專利名稱：：一種結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)獲得再生植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一種結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)獲得再生植株的方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，專用于組織培養(yǎng)獲得再生植株。二
背景技術(shù)：
：結(jié)球甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.c即itata)是十字花科蕓薹屬二年生植物，在我國栽培面積廣，適應(yīng)性強(qiáng)，營養(yǎng)價(jià)值高，耐貯運(yùn)，深受廣大人民喜愛，是國內(nèi)市場和出口創(chuàng)匯的主要蔬菜之一。目前生產(chǎn)上應(yīng)用的雜交種主要是通過將國外引進(jìn)的材料多代自交分離純化，選育自交不親和系培育出來的，一般需要分離68代。由于甘藍(lán)是綠體春化型作物，不易加代，使得育種周期長，并且連續(xù)自交多代后存在植株衰退現(xiàn)象。這些因素制約著我國甘藍(lán)優(yōu)良品種選育工作的開展。采用組織培養(yǎng)技術(shù)，開展結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)和單倍體育種研究，能夠?yàn)閮?yōu)良種質(zhì)資源獲得和新品種的培育創(chuàng)建一條新的有效途徑。游離小孢子培養(yǎng)作為人工誘導(dǎo)單倍體的有效途徑，具有實(shí)用性。小孢子培養(yǎng)具有單細(xì)胞、單倍體和較高胚胎發(fā)生率及較高同步性等特點(diǎn)，不僅可作為重要的細(xì)胞篩選系統(tǒng)和基因轉(zhuǎn)移的受體，而且也是獲得純合雙單倍體的快捷方法。采用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)比采用傳統(tǒng)的自交純化方法省時(shí)約23年，大大提高了育種效率，縮短了育種周期。由于小孢子培養(yǎng)技術(shù)不但可以加快育種進(jìn)程，而且可以提高選擇效率利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)可以盡快獲得單倍體和純合雙單倍體材料，有利于豐富基因庫。除此之外，游離小孢子培養(yǎng)還可以為植物性狀的分子標(biāo)記、作圖、基因定位、基因克隆和轉(zhuǎn)基因等提供大量低成本的實(shí)驗(yàn)材料。目前，國內(nèi)的小孢子培養(yǎng)研究主要集中于甘藍(lán)型油菜和白菜等植物上，結(jié)球甘藍(lán)的小孢子培養(yǎng)研究相對(duì)滯后。主要問題是效率較低，進(jìn)展緩慢，與應(yīng)用于實(shí)際育種尚有一定距離。三、
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)獲得再生植株的方法，建立結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)再生體系，成功獲得植株并移栽成活，用于結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)獲得再生植株，同時(shí)為結(jié)球甘藍(lán)遺傳育種和分子標(biāo)記和遺傳圖譜繪制研究、基因克隆和轉(zhuǎn)基因等研究提供材料。技術(shù)方案本發(fā)明是一種結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)獲得再生植株的方法，由如下步驟實(shí)現(xiàn)1)小孢子培養(yǎng)1.l取材結(jié)球甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.c即itata)實(shí)驗(yàn)材料種植于江蘇省農(nóng)科院蔬菜研究所日光溫室。盛花初期取2.16.0mm長度的干凈無污染花蕾，將花蕾保濕置于4t:冰箱低溫處理13d;1.2消毒用體積比75%酒精消毒608，接著再用質(zhì)量比8%的次氯酸鈉溶液表面3消毒15min，無菌水沖洗3次待用；1.3小孢子分離將消毒后的花蕾置于已滅菌的研缽中，加入少量pH為5.8的小孢子游離B5-13培養(yǎng)基為洗液，采用擠壓法游離小孢子，然后用450目尼龍網(wǎng)過濾，將濾液收集于離心管，1000rmin—1離心5min，棄上清液，再加入小孢子游離培養(yǎng)基離心，重復(fù)3次；所述的B5-13培養(yǎng)基為在B5培養(yǎng)基中還加入130mg/L蔗糖；4小孢子培養(yǎng)清洗后的小孢子懸浮在pH6.2的液體培養(yǎng)基1中，調(diào)整小孢子密度為1X1052X105個(gè)mL—、并加入100yL含有0.5gL-1瓊脂糖和10gL-1活性炭的水懸浮液，分裝于6cm直徑的玻璃培養(yǎng)皿中，每皿2mL，用Parafilm膜封口。32.5t:恒溫培養(yǎng)箱熱激處理24h，然后于25t:條件下靜止黑暗培養(yǎng)1520天，出現(xiàn)胚狀體(圖1);所述的液體培養(yǎng)基1為P朋.2的大量元素元素減半的NLN-13培養(yǎng)基，其中還加入0.05mgL—16-BA、20mgL—1AgN03禾口0.05mgL—12，4_D;2)小孢子胚狀體的培養(yǎng)和再生植株的獲得2.1胚狀體的萌發(fā)出現(xiàn)肉眼可見的胚狀體后，置于搖床培養(yǎng)(60r'min—^25。C黑暗下)。胚狀體發(fā)育到子葉期時(shí)轉(zhuǎn)置于25°C、5000Lx、16hh—1的光照下培養(yǎng)57d至出現(xiàn)子葉型胚狀體(圖2)，待胚轉(zhuǎn)綠后轉(zhuǎn)到繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)過34次繼代將無根試管苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)；獲得再生植株試管苗(圖3);所述的繼代培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基+蔗糖20gL-^瓊脂12gL—'+6-BA0.2mgL—^活性炭0.lmgmL—、pH5.8;所述的生根培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基+蔗糖20gL-^瓊脂8gL—^NAA0.2mgL-、pH5.8;2.2植株再生將試管苗在培養(yǎng)室內(nèi)開瓶煉苗，馴化移栽到裝有滅菌基質(zhì)的營養(yǎng)缽中(圖4)，其中泥炭、營養(yǎng)土和蛭石的體積比為2:1:l的營養(yǎng)缽中，用塑料薄膜覆蓋，放于光照培養(yǎng)箱中，保持25°C，12h光照和12h黑暗交替培養(yǎng)，1周后營養(yǎng)缽放置外界陰涼處，逐步煉苗，3周后將其移栽到大田，獲得所要的植株。作為一種優(yōu)化方式所述的取材處理時(shí)間為ld，可以提高有利小孢子的出胚率，所述的花蕾的長度為3.14.5mm，小孢子胚產(chǎn)量最高，平均每蕾產(chǎn)胚13.3個(gè)。本發(fā)明采取將純化的小孢子于32.5t:高溫?zé)峒ぬ幚?4h，然后于25。C條件下靜止黑暗培養(yǎng)，可以提高小孢子培養(yǎng)的出胚率。有益效果本研究以結(jié)球甘藍(lán)為材料，建立了游離小孢子培養(yǎng)與植株再生體系，為結(jié)球甘藍(lán)的細(xì)胞、基因工程等的深入研究奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的一種結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)獲得再生植株的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果①本發(fā)明在分離小孢子前進(jìn)行花蕾短期的低溫預(yù)處理，可以提高有利小孢子的出胚率。對(duì)不同材料的適宜花蕾經(jīng)4t:低溫處理0d(ck)、ld、2d、3d，進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)。研究結(jié)果表明，經(jīng)ld低溫處理小孢子誘導(dǎo)出胚率均比對(duì)照高，平均值為12.06胚/蕾，高出對(duì)照9.3胚/蕾；而經(jīng)2d、3d低溫處理的出胚效果較差，平均出胚率分別為6.23胚/蕾和0.30胚/蕾。由此表明，結(jié)球甘藍(lán)花蕾4t:低溫處理ld可以提高小孢子培養(yǎng)的誘導(dǎo)率，但過長的低溫預(yù)處理時(shí)間，反而會(huì)使其誘導(dǎo)出胚率降低。②本發(fā)明采取將純化的小孢子于32.5t:高溫?zé)峒ぬ幚?4h，然后于25。C條件下靜止黑暗培養(yǎng)，可以提高小孢子培養(yǎng)的出胚率。試驗(yàn)結(jié)果表明，單獨(dú)在25t:恒溫下培養(yǎng)的小孢子沒有出現(xiàn)胚狀體，而不同溫度和時(shí)間組合的熱激處理，能夠剌激小孢子培養(yǎng)出胚，其中32.5t:處理24h效果最好，為有利于出胚的最佳條件。③本發(fā)明活性炭將高壓滅菌后的活性炭懸浮液加入培養(yǎng)基中，使其最終濃度分別為0.05、0.1、0.2mg'L-l，以不加活性炭為對(duì)照，觀察小孢子培養(yǎng)出胚情況。結(jié)果表明，在大量元素元素減半的NLN-13培養(yǎng)基中添加0.lmg/mL活性炭，對(duì)不同的基因型出胚率均表現(xiàn)不同程度的促進(jìn)作用。對(duì)于易出胚基因型促進(jìn)作用不顯著，而出胚能力較弱的基因型添加0.lmg/mL活性碳的后誘導(dǎo)率可提高6倍。但是高濃度活性炭阻止胚胎誘導(dǎo)④本發(fā)明在小孢子培養(yǎng)基本培養(yǎng)基中加入適量濃度的不同植物生長調(diào)節(jié)劑，可以提高游離小孢子培養(yǎng)的出胚率。在培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的6-BA、NAA、AgN03、2，4-D，以不加生長調(diào)節(jié)劑為對(duì)照，觀察小孢子培養(yǎng)出胚情況。結(jié)果表明，不添加任何調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基出胚率相對(duì)較低，與產(chǎn)胚量最高的相差近2倍。單獨(dú)加入0.05mgL—16-BA或20mgL—1AgN03或0.05mgL—12，4_D均可以提高出胚率。加入NAA則使出胚率降低，說明NAA不利于胚胎發(fā)育。同時(shí)向培養(yǎng)基中加入0.05mgL-16-BA、20mgL-1AgN03、0.05mgL-12，4_D小孢子出胚率最高，可達(dá)10.9胚/蕾。試驗(yàn)結(jié)果表明在培養(yǎng)基中同時(shí)添加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑，其中添加0.05mgL—16-BA、20mgL—1AgN03、0.05mgL—12，4_D的小孢子出胚率最高，比不添加任何調(diào)節(jié)劑的出胚率提高1倍多。⑤本發(fā)明成功獲得再生植株(圖3)。再生植株馴化后移栽成活(圖4)。本發(fā)明建立了結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子細(xì)胞培養(yǎng)再生體系，成功獲得植株并移栽成活，可用于結(jié)球甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)獲得再生植株，同時(shí)為結(jié)球甘藍(lán)的細(xì)胞、基因工程提供獲得再生植株的技術(shù)。⑥盛花初期取2.13.0、3.14.0、4.1.5.0、5.16.Omm長度的花蕾，進(jìn)行分離，取沉淀物用醋酸洋紅染色，在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)視野中小孢子發(fā)育各個(gè)時(shí)期的比例，比較不同長度花蕾的小孢子胚胎發(fā)生能力。結(jié)果表明，取花蕾長度為3.1.4.0mm時(shí)，小孢子胚產(chǎn)量最高，平均每蕾產(chǎn)胚13.3個(gè)。注6-BA為6-節(jié)氨基腺嘌呤，2，4-D為4-dichlorophenoxyaceticacid，2，4-D。四圖1結(jié)球甘藍(lán)胚狀體圖2結(jié)球甘藍(lán)子葉胚圖3小孢子胚分化成苗圖圖4小孢子植株五、具體實(shí)施方案本發(fā)明所提供的結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)和植株再生的方法，其實(shí)施方案如下實(shí)施例11小孢子培養(yǎng)1.1取材結(jié)球甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.c即itata)實(shí)驗(yàn)材料種植于江蘇省農(nóng)科院蔬菜研究所日光溫室；盛花初期取2.16.Omm長度的干凈無污染花蕾，將花蕾保濕置于4"冰箱低溫預(yù)處理13d。1.2消毒用體積比75%酒精消毒608，接著再用質(zhì)量比8%的次氯酸鈉溶液表面消毒15min，無菌水沖洗3次待用。1.3小孢子分離將消毒后的花蕾置于已滅菌的研缽中，加入少量pH為5.8的小孢子游離培養(yǎng)B5-13液體培養(yǎng)基為洗液，采用擠壓法游離小孢子，然后用450目尼龍網(wǎng)過濾，將濾液收集于離心管，1000rmin—1離心5min，棄上清液，再加入小孢子游離培養(yǎng)基離心，重復(fù)3次。1.4小孢子培養(yǎng)將清洗后的小孢子懸浮在1/2NLN-13+0.05mgL—16-BA+20mg*L—1AgN03+0.05mg*L—12，4_D+，pH6.2的培養(yǎng)基中，調(diào)整小孢子密度為1X1052X1()S個(gè)*mL—、分裝于6cm直徑的玻璃培養(yǎng)皿中，每皿3mL，用Parafilm膜封口。于32.5°C恒溫培養(yǎng)箱熱激處理24h，然后于25t:條件下靜止黑暗培養(yǎng)1520d，觀察出現(xiàn)胚狀體情況。2小孢子胚狀體的培養(yǎng)和再生植株的獲得2.1胚狀體的萌發(fā)出現(xiàn)肉眼可見的胚狀體后，置于搖床培養(yǎng)(60r'min—^25。C黑暗下)。胚狀體發(fā)育到子葉期時(shí)轉(zhuǎn)置于25°C、5000Lx、16h*h—1的光照下培養(yǎng)57d至出現(xiàn)子葉型胚狀體(圖2)，待胚轉(zhuǎn)綠后轉(zhuǎn)到B5+蔗糖20gL—1十瓊脂12gL—、6-BA0.2mgL—1十活性炭0.lmgmL—、ffl5.8的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)過3_4次繼代將無根試管苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基配方為B5+蔗糖20gL—^瓊脂8gL—^NAA0.2mgL—、8。獲得再生植株試管苗(圖3)。2.1植株再生將試管苗在培養(yǎng)室內(nèi)開瓶煉苗，馴化移栽到裝有滅菌基質(zhì)的營養(yǎng)缽中(圖4)，其中泥炭、營養(yǎng)土和蛭石的體積比為2:1:l的營養(yǎng)缽中，用塑料薄膜覆蓋，放于光照培養(yǎng)箱中，保持25°C，12h光照和12h黑暗的條件，1周后營養(yǎng)缽放置外界陰涼處，逐步煉苗，3周后將其移栽到大田，獲得植株。附培養(yǎng)基配方成分NLN-13培養(yǎng)基(mg/L)B5培養(yǎng)基(mg/L)繼代培養(yǎng)基(mg/L)生根培養(yǎng)基(mg/L)大量元素KH2P(VH20(磷酸二氫鉀)125-170170Ca(N03)2.4H20(硝酸鈣)500-<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例21小孢子培養(yǎng)1.l取材結(jié)球甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.c即itata)實(shí)驗(yàn)材料種植于江蘇省農(nóng)科院蔬菜研究所日光溫室；盛花初期取3.1.4.0rnrnmm長度的干凈無污染花蕾，將花蕾保濕置于4t:冰箱低溫預(yù)處理ld。1.2消毒用體積比75%酒精消毒608，接著再用質(zhì)量比8%的次氯酸鈉溶液表面消毒15min，無菌水沖洗3次待用。1.3小孢子分離將消毒后的花蕾置于已滅菌的研缽中，加入少量pH為5.8的小孢子游離培養(yǎng)B5-13液體培養(yǎng)基為洗液，采用擠壓法游離小孢子，然后用450目尼龍網(wǎng)過濾，將濾液收集于離心管，1000rmin—1離心5min，棄上清液，再加入小孢子游離培養(yǎng)基離心，重復(fù)3次。1.4小孢子培養(yǎng)將清洗后的小孢子懸浮在液體培養(yǎng)基1(大量元素元素減半的NLN-13培養(yǎng)基+0.05mg*L—16-BA+20mgL—1AgN03+0.05mg*L—12，4_D，p朋.2)，調(diào)整小孢子密度為1X1052X1()S個(gè)*mL—1;分裝于6cm直徑的玻璃培養(yǎng)皿中，每皿3mL，用Parafilm膜封口。于32.5t:恒溫培養(yǎng)箱熱激處理24h，然后于25t:條件下靜止黑暗培養(yǎng)1520d，觀察出現(xiàn)胚狀體情況。2小孢子胚狀體的培養(yǎng)和再生植株的獲得2.1胚狀體的萌發(fā)出現(xiàn)肉眼可見的胚狀體后，置于搖床培養(yǎng)(60r"min—\25t:黑暗下)。胚狀體發(fā)育到子葉期時(shí)轉(zhuǎn)置于25t:、5000Lx、16h*h—1的光照下培養(yǎng)57d至出現(xiàn)子葉型胚狀體(圖2)，待胚轉(zhuǎn)綠后轉(zhuǎn)到B5培養(yǎng)基+蔗糖20gL—^瓊脂12gL—'+6-BA0.2mgL—^活性炭0.lmgmL—、PH5.8的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)過3-4次繼代將無根試管苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基配方為B5培養(yǎng)基+蔗糖20gL-^瓊脂8gL—^NAA0.2mgL-、PH5.8。獲得再生植株試管苗(圖3)。2.1植株再生將試管苗在培養(yǎng)室內(nèi)開瓶煉苗，馴化移栽到裝有滅菌基質(zhì)的營養(yǎng)缽中(圖4)，其中泥炭、營養(yǎng)土和蛭石的體積比為2:1:l的營養(yǎng)缽中，用塑料薄膜覆蓋，放于光照培養(yǎng)箱中，保持25°C，12h光照和12h黑暗的條件，1周后營養(yǎng)缽放置外界陰涼處，逐步煉苗，3周后將其移栽到大田，獲得植株。8權(quán)利要求一種結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)獲得再生植株的方法，包括以下步驟1)小孢子培養(yǎng)1.1取材盛花初期取3.1～4.0mm長度的干凈無污染花蕾，將花蕾保濕置于4℃處理1～3d；1.2消毒花蕾用體積比75％酒精消毒60s，質(zhì)量比8％的次氯酸鈉溶液表面消毒15min，無菌水沖洗；1.3小孢子分離將消毒后的花蕾加入pH5.8的小孢子游離B5-13培養(yǎng)基，采用擠壓法游離小孢子，然后用450目尼龍網(wǎng)過濾，將濾液收集于離心管，1000r·min-1離心5min，棄上清液，再加入小孢子游離培養(yǎng)離心；1.4小孢子培養(yǎng)清洗后的小孢子懸浮在pH6.2的液體培養(yǎng)基1中，調(diào)整小孢子密度為1×105～2×105個(gè)mL-1，并加入100μL的含有0.5g·L-1瓊脂糖和10g·L-1活性炭的水懸浮液，于32.5℃恒溫培養(yǎng)箱熱激處理24h，再轉(zhuǎn)移到25℃條件下靜置黑暗培養(yǎng)15～20天；2)小孢子胚狀體的培養(yǎng)和再生植株的獲得2.1胚狀體的萌發(fā)出現(xiàn)肉眼可見的胚狀體后，置于搖床60r·min-1、25℃黑暗培養(yǎng)；胚狀體發(fā)育到子葉期時(shí)轉(zhuǎn)置于光照下靜置培養(yǎng)5～7d，待胚轉(zhuǎn)綠后轉(zhuǎn)到繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)過3-4次繼代將無根試管苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)，條件為25℃、5000Lx、16h·d-1；2.2植株再生再生株長到含4～5片葉的健壯苗時(shí)，在培養(yǎng)室內(nèi)開瓶煉苗，馴化移栽到裝有滅菌基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，于25℃下12h光照和12h黑暗交替靜值培養(yǎng)，1周后營養(yǎng)缽放置外界陰涼處，逐步煉苗，3周后將其移栽到大田，獲得植株。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)及植株再生的方法，其征在于所述的繼代培養(yǎng)基為B5+蔗糖20g*L—^瓊脂12g*L—'+6-BA0.2mg*L—^活性炭0.lmg'mL—、pH5.8;生根培養(yǎng)基為B5+蔗糖20gL-^瓊脂8gL—^NAA0.2mgL-、pH5.8。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)及植株再生的方法，其特征在于所述的滅菌基質(zhì)為泥炭、營養(yǎng)土和蛭石的體積比為2:1:1。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)及植株再生的方法，其特征在于所述的取材預(yù)處理時(shí)間為ld。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)及植株再生的方法，其特征在于所述的花蕾的長度為3.14.0mm。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)及植株再生的方法，其特征在于所述的液體培養(yǎng)基1為P朋.2的大量元素元素減半的NLN-13培養(yǎng)基，其中還加入0.05mg17VBA、20mg17丄Ag叫禾口0.05mg17丄2，4-D。全文摘要本發(fā)明公開了一種結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)獲得再生植株的方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。包括取適合長度的花蕾，進(jìn)行4℃低溫預(yù)處理24h，消毒后采用擠壓法使小孢子游離，過濾并離心，將純化的小孢子懸浮在的液體培養(yǎng)基中，32.5℃高溫?zé)峒ぬ幚?4h后轉(zhuǎn)移到25℃黑暗培養(yǎng)15-20天；出現(xiàn)肉眼可見的胚狀體后，置于光照下培養(yǎng)5～7d至出現(xiàn)子葉型胚狀體，待胚狀體轉(zhuǎn)綠后接到繼代培養(yǎng)基上萌發(fā)然后轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上生根，獲得完整的再生植株；然后開瓶煉苗，馴化移栽到裝有滅菌基質(zhì)的營養(yǎng)缽中；利用該方法進(jìn)行培養(yǎng)，獲得較高頻率的胚狀體，所獲得的單倍體再生植株既是良好的育種材料，也是進(jìn)行分子標(biāo)記和遺傳圖譜繪制研究、基因克隆和轉(zhuǎn)基因等研究的理想材料。文檔編號(hào)A01H4/00GK101773072SQ20101001823公開日2010年7月14日申請(qǐng)日期2010年1月20日優(yōu)先權(quán)日2010年1月20日發(fā)明者嚴(yán)繼勇,宋立曉,曾愛松,高兵申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院