(感染率)。 然后，將伴有發(fā)白的孢子囊的霜霉病損傷根據(jù)0-4的等級分級，如Reuveni (Relationship between leaf age, peroxidase and b 1-3 glucanase activity and resistance to downy mildew in s, 1998. Journal of Phytopa thology 146,525-530)以前描述的0,無損傷；1，1-10%的葉圓片區(qū)域受感染和形成孢子；2，11-25% ;3，26-50%;和4，> 50% (感染強度)。評估了葉圓片上產(chǎn)生的孢子囊的數(shù)目。用已知體積的含有0.01% Tween 80的無菌蒸餾水將孢子囊從10片葉圓片上洗下來，并在血球計數(shù)器的輔助下計數(shù)(每10片葉圓片計數(shù)6次)。計算了每平方厘米葉圓片面積產(chǎn)生的孢子囊的數(shù)目(形成孢子的強度)。 進行了 1次實驗，每種處理使用3個培養(yǎng)皿。霜霉病(1)接種后10天的觀察
權(quán)利要求
1.植物藥物組合物，其包含葡萄籽或含籽榨渣的提取物作為活性成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述提取物為水/乙醇或水提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的組合物，其進一步包含其他具有殺真菌活性的活性成分。
4.預(yù)防或治療植物被真菌或卵菌感染的方法，其包括對待治療的植物應(yīng)用有效量的葡萄籽提取物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述植物為葡萄。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述病原體為霜霉病菌。
7.由下述方法得到的葡萄籽提取物，方法包含 _用熱水提取葡萄籽；-去除水不溶性成分； -在吸附樹脂柱上純化； -濃縮和噴霧； -噴霧干燥。
全文摘要
本發(fā)明涉及葡萄(Vitis vinifera)籽提取物作為試劑用于治療和預(yù)防由病原體(特別是真菌和卵菌)引起的植物疾病，以及用于感染或易感染病原體(特別是真菌或亂菌)的植物的包含葡萄提取物的殺真菌組合物。
文檔編號A01P3/00GK102223802SQ200980146667
公開日2011年10月19日 申請日期2009年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月25日
發(fā)明者F·邁雷爾 申請人:因德納有限公司