專利名稱：利用甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)選育隱性核不育臨保系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甘藍(lán)型油菜育種領(lǐng)域，具體涉及一種利用甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)選育隱性核不育臨保系的方法。

背景技術(shù)：
甘藍(lán)型油菜游離小孢子的分離技術(shù)簡(jiǎn)單，通過(guò)游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得胚狀體和再生苗的效率顯著高于花藥培養(yǎng)，而且小孢子培養(yǎng)是研究花粉細(xì)胞分化條件、胚胎發(fā)生和形態(tài)建成機(jī)理的一種較為理想的方法，因此該技術(shù)一直受到各國(guó)油菜育種家的普遍青睞。多年來(lái)，許多學(xué)者對(duì)小孢子培養(yǎng)的培養(yǎng)基成份、蕾的大小、小孢子培養(yǎng)過(guò)程中溫度的變化、提高再生苗頻率等諸方面進(jìn)行了廣泛的研究，使得小孢子培養(yǎng)技術(shù)逐步成熟并得到了廣泛的應(yīng)用。
在常規(guī)雜交育種中，獲得穩(wěn)定遺傳的后代或株系一般要經(jīng)過(guò)5～8代性狀選擇。如果對(duì)F1代植株進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，再生植株為單培體，經(jīng)染色體加倍后產(chǎn)生純合二倍體單株(double haploid，簡(jiǎn)稱DH)，這種二倍體單株各種遺傳性狀已純合，不會(huì)發(fā)生分離，因此可以快速使性狀純合；在小孢子培養(yǎng)形成的DH系后代中，沒(méi)有顯性基因掩蓋隱性基因表現(xiàn)的干擾，有利于對(duì)隱性基因的篩選；DH系后代的性狀理論上是按照配子體基因型(花粉基因型)分離的，即以2n分離，而F2代的性狀理論上是按照胞質(zhì)體基因型分離的，即以4n分離，為了得到目標(biāo)性狀單株，前者群體遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于后者，因此甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)在許多油菜育種計(jì)劃中得到應(yīng)用。
20118A是上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院孫超才研究員于1997年選育的一種新的隱性細(xì)胞核雄性不育，其不育株花藥空癟，無(wú)花粉，套袋自交不結(jié)實(shí)，且不育性穩(wěn)定，不受環(huán)境條件的影響。通過(guò)普通遺傳學(xué)研究證明20118AB為隱性上位互作遺傳模式，即其不育性受兩對(duì)重疊隱性不育基因(a和b)與一對(duì)隱性上位抑制基因(rf)互作控制，隱性上位基因純合時(shí)對(duì)隱性不育基因起作用。不育系可通過(guò)兄妹交保持，不育株的基因型有純合型aabbRfRf和雜合型aabbRfrf兩種，三對(duì)基因?yàn)殡[性(aabbrfrf)時(shí)可作臨保系，與純合型不育系雜交能夠生產(chǎn)全不育群體，然后利用全不育系與恢復(fù)系雜交生產(chǎn)雜交種(參見(jiàn)圖1)。目前由該系統(tǒng)選育的三個(gè)國(guó)審雙低雜交油菜品種“滬油雜1號(hào)”、“向農(nóng)03”和“滬油雜4號(hào)”正在生產(chǎn)上大面積的推廣，說(shuō)明該不育系統(tǒng)具有廣闊的應(yīng)用前景與生產(chǎn)利用價(jià)值。
但是由于臨保系是受到三對(duì)隱性基因控制(aabbrfrf)，且表現(xiàn)可育，沒(méi)有可以用于選擇的表現(xiàn)性狀，因此需要廣泛的測(cè)交，因其受三對(duì)隱性基因控制，分離群體大，基因型多且復(fù)雜，導(dǎo)致測(cè)交與測(cè)交種鑒定的工作量大，選育周期長(zhǎng)，選育難度很大。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種利用甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)選育隱性核不育臨保系的方法，通過(guò)甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)，尋找一種簡(jiǎn)單、可行、高效技術(shù)，能夠快速獲得受三對(duì)隱性基因控制(aabbrfrf)且遺傳背景純合的臨保系，并在甘藍(lán)型油菜隱性核不育雜交育種中得到有效應(yīng)用。
為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn) 一種利用甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)選育隱性核不育臨保系的方法，首先以優(yōu)良的品種/系為母本，以隱性核不育臨保系為父本雜交，獲得F1代；然后以甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)對(duì)F1代植株的游離小孢子進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)而獲得DH株系；再以該DH株系自交并與不育系測(cè)交，測(cè)交種為100％不育，對(duì)應(yīng)的DH單株即為本發(fā)明所述的隱性核不育臨保系(參見(jiàn)圖2)。
所述方法具體包括以下步驟 a、以F1代植株為供體，在花蕾期，每次從油菜花序上取3～4mm大小的蕾，表面消毒后用無(wú)菌水清洗3次；加入B5培養(yǎng)液研磨，用40μm尼龍網(wǎng)過(guò)濾，濾液經(jīng)過(guò)100g離心5-8min，吸去上清液后，再向離心管中加含秋水仙堿的NLN-16培養(yǎng)液密封，置于32℃的恒溫箱中暗培養(yǎng)48h，然后重復(fù)上述步驟離心，吸去上清液，加入NLN-13培養(yǎng)液分裝到培養(yǎng)皿中，密封，置于25℃的恒溫箱中暗培養(yǎng)，當(dāng)肉眼可見(jiàn)到胚狀體后轉(zhuǎn)到搖床上繼續(xù)培養(yǎng)1-2周。
b、將上述a步中的胚狀體轉(zhuǎn)移到固體B5培養(yǎng)基上，在10℃的光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)、誘導(dǎo)形成小植株，并將每個(gè)不同基因型的小植株擴(kuò)繁多個(gè)拷貝，以保證每個(gè)基因型都能存活(參見(jiàn)圖3)。
c、將上述b步中的小植株分不同基因型種植到田間，到花期，將加倍成功的可育二倍體DH株系套袋自交，并與隱性核不育純合兩型系中的不育株測(cè)交。
d、將上述c步中測(cè)交種進(jìn)行鑒定，若測(cè)交種為全部不育，則對(duì)應(yīng)的單株即為本發(fā)明的隱性核不育臨保系，命名為臨保系M-6477。
所述F1代是以優(yōu)良的品種/系為母本，以隱性核不育臨保系為父本雜交而成。
所述優(yōu)良的品種/系母本為滬油15，系上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院孫超才研究員選育而成，是上海市第一個(gè)通過(guò)國(guó)家品種審定和獲得國(guó)家植物新品種保護(hù)的甘藍(lán)型雙低油菜品種，被國(guó)家科技部和農(nóng)業(yè)部列為國(guó)家級(jí)成果重點(diǎn)推廣品種之一，含油率為42.43％，芥酸含量為0.38％，硫苷含量為19.01μmol/g，農(nóng)藝性狀優(yōu)良。
所述隱性核不育臨保系為臨保系M-6029，基因型為aabbrfrf，可育，與隱性核不育20118A(aabbRfRf)雜交，其后代基因型為aabbRfrf，仍為不育，但是該不育性只能保持一代，其后代會(huì)發(fā)生育性分離，故稱基因型aabbrfrf的M-6029為甘藍(lán)型油菜隱性核不育20118A的臨保系，系上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院孫超才于1999年在隱性核不育20118A的測(cè)交組合中通過(guò)連續(xù)的自交，測(cè)交選育而成。
所述隱性核不育純合兩型系為20118AB，系上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院孫超才研究員于1993年在油菜花粉培養(yǎng)后代中發(fā)現(xiàn)的甘藍(lán)型油菜隱性核不育20118A，然后20118A與花粉培養(yǎng)后代中的可育株雜交，并連續(xù)兄妹交，于1998年而獲得的雙低甘藍(lán)型油菜隱性不育純合兩型系20118AB，其芥酸含量為0.56％，硫甙含量為23.45μmol/g。
利用上述隱性核不育純合兩型系20118AB中的不育株對(duì)DH株系進(jìn)行基因型鑒定。
其中，上述方法中所用到的B5培養(yǎng)液為B5基本組份+130g蔗糖/L；固體B5培養(yǎng)基為B5基本組份+25g蔗糖+7g瓊脂粉/L；NLN-13培養(yǎng)液為NLN基本組份+130g蔗糖/L；NLN-16培養(yǎng)液為NLN基本組份+160g蔗糖+100mg秋水仙素/L。B5基本組份和NLN基本組份的配方如下表1所示。
表1 B5基本組份和NLN基本組份的配方(mg/L)
本發(fā)明與原有隱性核不育臨保系的選育相比具有以下優(yōu)勢(shì) 1.與原有隱性核不育臨保系的選育相比效率更高從原有的以優(yōu)良的品種(系)為母本，以隱性核不育臨保系為父本雜交，獲得F1代，基因型為AaBbRfrf，利用常規(guī)的育種方法自交，從F2代植株中獲得可育的三隱性純合臨保系的概率為1/61(參見(jiàn)表2)，而利用甘藍(lán)型油菜小孢子技術(shù)選育臨保系，其DH后代實(shí)際上為雄配子基因型，8種雄配子基因型的雙二倍體中，有一個(gè)表現(xiàn)為不育，故臨保系的出現(xiàn)頻率為1/7，因此臨保系的出現(xiàn)頻率大大提高。
表2 F1自交后代的表現(xiàn)型
2.與原有隱性核不育臨保系的選育相比工作量大大降低，因利用甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得的DH系后代中，出現(xiàn)三隱性純合臨保系的頻率為1/7，而常規(guī)的選育方法為1/61，所以導(dǎo)致測(cè)交與自交的數(shù)量大為降低，后代的鑒定工作也大大減少。
3.與原有隱性核不育臨保系的選育相比縮短了育種周期，利用甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)獲得的DH臨保系，因其為單倍體直接加倍而成的，遺傳背景完全純合，故可以直接利用該DH臨保系進(jìn)行油菜雜交育種。利用原有的常規(guī)方法選育隱性核不育臨保系，需要5-8代自交和測(cè)交，才能使臨保系的基因型完全純合，因此，相對(duì)傳統(tǒng)的選育方法，其育種周期大為縮短。



圖1為隱性核不育雜交種的生產(chǎn)模式。
圖2為本發(fā)明的甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)選育臨保系的示意圖。
圖3為本發(fā)明從小孢子到發(fā)育成植株的全過(guò)程，其中a為小孢子，b為胚狀體，c誘導(dǎo)成苗，d小植株。

具體實(shí)施例方式 以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。
實(shí)施例1 F1的配置 臨保系M-6029，其基因型為aabbrfrf，是隱性核不育20118A的臨保系，系上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院孫超才研究員于1999年在隱性核不育20118A的測(cè)交組合中通過(guò)連續(xù)的自交，測(cè)交選育而成，芥酸含量為0.89％，硫苷含量為25.36μmol/g，農(nóng)藝性狀優(yōu)良，一般配合力與特殊配合力高。
滬油15，系上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院孫超才研究員選育而成，是上海市第一個(gè)通過(guò)國(guó)家品種審定和獲得國(guó)家植物新品種保護(hù)的甘藍(lán)型雙低油菜品種，被國(guó)家科技部和農(nóng)業(yè)部列為國(guó)家級(jí)成果重點(diǎn)推廣品種之一，含油率為42.43％，芥酸含量為0.38％，硫苷含量為19.01μmol/g，農(nóng)藝性狀優(yōu)良。
以上述滬油15為母本，臨保系M-6029為父本雜交獲得F1代種子。
實(shí)施例2 臨保系M-6477的選育 1.供體F1材料的小孢子培養(yǎng) 在2005年3月油菜花期，對(duì)供體材料F1(滬油15×臨保系M-6029)進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，共獲得了379個(gè)胚狀體，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得了282個(gè)單株，其中加倍植株為76個(gè)DH株系，通過(guò)測(cè)交鑒定，發(fā)現(xiàn)有8個(gè)DH株系的基因型為aabbrfrf。
2.臨保系M-6477的鑒定 將以上8個(gè)基因型為aabbrfrf的DH株系，進(jìn)行農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀檢測(cè)，得到了一個(gè)農(nóng)藝性狀好，品質(zhì)性狀好，且含油量≥45％的DH株系，將其命名為臨保系M-6477。
3.利用臨保系M-6477配置雜交種的區(qū)試表現(xiàn) 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院2008年利用上述臨保系M-6477配置了雜交組合“滬油雜8號(hào)”，雜交后代在2008～2009年度在上海市油菜區(qū)試中平均畝產(chǎn)193.50公斤，比對(duì)照增產(chǎn)20.5％；芥酸含量為0.01％，硫苷含量18.69μmol/g左右，含油量50.12％。
最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
權(quán)利要求
1.一種利用甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)選育隱性核不育臨保系的方法，其特征在于，包括以下步驟a、以F1代植株為供體，在花蕾期，每次從油菜花序上取3～4mm大小的蕾，表面消毒后用無(wú)菌水清洗3次；加入B5培養(yǎng)液研磨，用40μm尼龍網(wǎng)過(guò)濾，濾液經(jīng)過(guò)100g離心5-8min，吸去上清液后，再向離心管中加含秋水仙堿的NLN-16培養(yǎng)液密封，置于32℃的恒溫箱中暗培養(yǎng)48h，然后重復(fù)上述步驟離心，吸去上清液，加入NLN-13培養(yǎng)液分裝到培養(yǎng)皿中，密封，置于25℃的恒溫箱中暗培養(yǎng)，當(dāng)肉眼可見(jiàn)到胚狀體后轉(zhuǎn)到搖床上繼續(xù)培養(yǎng)1-2周；
b、將上述a步中的胚狀體轉(zhuǎn)移到固體B5培養(yǎng)基上，在10℃的光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)、誘導(dǎo)形成小植株，并將每個(gè)不同基因型的小植株擴(kuò)繁多個(gè)拷貝；
c、將上述b步中的小植株分不同基因型種植到田間，到花期，將加倍成功的可育二倍體DH株系套袋自交，并與隱性核不育純合兩型系中的不育株測(cè)交；
d、將上述c步中測(cè)交種進(jìn)行鑒定，若測(cè)交種為全部不育，則對(duì)應(yīng)的單株即為本發(fā)明所述的隱性核不育臨保系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)選育隱性核不育臨保系的方法，其特征在于，所述F1代是以優(yōu)良的品種/系為母本，以隱性核不育臨保系為父本雜交而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)選育隱性核不育臨保系的方法，其特征在于，所述優(yōu)良的品種/系母本為滬油15。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)選育隱性核不育臨保系的方法，其特征在于，所述隱性核不育臨保系為臨保系M-6029，基因型為aabbrfrf，可育。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)選育隱性核不育近臨保系的方法，其特征在于，所述隱性核不育純合兩型系為20118AB。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)選育隱性核不育臨保系的方法，其特征在于，利用隱性核不育純合兩型系20118AB中的不育株對(duì)DH株系進(jìn)行基因型鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)選育隱性核不育臨保系的方法，以優(yōu)良的品種/系為母本，以隱性核不育臨保系為父本雜交，獲得F1代；然后以甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)對(duì)F1代植株的游離小孢子進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，從而獲得DH株系；再以DH株系自交并與不育系測(cè)交，測(cè)交種為100％不育，對(duì)應(yīng)的DH單株即為本發(fā)明所述的隱性核不育臨保系。通過(guò)本發(fā)明可以快速獲得遺傳背景穩(wěn)定的優(yōu)良臨保系并在甘藍(lán)型油菜隱性核不育雜交育種上得到應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101766118SQ20101010448
公開(kāi)日2010年7月7日 申請(qǐng)日期2010年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月2日
發(fā)明者楊立勇, 孫超才, 王偉榮, 周熙榮, 張智奇, 周音, 李延莉, 蔣美艷, 莊靜, 顧龍弟 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院