專利名稱：抗黃瓜脈黃化病毒(cvyv)黃瓜植物(cucumis sativus l.)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種抗黃瓜脈黃化病毒(CVYV)黃瓜植物(⑶CUMIS SATIVUS L.)，提供抗黃瓜脈黃化病毒(CVYV)黃瓜植物(⑶CUMIS SATIVUS L.)的方法，分子標(biāo)記在該方法中的用途，和植物，植物部位，組織，細(xì)胞和/或衍生自或來自本發(fā)明抗黃瓜脈黃化病毒(CVYV)的黃瓜植物(CUCUMIS SATIVUSL.)的種子。
背景技術(shù)：
黃瓜植物，即Cucumis sativus種的植株,屬于葫蘆科的瓜，葫蘆科也包括像甜瓜和筍瓜(squashes)這樣的家族成員。該植物可食用果實(shí)通常被稱為黃瓜。黃瓜通常是圓柱形、綠皮果實(shí)，其包括大約96%的水。黃瓜植物很早就被種植了，也命名為Cucumis sativus L.,是ー種世界上重要的園藝作物。黃瓜一般在未成熟的時(shí)期即被收獲，且被用在腌菜行業(yè)或新鮮市場(chǎng)中。黃瓜脈黃化病毒(Cucumber Vein Yellowing Virus)縮寫為CVYV,屬于馬鈴薯Y病毒(Potyviridae)科甘薯病毒(Ipomovirus)屬。它是桿形且是ー種相當(dāng)不穩(wěn)定的顆粒，通常是740-800nm長、15_18nm寬。據(jù)報(bào)道CVYV的病毒核酸由雙鏈核糖核酸組成。該病毒的宿主范圍窄，宿主主要限定在葫蘆科的植物。該科包括重要的經(jīng)濟(jì)作物如，黃瓜，筍瓜(包括南瓜)，甜瓜和西瓜。盡管通常CVYV感染是黃瓜產(chǎn)量的主要問題，但筍瓜，福祿瓜(zucchini),西瓜和甜瓜產(chǎn)量也會(huì)受影響。CVYV通常是通過煙粉虱(Bremisia tabaci)傳播。CVYV感染的植物一般出現(xiàn)葉脈黃化或脈明病(vein clearing)及具有明顯的產(chǎn)量下降的發(fā)育障礙。CVYV感染也能引起植物死亡。因此，CVYV對(duì)已經(jīng)感染的作物能有災(zāi)難性的影響。預(yù)防感染通常是昂貴和/或不利于環(huán)境，所述預(yù)防感染通過例如在無粉虱的環(huán)境下培育幼苗，或者例如用殺蟲劑處理。此夕卜，這些方法不總是達(dá)到滿意的效果。黃瓜綠斑點(diǎn)花葉病毒(CucumberGreen Mottle Mosaic Virus),也縮寫為 CGMMV,是ー種引起葫蘆科嚴(yán)重疾病的煙草花葉病毒屬的RNA病毒。CGMMV株系最先由英國和歐洲報(bào)道。該病毒出現(xiàn)在所有組織中，并且該病毒迅速在工人手中、服裝、刀和其他設(shè)備上傳播，且加上病毒是種子帶菌的。種子的熱處理通常用來控制病毒污染。CGMMV還能夠通過地表水傳播。葉片變黃、長斑、向下卷曲的癥狀已被報(bào)導(dǎo)，但也許最重要的是減輕重度的果實(shí)長斑和變形的報(bào)道。果實(shí)的這種長斑和變形能夠迅速使受感染的作物滯銷。黃瓜綠斑點(diǎn)花葉病毒也許是感染黃瓜作物最廣泛和最有名的煙草花葉病毒。在黃瓜生產(chǎn)區(qū)域如荷蘭、西班牙、希臘和印度，CGMMV是ー個(gè)全球性的問題。產(chǎn)量損失可能為15%。黃瓜果實(shí)斑點(diǎn)花葉病毒(CucumberFruit Mottle Mosaic Virus),縮寫 CFMMV,是煙草花葉病毒組能引起黃瓜植物重要經(jīng)濟(jì)損失的另ー個(gè)家庭成員。黃瓜果實(shí)斑點(diǎn)花葉病毒(CFMMV)感染的癥狀，通常最先發(fā)現(xiàn)在相對(duì)增進(jìn)生長階段的果實(shí)和葉尖。葉子的癥狀包括嚴(yán)重的花斑，脈結(jié)病和黃斑。有時(shí)，完全發(fā)育的植物會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的萎蔫致使植物虛弱。溫室內(nèi)病毒快速傳播可導(dǎo)致顯著的產(chǎn)量降低。

發(fā)明內(nèi)容
考慮黃瓜植物(Cucumis sativus L.)中因黃瓜脈黃化病毒(CVYV)引起的經(jīng)濟(jì)損失，在其它目的中，本發(fā)明的目的是提供抗黃瓜脈黃化病毒(CVYV)的黃瓜植物(Cucumissativus L.)。繼而，在其它目的中，本發(fā)明的目的提供用于提供抗黃瓜脈黃化病毒(CVYV)的黃 瓜植物(Cucumis sativus L.)的方法和途徑。上述目的，在其它目的中，通過本發(fā)明附加的權(quán)利要求I中所述方法實(shí)現(xiàn)。尤其是，上述目的，在其它目的中，通過本發(fā)明用于提供黃瓜脈黃化病毒(或CVYV)抗性黃瓜植物,或者黃瓜(Cucumis sativus L.)的方法來實(shí)現(xiàn),該方法包含b)選擇第一黃瓜植物(Cucumis sativus L.),其中所述選擇包括通過以下確定賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的遺傳成分的存在以所述第一黃瓜植物(Cucumissativus L.)的基因組為模板，在分子擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)分析中，利用分子擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)引物SEQ ID No :1和SEQ ID No :2，檢測(cè)245至247堿基對(duì)核酸擴(kuò)增片段，優(yōu)選246堿基對(duì)核酸擴(kuò)增片段；c)轉(zhuǎn)移鑒定的賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的遺傳成分到第二黃瓜植物(Cucumis sativus L.)中，由此賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性到所述第二黃瓜植物(Cucumis sativusL.),其中所述轉(zhuǎn)移包括，以所述第二黃瓜植物(Cucumis sativusL.)的基因組為模板，在分子擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)分析中，使用分子擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)引物SEQ ID No :1和SEQ ID No :2，檢測(cè)245至247堿基對(duì)核酸擴(kuò)增片段，優(yōu)選246堿基對(duì)核酸擴(kuò)增片段。
具體實(shí)施例方式根據(jù)本發(fā)明，引物SEQ ID NO 1包括核酸序列5' -GAC TGC GTA CCA ATT CGT-3'和引物SEQ ID No 2包括核酸序列5' -GAT GAG TCC TGA GTA ACA C-3'顯示存在賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的遺傳成分的本發(fā)明的核酸擴(kuò)增片段，在本領(lǐng)域中通常被指定作為擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)標(biāo)記(所述標(biāo)記遺傳地連接到本發(fā)明的賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的遺傳成分上)，及在本文中可互換地指定為含245到247堿基對(duì)核酸，優(yōu)選246堿基對(duì)核酸的標(biāo)記E22/M48-F-246。本發(fā)明245至247堿基對(duì)的核酸擴(kuò)增片段，優(yōu)選246堿基對(duì)的核酸擴(kuò)增片段，及由此本發(fā)明的賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的遺傳成分，可利用任何適合植物基因組材料的擴(kuò)增技術(shù)，如PCR，來鑒定或檢測(cè)。在ー個(gè)具體的優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明245至247堿基對(duì)的核酸擴(kuò)增片段，優(yōu)選246堿基對(duì)的核酸擴(kuò)增片段，及由此本發(fā)明的賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的遺傳成分，可利用本領(lǐng)域指定的核酸擴(kuò)增技術(shù)如分子擴(kuò)增片段長度多態(tài)性來鑒定或檢測(cè)(ALFP，Vos,P.，Hogers, R，Bleeker，M.，等人，1995. AFLP anew technique for DNA fingerprinting.Nucleic Acids Research23 (21) :4407-4414 ;Zabeau, M 和 P.Vos. 1993。Selectiverestriction fragment amplification a general method for DNA fingerprinting,歐洲專利局，歐洲公開0 534 858A1)。擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AmplifiedFragment Length Polymorphism,AFLP)是一種以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的基因指紋技術(shù)，其早在二十世紀(jì)90年代初由荷蘭Keygene開發(fā)。簡言之，AFLP用限制性內(nèi)切酶來消化基因組DNA，然后將互補(bǔ)的雙鏈銜接子連接到限制片段末端。然后限制片段的子集利用互補(bǔ)到銜接子和限制位點(diǎn)片段上的兩個(gè)引物來擴(kuò)増。通過放射自顯影或熒光方法在變性聚丙烯酰胺凝膠上可觀測(cè)到片段。這樣通常使得看見許多不同尺寸的核酸擴(kuò)增片段。通過對(duì)比由例如敏感性植物和抗性植物獲得的核酸擴(kuò)增片段，鑒定有差別的核酸擴(kuò)增片段，又被指定為兩種顯型間的標(biāo)記。
在本發(fā)明中，遺傳地連接到本發(fā)明抗性基因座上井能夠鑒定本發(fā)明抗性基因座的ー個(gè)特定的AFLP標(biāo)記(指定作為AFLP標(biāo)記E22/M48-F-246)，能夠通過245_247bp，優(yōu)選246bp的核酸擴(kuò)增片段的存在來鑒定。在大量未差別化的其他AFLP擴(kuò)增片段中，該標(biāo)記僅出現(xiàn)在抗性個(gè)體中但不在敏感性個(gè)體中出現(xiàn)。應(yīng)該注意的是,為了鑒定在第一黃瓜植物(Cucumis sativusL.)中本發(fā)明的賦予黃瓜脈黃化病毒抗性的基因成分，利用AFLP引物SEQ ID No :1和2的黃瓜植物(CucumissativusL.) AFLP分析，能夠產(chǎn)生與本發(fā)明AFLP標(biāo)記E22/M48-F-246有小尺寸差別的第二核酸擴(kuò)增片段。根據(jù)本發(fā)明，這個(gè)大的核酸擴(kuò)增片段不能遺傳地連接到井能夠鑒定本發(fā)明的賦予黃瓜脈黃化病毒花葉病毒抗性的基因成分。換言之，當(dāng)利用AFLP和AFLP引物SEQ ID No :1和2分析時(shí)，本發(fā)明第一黃瓜植物(Cucumis sativus L.) 一定能產(chǎn)生指定尺寸的本發(fā)明AFLP E22/M48-F-246標(biāo)記,但另外也能產(chǎn)生大尺寸的第二核酸擴(kuò)增片段，即，248到250bp核酸擴(kuò)增片段，如248堿基對(duì)核酸擴(kuò)增片段。依照本發(fā)明第一黃瓜植物(Cucumis sativus L.)，可以為具有黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性表型的任ー種黃瓜植株(Cucumis sativus L.)植物,所述第一黃瓜植株植物通過本發(fā)明的賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的遺傳成分來賦予并用上述的核酸擴(kuò)增片段來鑒定。本發(fā)明第一代黃瓜植物(Cucumis sativus L.)的選擇，固有地包括利用分子生物技術(shù)在該植物中檢測(cè)本發(fā)明的賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的遺傳成分。在鑒定,確定，或檢測(cè)了第一黃瓜植物(Cucumis sativus L.)中本發(fā)明的賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的遺傳成分后，該遺傳成分轉(zhuǎn)移到第二黃瓜植物(Cucumissativus L.)中，從而賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性到所述第二黃瓜植物(Cucumissativus L.)。優(yōu)選的，轉(zhuǎn)移賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的遺傳成分包括，傳統(tǒng)的育種方法，如把第一黃瓜植物(Cucumis sativus L.)與第二黃瓜植物(Cucumis sativus L.)的常規(guī)雜交，隨后與第二黃瓜植物(Cucumis sativus L.)回交。然而，該傳統(tǒng)育種方法優(yōu)選與分子生物學(xué)技術(shù)協(xié)作，以便在第二黃瓜植物(Cucumis sativus L.)中確定本發(fā)明抗性基因座的保持。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二黃瓜植物(Cucumis sativus L.)是黃瓜脈黃化病毒(CVYV)敏感的商業(yè)化品種。通過轉(zhuǎn)移本發(fā)明的黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性基因座至該植物中，同時(shí)保持其他經(jīng)濟(jì)價(jià)值高品質(zhì)的基因型和顯型特征，從而提供出有更高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的黃瓜植物(Cucumis sativus L.)。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中,本發(fā)明方法提供了具有第二黃瓜植物(Cucumis sativusL.)表型的黃瓜植物(Cucumis sativus L.),該第二黃瓜植物還具有第一黃瓜植物(Cucumis sativus L.)的黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性基因座。在本發(fā)明方法優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法包括步驟(C)，該步驟(C)包括暴露所述第二黃瓜植物(Cucumis sativus L.)至黃瓜脈黃化病毒(CVYV)從而建立對(duì)病毒的抗 性。考慮到包括SEQ ID Nos. I和2的引物鑒定本發(fā)明黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性基因座的能力，本發(fā)明一方面涉及SEQ IDNo :1和/或SEQ ID No :2用于確定在黃瓜植物(Cucumis sativusL.)中賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的遺傳成分存在的用途。通過本發(fā)明方法獲得的植物，對(duì)黃瓜脈黃化病毒(CVYV)有抗性，并由此具有相對(duì)于黃瓜脈黃化病毒(CVYV)敏感植物的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)，如增加產(chǎn)量。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，涉及含賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的遺傳成分的抗黃瓜脈黃化病毒(CVYV)黃瓜植物(Cucumis sativus L.)，其中所述黃瓜植物(Cucumis sativus L.)中存在所述賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的遺傳成分的特征在于，使用所述黃瓜(Cucumis sativus L.)的基因組作為核酸擴(kuò)增的模板，在分子擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析中，利用分子擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)引物SEQ ID No :1和SEQ ID No:2，245至247堿基對(duì)的核酸擴(kuò)增片段、優(yōu)選246堿基對(duì)的核酸擴(kuò)增片段。在本發(fā)明這方面優(yōu)選的實(shí)施方案中，植物是其種子保藏在NCIBM登錄號(hào)為NCIBM41635 的黃瓜植物(Cucumis sativusL.)。根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及抗黃瓜脈黃化病毒(CVYV)的黃瓜植物(Cucumis sativus L.)，其中該植物是其種子保藏在NCIBM登錄號(hào)為NCIBM 41635的黃瓜植物(Cucumis sativus L.)。應(yīng)該理解為，本發(fā)明不限于如上植物，還涉及衍生自本發(fā)明植物的植物，植物部分，組織，細(xì)胞和/或種子，及其用于提供抗黃瓜脈黃化病毒(CVYV)的其他黃瓜植物(Cucumis sativusL.)的用途。根據(jù)上述應(yīng)用的優(yōu)選方面，除了提供或表現(xiàn)黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性之外，本發(fā)明的植物，或獲得的或由此產(chǎn)生的植物或部分，也提供黃瓜綠斑點(diǎn)花葉病毒(CGMMV)抗性，優(yōu)選黃瓜綠斑點(diǎn)花葉病毒(CGMMV)和黃瓜果實(shí)斑點(diǎn)花葉病毒(CFMMV)抗性。實(shí)施例實(shí)施例I :賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的遺傳成分說明在該實(shí)施例中，由荷蘭瓦赫寧恩Keygene N. V完成,在抗性黃瓜植物(Cucumissativus L.)中利用大批量QTL分析(BulkQTL Analysis, B QA),來鑒定遺傳地連接到賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的遺傳成分的數(shù)量性狀基因座(Qualitative Trait Locus,QTL)。選擇用于黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的標(biāo)記研發(fā)的種群。在含顯示‘極端表型’的個(gè)體的兩個(gè)庫篩選出總共96個(gè)AFLP引物組合。隨后，在有抵抗力的和敏感樣品上驗(yàn)證了5個(gè)候選標(biāo)記。標(biāo)記鑒定和駘證獲得植物的葉子原料ー個(gè)系11366X 0K561種群提供用于檢測(cè)的種群，供方親本系11366和種群親本系的自交系。分離DNA，并生成EcoRI/Msel模板。利用引物組合E14/M59,生成植物的測(cè)試指紋。個(gè)體的BSA和駘證通過在含十個(gè)“極端抗性”エ體的庫和含十個(gè)“極端敏感性”個(gè)體的庫上篩選出總共96個(gè)引物組合來進(jìn)行BQA。該篩選產(chǎn)生下述候選標(biāo)記的鑒定 E14/M58 F 169 P2 ;和 E22/M48 F 248/246 (雙等位基因)接著驗(yàn)證這些標(biāo)記?；谠擈?yàn)證，鑒定的候選標(biāo)記被證實(shí)連接有煙草花葉病毒抗性。在種群卜.駘證候詵標(biāo)記在篩選96個(gè)引物組合和接著證實(shí)標(biāo)記后，可鑒定ー個(gè)推定的QTL。為了確定鑒定的QTL是否的確是分離的QTL，進(jìn)行連鎖分析。對(duì)來自種群的46個(gè)額外個(gè)體篩選出標(biāo)記(E14/M58 F 169P2和雙等位基因標(biāo)記E22/M48 F 248/246)。生成標(biāo)記數(shù)據(jù)集，并與驗(yàn)證的標(biāo)記數(shù)據(jù)集合井。以該分析為基礎(chǔ)，能判斷這4個(gè)標(biāo)記的確連接到ー個(gè)QTL。用WinQTL制圖講行標(biāo)記分析為了確定顯型和基因型之間的相關(guān)性，用WinQTL制圖軟件包分析標(biāo)記數(shù)據(jù)集。對(duì)于單個(gè)標(biāo)記分析(Single Marker Analysis, SMA),計(jì)算出LOD值為12。對(duì)于區(qū)間映射(IM),通過在顯型數(shù)據(jù)上進(jìn)行1000次置換，計(jì)算95%的可信閾值，確定LOD值為0. 9。解釋差異的LOD值和解釋方差百分?jǐn)?shù)，可用于計(jì)算該QTL (LOD 9 ；Exp. Var. :49. 5)。結(jié)論為了鑒定黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的QTL，進(jìn)行BQA。在ー批有十個(gè)“極端抗性”個(gè)體和一批有十個(gè)“極端敏感性”個(gè)體上，篩選出總共96個(gè)引物組合。在’極端抗性’和’極端敏感性’個(gè)體、以及該種群的其它個(gè)體上，驗(yàn)證其中其中一個(gè)是雙等位基因的候選標(biāo)記。通過使用BQA方法鑒定了 QTL區(qū)域?；赥estPC ( 5個(gè)標(biāo)記)，在抗性供體親本系11366的30個(gè)自交系里,鑒定無異質(zhì)。實(shí)施例2輔助有鑒定黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的抵抗性黃瓜(Cucumissativus L.)的分子標(biāo)記分子分析用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)從敏感和抗性的黃瓜植物(Cucumis sativus L.)中分離基因組原料，敏感即顯示一個(gè)或更多病毒感染的癥狀。接下來，用合適的限制性內(nèi)切酶(EcoRI/Msel)消化該基因原料，在銜接子結(jié)扎后，用引物對(duì) 5-GAC TGC GTA CCA ATTCGT-3'和 5' -GAT GAG TCC TGA GTA ACA C-3'，或引物對(duì)5' -GAC TGC GTA CCA ATT CAT-3'和5-GAT GAG TCC TGAGTA ACG T_3'，進(jìn)行AFLP核酸擴(kuò)增。所得擴(kuò)增產(chǎn)物通過分子測(cè)定用凝膠電泳來分解。檢測(cè)個(gè)體黃瓜植物(Cucumissativus L.)基因組中AFLP標(biāo)記的存在為不存在(_)或存在(+)。具體來說，當(dāng)出現(xiàn)AFLP標(biāo)記E14/M58-F-169(不包含在本發(fā)明中，引物對(duì)5' -GACTGC GTA CCA ATT CAT-3'和 5-GATGAG TCC TGA GTA ACG T-3')時(shí)，可觀察到約 169bp的帶；當(dāng)出現(xiàn)AFLP標(biāo)記E22/M48-F-248(不包含在本發(fā)明中，引物5-GAC TGC GTA CCA ATTCGT-3'和 5' -GAT GAG TCC TGAGTA ACA C-3')時(shí)，可觀察到約 248bp 的帶。AFLP 標(biāo)記E14/M48-F-246(包含在本發(fā)明中，引物 5-GAC TGC GTA CCAATT CGT-3'和 5' -GAT GAGTCC TGA GTA ACA C-3/ )具有估計(jì)約246bp大小，其基因地與抗性顯型相關(guān)。下表I為總結(jié)的結(jié)果。
表I :AFLP 標(biāo)記 E14/M58 F 169 ；E22/M48 F 246 3PE22/M48 F 248 與黃瓜脈黃化 病毒(CVYV)抗性表型之間的相關(guān)性
個(gè)體黃瓜植物身E14/M58- E22/M48-F E22/M48-
(Cucumis sativus L.)F-169-246F-248
TLCG04 4816 10 敏感性+-+
TLCG04 4816 18 敏感性+-+
TLCG04 4816 13 敏感性+-+
TLCG04 4816 23 敏感性+-+
TLCG04 4816 24 敏感性+-+
TLCG04 4816 31 敏感性+-+
TLCG04 4816 43 敏感性+-+
TLCG04 4816 56 敏感性+-+
TLCG04 4816 57 敏感性+-+
TLCG04 4816 61 敏感性+-+
TLCG04 4816 64 敏感性+-+
TLCG04 4816 66 敏感性+-+
T33168 4抗性_ - _+_- _
T33168 5抗性-+-
T33169 9抗性-+-
T33168 2抗性-+-
T33168 6抗性-+-
T33168 7抗性-+-
T33168 8抗性-+-
T33168 9抗性-+-
T33169 2抗性-+-
T33169 3抗性-+-
T33169 5抗性-+-
T33169 6抗性-+-
NCIMB 41635 ] 抗性-〔+ f
表I清楚地表明,在所有測(cè)試的黃瓜植物(Cucumis sativusL.)中黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的表型，被基因地連接有分子AFLP標(biāo)記E22/M48-F-246的存在。因此，該標(biāo)記的檢測(cè)顯示存在黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性遺傳成分或QTL。實(shí)施例3標(biāo)記22/M48-F-246 (其顯示賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的遺傳成分的存在)另外表明存在賦予黃瓜綠斑點(diǎn)花葉病毒(CGMMV)抗性的遺傳成分和/或賦予黃瓜果實(shí)斑點(diǎn)花葉病毒(CFMMV)抗性的遺傳成分。檢測(cè)黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性植物對(duì)黃瓜綠斑點(diǎn)花葉病毒(CGMMV)的抗性和黃瓜果實(shí)斑點(diǎn)花葉病毒(CFMMV)的抗性。意外的是，在下表2所示的0K561x系11366分離的DH種群中，全部被檢測(cè)的CVYV抗性植物，出現(xiàn)對(duì)黃瓜脈黃化病毒(CVYV)，黃瓜綠斑點(diǎn)花葉病毒(CGMMV)和黃瓜果實(shí)斑點(diǎn)花葉病毒(CFMMV)的絕對(duì)多效抗性。所有的抗性(用R表示)植物對(duì)標(biāo)記E22/M48-F-246為陽性，并對(duì)標(biāo)記E14/M58-F-169和E22/M48-F-248為陰 性。反之亦然，所有的敏感(用S表示)植物對(duì)標(biāo)記E22/M48-F-246為陰性，并對(duì)標(biāo)記E14/M58-F-169 和 E22/M48-F-248 為陽性。表20K561x系11366分離的DH種群
權(quán)利要求
1.ー種提供抗黃瓜脈黃化病毒的黃瓜植物(Cucumis sativus L.)的方法,其包括 a)選擇第一黃瓜植物(Cucumissativus L.),其中所述選擇包括通過以下確定賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的遺傳成分的存在以所述第一黃瓜植物(Cucumis sativusL.)的基因組為模板，在分子擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)分析中，利用分子擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)引物SEQ ID No :1和SEQ IDNo :2，檢測(cè)245至247堿基對(duì)核酸擴(kuò)增片段，優(yōu)選246堿基對(duì)核酸擴(kuò)增片段； b)轉(zhuǎn)移鑒定的賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的遺傳成分到第二黃瓜植物(Cucumissativus L.)中，由此賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性到所述第二黃瓜植物(CucumissativusL.),其中所述轉(zhuǎn)移包括，以所述第二黃瓜植物(Cucumis sativus L.)的基因組為模板，在分子擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)分析中，使用分子擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)引物SEQID No :1和SEQ ID No :2，檢測(cè)245至247堿基對(duì)核酸擴(kuò)增片段，優(yōu)選246堿基對(duì)核酸擴(kuò)增片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述方法包括步驟(c)，所述步驟(c)包括暴露所述第二黃瓜植物(Cucumis sativus L.)至黃瓜脈黃化病毒(CVYV)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述核酸擴(kuò)增片段為246bp。
4.ー種SEQ ID No :1和/或SEQ ID No :2的用途，所述用途為用于證實(shí)在黃瓜植物(Cucumis sativus L.)中存在賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的遺傳成分的用途。
5.ー種黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性黃瓜植物(Cucumis sativus L.)，其包含賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的遺傳成分，其中所述黃瓜植物(Cucumis sativus L.)中存在所述賦予黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性的遺傳成分的特征在于，用所述黃瓜植物(Cucumissativus L.)的基因組作為核酸擴(kuò)增的模板，在分子擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析中，利用分子擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)引物SEQ ID No :1和SEQ ID No :2，有245至247堿基對(duì)的核酸擴(kuò)增片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物，其中所述核酸擴(kuò)增片段為246堿基對(duì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的植物，其中所述植物為保藏在NCIBM登錄號(hào)為NCIBM41635 的黃瓜植物(Cucumis sativus L.)。
8.ー種黃瓜脈黃化病毒(CVYV)抗性黃瓜植物(Cucumis sativus L.)，其中所述植物為保藏在NCIBM登錄號(hào)為NCIBM41635的黃瓜植物(Cucumis sativus L.)。
9.ー種植物，植物部分，組織，細(xì)胞，和/或種子，所述植物，植物部分，組織，細(xì)胞，和/或種子衍生自根據(jù)權(quán)利要求5-8任ー權(quán)利要求所述的植物。
10.ー種根據(jù)權(quán)利要求5-9任ー權(quán)利要求所述的植物，植物部分，組織，細(xì)胞，和/或種子的用途，所述用途為對(duì)黃瓜植物(Cucumis sativus L.)提供黃瓜葉脈黃化病毒(CVYV)抗性的用途。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中所述抗性是黃瓜葉脈黃化病毒(CVYV)抗性和黃瓜綠斑點(diǎn)花葉病毒(CGMMV)抗性。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中所述抗性是黃瓜葉脈黃化病毒(CVYV)抗性，黃瓜綠斑點(diǎn)花葉病毒(CGMMV)抗性和黃瓜果實(shí)色斑花葉病毒抗性(CFMMV)。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子標(biāo)記，其遺傳地連接至黃瓜植物(Cucumis sativus L.)中的基因座，并能鑒定該基因座，該基因組賦予對(duì)煙草花葉病毒一般抗性，特別是對(duì)兩個(gè)在商業(yè)上重要的致病煙草花葉病毒(即，黃瓜綠斑點(diǎn)花葉病毒(CGMMV)和黃瓜果實(shí)斑點(diǎn)花葉病毒(CFMMV))的抗性。本發(fā)明還涉及用于向黃瓜植物(Cucumis sativus L.)、植物、植物部分和果實(shí)提供對(duì)煙草花葉病毒，尤其是對(duì)兩個(gè)商業(yè)上重要的致病煙草花葉病毒，即黃瓜綠斑點(diǎn)花葉病毒(CGMMV)和黃瓜果實(shí)斑點(diǎn)花葉病毒(CFMMV)的抗性的方法。
文檔編號(hào)A01H1/04GK102770018SQ200980160393
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2009年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月7日
發(fā)明者亞普·馬澤利烏, 南內(nèi)·法貝爾, 布萊特·凡·坎彭, 羅納爾多·威爾特丁克 申請(qǐng)人:安莎種子公司