專利名稱：：一種標(biāo)記刺參個(gè)體及檢測(cè)該標(biāo)記的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種標(biāo)記剌參個(gè)體以及檢測(cè)該標(biāo)記的方法。
背景技術(shù)：
：海參具有很高的營(yíng)養(yǎng)、保健和藥用價(jià)值，剌參是可食用的海參中品質(zhì)最好、分布最廣、產(chǎn)量最大的一種，也最具發(fā)展前途。不斷增加的市場(chǎng)需求導(dǎo)致對(duì)野生剌參的過(guò)度捕撈，引發(fā)剌參種群數(shù)量減少、資源枯竭。開(kāi)展剌參的增殖放流工作，不但有利于恢復(fù)剌參資源，增加產(chǎn)量，還可以利用剌參對(duì)沉積物的擾動(dòng)，改善和修復(fù)受損底棲環(huán)境。對(duì)剌參進(jìn)行標(biāo)記可以科學(xué)、準(zhǔn)確地評(píng)估增殖放流的效果，更深入地了解其在自然環(huán)境中的生長(zhǎng)情況、存活率和分布。然而，剌參體壁柔軟，缺乏鈣質(zhì)骨骼，對(duì)異物有排異反應(yīng)，故難以使用傳統(tǒng)標(biāo)記方法對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記。國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)標(biāo)記海參的相關(guān)方法。國(guó)外已有方法中，包括刻畫(huà)海參表皮、植入人造橡膠標(biāo)志物(visibleelastomerimplants)、編碼線標(biāo)簽(coded-wiretags)標(biāo)記、基因標(biāo)記(geneticmarkers)等。Mercier，A.，Battaglene，S.C.，Hamel，J._F.，(2000).〃Periodicmovement,recruitmentandsize—relateddistributionoftheseacucumberHolothuriascabrainSolomonIslandshydrobiologia440:81-100，(所羅門(mén)群島糙海參周期性分布、補(bǔ)充和與個(gè)體大小有關(guān)的分布)介紹了一種在海參表皮刻畫(huà)記號(hào)方法，該方法主要是用刀片在海參體壁刻數(shù)字或記號(hào)進(jìn)行標(biāo)記。該種標(biāo)記在刻畫(huà)后的幾周內(nèi)消褪，不能有效地標(biāo)記海參。Battaglene，S.C.andJ.D.Bel1(1999).PotentialofthetropicalIndo—Pacificseacuc咖ber，Holothuriascabra，forstockenhancement.StockEnhancementandSeaRanching:478490606(熱帶印度-太平洋糙海參的增殖潛力)，介紹了植入人造橡膠標(biāo)記物(visibleelastomerimplants)及編碼線標(biāo)簽(coded-wiretags)標(biāo)記海參的方法，該方法引起海參的排異反應(yīng)，致使標(biāo)記物丟失。Uthicke，S.andJ.A.H.Benzie(2002).Ageneticfingerprintrecapturetechniqueformeasuringgrowthinunmarkableinvertebrates:negativegrowthincommerciallyfishedholothurians(Holothurianobilis).MarineEcology-ProgressSeries241:221-226(用于測(cè)量難以標(biāo)記無(wú)脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)的基因指紋圖譜重捕技術(shù)有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的黑乳參的負(fù)增長(zhǎng))，介紹了一種基因標(biāo)記方法，該方法使用基于擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性的DNA指紋圖譜分析技術(shù)標(biāo)記海參，該方法價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜，不宜大規(guī)模應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)缺乏有效標(biāo)記剌參的方法，為了克服上述各種現(xiàn)有標(biāo)記方法的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種容易操作、便于識(shí)別、標(biāo)記保持時(shí)間長(zhǎng)，而且避免排異反應(yīng)的標(biāo)記剌參個(gè)體及檢測(cè)該標(biāo)記的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是—種標(biāo)記剌參個(gè)體的方法，包括以下步驟(1)取一定數(shù)量的健康剌參暫養(yǎng)在流水水槽中，禁食24-48小時(shí)，連續(xù)向水槽中充氣(空氣)；(2)配制濃度為40-160mg/L的茜素絡(luò)合指示劑(英文名AlizarinComplexonedihydrate，分子式C19H15N08)的染料溶液；(3)將剌參放入所述茜素絡(luò)合指示劑的染料溶液中浸泡16-48小時(shí)，期間連續(xù)充氣(空氣)，停止喂食；所述剌參為幼參或成參。所述茜素絡(luò)合指示劑的染料溶液，溶劑為海水。其中，海水可以為經(jīng)過(guò)沉淀、沙濾得到的海水?！N檢測(cè)采用上述標(biāo)記方法標(biāo)記的剌參的方法，包括以下步驟(1)刮取小米粒大小剌參的體壁表皮或結(jié)締組織，鋪在載玻片上；(2)向剌參體壁表皮或結(jié)締組織上滴加1-2滴10wt%NaCIO水溶液，待體壁表皮或結(jié)締組織溶解后，滴加蒸餾水1-2滴進(jìn)行稀釋，加蓋玻片；(3)在熒光顯微鏡熒光激發(fā)波長(zhǎng)510-560nm下，觀察用上述方法制成的載玻片。所述體壁表皮或結(jié)締組織溶解時(shí)間為0.5-2h。本發(fā)明的有益效果是1、本發(fā)明的標(biāo)記方法完全是在剌參正常生長(zhǎng)狀態(tài)下進(jìn)行，無(wú)需對(duì)剌參進(jìn)行注射或麻醉，不損傷剌參活體，減少了標(biāo)記的操作步驟，避免剌參活力降低，降低死亡率。2、本發(fā)明所使用的染料價(jià)格低廉易得，節(jié)省了標(biāo)記所需費(fèi)用。3、此外，采用本發(fā)明的標(biāo)記方法，由于染料僅對(duì)剌參體壁內(nèi)骨片染色標(biāo)記，并未植入外來(lái)異物，避免剌參對(duì)異物的排異反應(yīng)，從而延長(zhǎng)了標(biāo)記的保留時(shí)間。具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例1:1、標(biāo)記步驟(1)取15頭10士3.46g健康剌參暫養(yǎng)在流水水槽中，禁食24h，連續(xù)充氣(空氣)；(2)將40mg茜素絡(luò)合指示劑溶解在1000mL過(guò)濾海水中，不斷攪動(dòng)，使茜素絡(luò)合指示劑完全溶解(必要時(shí)使用超聲波清洗儀加快溶解速度)；(3)將剌參放入溶液中浸泡16h，其間連續(xù)充氣(空氣)，停止喂食。(4)16h后，將所有剌參從茜素絡(luò)合指示劑溶液取出后，15頭剌參即正常攝食、活動(dòng)。l個(gè)月后，海參死亡O只，存活率為100%。2、檢測(cè)步驟(1)刮取小米粒大小剌參的體壁表皮或結(jié)締組織，鋪在載玻片上；(2)用普通滴管滴加1滴10wt%NaC10水溶液，待體壁表皮或結(jié)締組織溶解后(lh);用普通滴管滴加蒸餾水l-2滴進(jìn)行稀釋，加蓋玻片；(3)在熒光顯微鏡熒光激發(fā)波長(zhǎng)510-560nm下觀察，其中染色的骨片發(fā)出紅色熒光，未染色的骨片不可見(jiàn)。1個(gè)月后，所有被標(biāo)記的剌參個(gè)體，均可檢出熒光標(biāo)記。實(shí)施例2:與實(shí)施例1不同之處在于1、標(biāo)記步驟(1)取30頭4.49士1.27g健康剌參暫養(yǎng)在流水水槽中，禁食36h，連續(xù)充氣(空氣)；(2)將160mg茜素絡(luò)合指示劑溶解在1000mL過(guò)濾海水中，不斷攪動(dòng)，使茜素絡(luò)合指示劑完全溶解(必要時(shí)使用超聲波清洗儀加快溶解速度)；(3)將剌參放入溶液中浸泡24h，其間連續(xù)充氣(空氣)，停止喂食。(4)24h后，將所有剌參從茜素絡(luò)合指示劑溶液取出后，30頭剌參即正常攝食、活動(dòng)。l個(gè)月后，海參死亡2只，存活率為93.3%。2、檢測(cè)步驟(1)刮取小米粒大小剌參的體壁表皮或結(jié)締組織，鋪在載玻片上；(2)用普通滴管滴加1滴10wt%NaC10水溶液，待體壁表皮或結(jié)締組織溶解后(2h);用普通滴管蒸餾水l-2滴進(jìn)行稀釋，加蓋玻片；(3)在熒光顯微鏡熒光激發(fā)波長(zhǎng)510-560nm下下觀察，被染色的骨片發(fā)出紅色熒光，未被染色的骨片不可見(jiàn)。1個(gè)月后，所有被標(biāo)記的剌參個(gè)體，均可檢出熒光標(biāo)記。實(shí)施例3:與實(shí)施例l不同之處在于1、標(biāo)記步驟(1)取20頭15士7.26g健康剌參暫養(yǎng)在流水水槽中，禁食48h，連續(xù)充氣(空氣)；(2)將80mg茜素絡(luò)合指示劑溶解在1000mL過(guò)濾海水中，不斷攪動(dòng)，使茜素絡(luò)合指示劑完全溶解(必要時(shí)使用超聲波清洗儀加快溶解速度)；(3)將剌參放入溶液中浸泡48h，其間連續(xù)充氣(空氣)，停止喂食。(4)48h后，將所有剌參從茜素絡(luò)合指示劑溶液取出后，20頭剌參即正常攝食、活動(dòng)。l個(gè)月后，海參死亡1只，存活率為95%。2、檢測(cè)步驟(1)刮取小米粒大小剌參的體壁表皮或結(jié)締組織，鋪在載玻片上；(2)用普通滴管滴加1滴10wt%NaC10水溶液，待體壁表皮或結(jié)締組織溶解后(0.5h);用普通滴管蒸餾水1-2滴進(jìn)行稀釋，加蓋玻片；(3)在熒光顯微鏡熒光激發(fā)波長(zhǎng)510-560nm下觀察，被染色的骨片發(fā)出紅色熒光，未被染色的骨片不可見(jiàn)。1個(gè)月后，所有被標(biāo)記的剌參個(gè)體，均可檢出熒光標(biāo)記。表1:實(shí)施例中被標(biāo)記剌參的標(biāo)記檢出和存活情況<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>所有先將剌參禁食一段時(shí)間，再使用茜素絡(luò)合指示劑溶液對(duì)剌參進(jìn)行浸染的標(biāo)記方法，以及先用NaC10水溶液處理用茜素絡(luò)合指示劑溶液標(biāo)記過(guò)的剌參體壁表皮或結(jié)締組織，然后再放在熒光顯微鏡下檢測(cè)的方法，都將落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。經(jīng)實(shí)施，共標(biāo)記剌參65頭，從茜素絡(luò)合指示劑溶液取出后，剌參即正常攝食、活動(dòng)。1個(gè)月后，成活率95.38%，經(jīng)檢測(cè)，所有被標(biāo)記的剌參個(gè)體，均可檢出標(biāo)記物。權(quán)利要求一種標(biāo)記刺參個(gè)體的方法，其特征在于，包括以下步驟a取健康刺參暫養(yǎng)在流水水槽中，禁食24-48小時(shí)，連續(xù)向水槽中充氣；b配制濃度為40-160mg/L的茜素絡(luò)合指示劑染料溶液；c將刺參放入所述茜素絡(luò)合指示劑染料溶液中浸泡16-48小時(shí)，期間連續(xù)充氣，停止喂食。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的標(biāo)記剌參個(gè)體的方法，其特征在于所述剌參為幼參或成參。3.—種檢測(cè)采用權(quán)利要求1所述方法標(biāo)記剌參的方法，其特征在于，包括以下步驟a刮取小米粒大小剌參的體壁表皮或結(jié)締組織，鋪在載玻片上；b向剌參體壁表皮或結(jié)締組織上滴加10wt%NaClO水溶液，待體壁表皮或結(jié)締組織溶解后，滴加蒸餾水1-2滴進(jìn)行稀釋，加蓋玻片；c在熒光顯微鏡熒光激發(fā)波長(zhǎng)510-560nm下，觀察用上述方法制成的載玻片。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的標(biāo)記剌參個(gè)體的方法，其特征在于體壁表皮或結(jié)締組織溶解時(shí)間為0.5-2h。全文摘要本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種標(biāo)記刺參個(gè)體以及檢測(cè)該標(biāo)記的方法。標(biāo)記時(shí)，先將刺參禁食一段時(shí)間，然后將其用茜素絡(luò)合指示劑茜素絡(luò)合指示劑溶液浸泡16-48小時(shí)。檢測(cè)時(shí)，先用NaClO水溶液處理用茜素絡(luò)合指示劑溶液標(biāo)記過(guò)的刺參體壁表皮或結(jié)締組織，然后再放在熒光顯微鏡下檢測(cè)。本發(fā)明的標(biāo)記方法完全是在刺參正常生長(zhǎng)狀態(tài)下進(jìn)行，無(wú)需對(duì)刺參進(jìn)行注射或麻醉，不損傷刺參活體，減少了標(biāo)記的操作步驟，避免刺參活力降低，降低死亡率。而且所使用的染料價(jià)格低廉易得，節(jié)省了標(biāo)記所需費(fèi)用。文檔編號(hào)A01K61/00GK101785438SQ20101010539公開(kāi)日2010年7月28日申請(qǐng)日期2010年1月29日優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日發(fā)明者劉鷹,楊紅生,王清,趙鵬,邱天龍申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所