專利名稱：：一種融合基因片段rolB-FGFs及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，確切地說一種融合基因片段rolB-FGFs及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：FGFs(fibroblastgrowthfactors)，在細(xì)胞的增值、變異和正常的生長(zhǎng)上都是有效的調(diào)節(jié)劑，它參與病理中腫瘤的處理和轉(zhuǎn)移(Gaizie，etal，Biochem，CellBiol，1997，75:669)。FGFs具有廣泛的生物學(xué)活性，它來源于神經(jīng)組織、垂體、腎上腺皮質(zhì)、視網(wǎng)膜、黃體和胎盤等，能剌激所有源自中胚層的細(xì)胞以及許多源自神經(jīng)外胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞的增生。在體內(nèi)，F(xiàn)GFs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有趨化和促有絲分裂作用，促進(jìn)血管形成；參與細(xì)胞過度增生和血管過度形成所引起的多種病理?yè)p害。FGFs被認(rèn)為是剌激血管細(xì)胞增殖、遷移和分化的第一分子，是典型的血管生長(zhǎng)因子。FGFs具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFs對(duì)體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞有促有絲分裂作用。FGFs參與創(chuàng)傷修復(fù)，可能是誘發(fā)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，剌激內(nèi)皮細(xì)胞遷移，誘發(fā)新毛細(xì)血管生長(zhǎng)，增加毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò).使損傷組織血管化。FGFs還可促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，促進(jìn)皮膚再生。迄今為止，至少已經(jīng)知道23個(gè)FGF家族的成員，其中aFGF和bFGF是FGF家族的典型成員，研究的比較成熟，但目前FGF家族的成員大多是通過原核系統(tǒng)或部分真核系統(tǒng)表達(dá)出來的，幾乎很少通過植物系統(tǒng)表達(dá)，尤其是植物發(fā)狀根系統(tǒng)。近幾年來，利用植物生物反應(yīng)器表達(dá)生產(chǎn)具有臨床應(yīng)用價(jià)值的藥用蛋白(包括疫苗、抗體)已成為生物制藥產(chǎn)業(yè)的熱點(diǎn)領(lǐng)域，具有極大的市場(chǎng)前景和商業(yè)價(jià)值，日益引起人們的關(guān)注.但植物生物反應(yīng)器在研究的過程中，逐步發(fā)現(xiàn)許多問題，如蛋白產(chǎn)量低、下游加工(目的蛋白的提取純化)困難以及由此而引起的高成本等.因此，結(jié)合植物自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，發(fā)展植物發(fā)狀根表達(dá)系統(tǒng)，不但可以提高植物本身的次生代謝產(chǎn)物含量，同時(shí)可以省略下游加工過程，利于產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，因此本發(fā)明采用植物發(fā)狀根系統(tǒng)生產(chǎn)FGFs蛋白，這將結(jié)合醫(yī)藥與食品領(lǐng)域，開發(fā)出功能性食品與藥品的一條重要途徑。利用分泌途徑可以有效地提高外源蛋白的表達(dá)量。一般真核生物分泌蛋白N端都有信號(hào)肽序列，引導(dǎo)蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，經(jīng)高爾基體加工后，運(yùn)送到細(xì)胞的各個(gè)部位。在利用生物反應(yīng)器表達(dá)外源蛋白的時(shí)候，外源蛋白可以在信號(hào)肽的引導(dǎo)下到達(dá)細(xì)胞的特定部位，或分泌到細(xì)胞外，這樣可以避免宿主細(xì)胞把外源蛋白視為異己蛋白而降解，從而提高了外源蛋白的表達(dá)量。應(yīng)用信號(hào)肽引導(dǎo)外源蛋白分泌表達(dá)也是近年來的研究熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因的安全性從一開始就受到了廣泛爭(zhēng)論。人們擔(dān)心在轉(zhuǎn)基因作物的商品化種植過程中，除草劑基因可能經(jīng)自然雜交，抗生素基因可能通過轉(zhuǎn)染腸道細(xì)菌，從而造成自然界的非轉(zhuǎn)基因作物對(duì)除草劑、人類對(duì)抗生素產(chǎn)生抗性。近年來，人們開始采用一種新型的正篩選方法——甘露糖篩選體系。該體系以大腸桿菌磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)基因?yàn)闃?biāo)記基因，甘露糖為篩選劑進(jìn)行篩選。目前，PMI/甘露糖篩選體系已成功用于甜菜、擬南芥、玉米、小麥、水稻、木薯等植物。實(shí)驗(yàn)證明，發(fā)狀根具有細(xì)胞培養(yǎng)和一般器官培養(yǎng)所不能兼?zhèn)涞奶攸c(diǎn)，幾乎所有雙子葉植物中由根部合成的次生代謝物質(zhì)都可以通過發(fā)狀根來生產(chǎn)，這一生物技術(shù)為植物有用成分的大量生產(chǎn)提供了新的途徑，日益引起人們的關(guān)注。發(fā)狀根培養(yǎng)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的基因工程和細(xì)胞工程相結(jié)合的一項(xiàng)技術(shù)，它將發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)Ri質(zhì)粒中的T-DNA整合到植物細(xì)胞的DNA上，誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生發(fā)狀根。發(fā)狀根培養(yǎng)是獲得有用次生代謝產(chǎn)物的重要途徑。對(duì)于任何一種類型的發(fā)根農(nóng)桿菌而言，其菌體內(nèi)部存在著大小各異的3種質(zhì)體，例如在A4菌株的菌體內(nèi)，存在著pRiA4a、pRiA4b和pRiA4c3中質(zhì)粒，其中pRiA4b質(zhì)粒與發(fā)狀根的誘發(fā)有關(guān)，它的物理結(jié)構(gòu)見圖1。從圖l可以看出，農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒有兩個(gè)T-DNA區(qū)，即TfDNA和TfDNA，這兩段T-DNA之間隔著一段15kb的非轉(zhuǎn)移DNA。TfDNA大小為1920kb，包括4個(gè)與發(fā)狀根形態(tài)發(fā)生有關(guān)的位點(diǎn)rolA、B、C、D，rolA基因在營(yíng)養(yǎng)階段和生殖階段表達(dá)強(qiáng)烈，而在種子中不表達(dá)。rolB基因是形成毛狀根的關(guān)鍵基因，其表達(dá)引起植株產(chǎn)生大量的毛狀根。rolB基因主要限于在分生組織的原始細(xì)胞和韌皮部的薄壁組織細(xì)胞表達(dá)。rolC基因在煙草中表達(dá)導(dǎo)致植株變矮、頂端優(yōu)勢(shì)減弱、葉片色素含量下降、雄性不育。自1973年Ackema皿首次報(bào)道了發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化高等植物以來，迄今為止已經(jīng)有160多種植物成功地利用Ri質(zhì)粒進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。90年代以來，培養(yǎng)珍貴藥用植物發(fā)狀根以獲取次生代謝產(chǎn)物成為研究熱點(diǎn)。由于發(fā)狀根能夠合成其他培養(yǎng)細(xì)胞或組織難于合成的植物次生代謝物，人們已將發(fā)狀根培養(yǎng)系統(tǒng)用于藥用植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的研究。周立剛對(duì)露水草誘導(dǎo)發(fā)狀根并獲得發(fā)狀根培養(yǎng)物，這是發(fā)狀根誘導(dǎo)在單子葉植物中的一個(gè)成功先例(植物研究，1996，18(3):336)。據(jù)報(bào)道，目前利用發(fā)狀根農(nóng)桿菌浸染獲得轉(zhuǎn)化植株或發(fā)狀根的植物，主要集中在雙子葉植物30余科40個(gè)屬中(植物生理學(xué)通訊，2004(6):29)。迄今為止，利用發(fā)狀根農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化已在多種植物中取得成功。如康乃馨(DianthuscaryophyllusL.)、長(zhǎng)春(CatharanthusroseusU、矮牽牛(Petunia)、金魚草(Antirrhi皿mmajusL)、亞美尼亞壺花(Muscariarmeniac咖)等的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)已經(jīng)建立并(或)獲得了其轉(zhuǎn)化再生植株(BioTechnology,1986，4:5330536)。目前，除利用發(fā)狀根來生產(chǎn)藥用植物的次生代謝物外，更多的研究集中在進(jìn)行次生代謝物的生物轉(zhuǎn)化和生產(chǎn)有價(jià)值的物質(zhì)等。這一技術(shù)必將成為次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的可靠有效途徑，是大規(guī)模生產(chǎn)有用蛋白的重要途徑之一(農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2007，27(3):31)。盡管用培養(yǎng)發(fā)狀根生產(chǎn)藥物還有許多困難，但可以預(yù)見，隨著發(fā)狀根基礎(chǔ)研究工作的深入和代謝工程的應(yīng)用及培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，用發(fā)狀根生產(chǎn)藥物的時(shí)代即將來臨，并最終可能導(dǎo)致傳統(tǒng)的植物藥生產(chǎn)方式發(fā)生重大的變革，為人類的醫(yī)藥保健事業(yè)提供取之不盡、用之不竭的資源。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種融合基因片段rolB-FGFs，它是由rolB基因和根據(jù)植物密碼子的偏好性設(shè)計(jì)的FGFs基因組成；其堿基序列如SEQIDNO.8(rolB-FGFl)或SEQIDNO:9(rolB-FGF2)或SEQIDN0.10(rolB-FGF7)所示。本發(fā)明第二個(gè)目的是提供無抗生素標(biāo)記的植物分泌型雙元表達(dá)載體，包含無抗生素標(biāo)記的P頂基因、分泌型表達(dá)的信號(hào)肽基因SEAP和上述融合基因片段rolB-FGFs的4pCAMBIA1390，表達(dá)載體名稱pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs。本發(fā)明第三個(gè)目的是提供一種發(fā)根農(nóng)桿菌，它轉(zhuǎn)化了無抗生素標(biāo)記的植物分泌型雙元表達(dá)載體pCAMBIA1390-PM-SEAP-rolB-FGFs。本發(fā)明第四個(gè)目的是提供含有FGFs植物發(fā)狀根，它是下述方法生產(chǎn)的1)人工設(shè)計(jì)合成下述引物Rl:GAATTCTTGAAGGAAAACTCTCCACCR2:TTCTTGTAGTTAGCCATTTGTAGTCGFpl:CTTGTAGTTAGCCATGTAGTCGCAFp2:GGAAGATCTTTAATCAGAAGAAACTGGCAATGG2)以發(fā)根農(nóng)桿菌A4中的Ri質(zhì)粒為模板，用引物Rl、R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得rolB基因；以質(zhì)粒PUC-FGFs為模板，用引物Fpl、Fp2，經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得FGFs基因；3)以獲得的rolB基因和FGFs基因?yàn)槟０?，利用引物Rl和Fp2，通過PCR搭橋法，將rolB基因與FGFs基因進(jìn)行融合，獲得融合基因rolB-FGFs;4)SEAP信號(hào)肽分泌表達(dá)載體的構(gòu)建，人工合成SEAP信號(hào)肽基因，兩端引入kpnI、NcoI和BstB1、EcoRI酶切位點(diǎn)，與經(jīng)kpnI和EcoRI雙酶切的pCAMBIA1390-PIM載體進(jìn)行連接；5)將融合基因rolB-FGFs和經(jīng)EcoRI和BglII雙酶切，rolB-FGFs融合基因片段與pCAMBIA1390-PIM-SEAP經(jīng)EcoRI和BglII雙酶切后的載體大片段進(jìn)行連接，構(gòu)建重組的無選擇標(biāo)記的植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs;6)無抗生素標(biāo)記的植物分泌型雙元表達(dá)載體pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌A4中，活化含有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs質(zhì)粒發(fā)根農(nóng)桿菌A4;7)含有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs質(zhì)粒發(fā)根農(nóng)桿菌感染植物，培養(yǎng)發(fā)狀根；所述的植物為雙子葉；8)獲得的含有FGFs的發(fā)狀根進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。所述的植物優(yōu)選人參、西洋參或丹參。用步驟8)植物發(fā)狀根及其培養(yǎng)液，分離純化，生產(chǎn)FGFs。所述的FGFs為FGF1，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示或FGF2，其氨基酸序列如SEQIDNO.5所示或FGF7，其氨基酸序列如SEQIDNO.7所示；所述的rolB基因，其堿基序列如SEQIDNO.1所示；所述的植物密碼子的偏好性設(shè)計(jì)的FGFs基因?yàn)镕GFl，其堿基序列如SEQIDNO.2所示，或FGF2，其堿基序列如SEQIDNO.4所示，或FGF7，其堿基序列如SEQIDNO.6所示；本發(fā)明一種融合基因片段rolB-FGFs，它是由rolB基因和根據(jù)植物密碼子的偏好性設(shè)計(jì)的FGFs基因組成；引入無抗生素標(biāo)記的PM基因、人分泌型堿性磷酸酶信號(hào)肽(SEAP)基因，構(gòu)建了無抗生素標(biāo)記的植物分泌型雙元表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至發(fā)根農(nóng)桿菌中，以植物作為宿主，采用發(fā)狀根系統(tǒng)來表達(dá)FGFs，從發(fā)狀根和培養(yǎng)液中分別純化出具有活注的FGFs，可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)FGFs，提高了發(fā)狀根誘導(dǎo)率、蛋白表達(dá)量、產(chǎn)率和穩(wěn)定性，無抗生素標(biāo)記，保護(hù)了環(huán)境；采用人參作為宿主生產(chǎn)的含F(xiàn)GFs人參發(fā)狀根，具有人參和FGFs雙重的藥理作用，是一種較佳保健品及藥品，用于功能性食品和藥品的開發(fā)與應(yīng)用具有廣闊的前景。圖1是農(nóng)桿堿型發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒物理結(jié)構(gòu)圖圖2是含有FGFs的發(fā)狀根培養(yǎng)圖圖3是含有FGFs的發(fā)狀根鑒定圖圖4是FGFs家族部分基因的western檢測(cè)圖具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:無抗生素標(biāo)記的植物分泌型表達(dá)載體pCAMBIA1390-PMI-SEAP的構(gòu)建(1)SEAP信號(hào)肽寡核苷酸鏈的退火對(duì)人工合成的SEAP信號(hào)肽基因序列(北京三博遠(yuǎn)志生物有限公司合成)進(jìn)行了必要的修飾，即在SEAP信號(hào)肽基因編碼序列正鏈和負(fù)鏈的5'和3'端分別加入了有利于后繼序列連接的kpnI、NcoI和BstB1、EcoRI酶切位點(diǎn)。正鏈ATCACTGTCAGACTAGTT-3'負(fù)鏈GCATGCATGGTCCCAA-3'分別將合成的兩條寡核苷酸鏈溶解于TE，使其終濃度為25ymol/L。退火反應(yīng)體系正鏈2.0ill負(fù)鏈2.0illNaCl(0.5mol/L)6.0ii1滅菌超純水加至終體積30ii185。C水浴3min，自然冷卻至室溫。(2)SEAP信號(hào)肽基因片段與載體的連接退火后的SEAP信號(hào)肽基因片段5'和3'端，分別有能與kpnI和EcoRI酶切位點(diǎn)，用kpnI和EcoRI雙酶切載體pCAMBIA1390-PIM，酶切后的載體大片段用瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒回收，并用堿性磷酸酶去磷酸化，瓊脂糖凝膠電泳定量后，16t:連接過夜。連接反應(yīng)體系如下退火后的SEAP信號(hào)肽DNAO.10.3pmol去磷酸化的載體pCAMBIA1390-PM0.03pmol10X連接緩沖液lylT4DNA連接酶1ii1滅菌超純水加至終體積10ill(3)重組載體轉(zhuǎn)化①取一份凍存的感受態(tài)細(xì)胞冰上融化，加入上述步驟的連接產(chǎn)物，輕輕混勻。②冰浴30min。③將反應(yīng)管放入預(yù)熱至42t:的循環(huán)水浴中，放置90s，不要搖動(dòng)。④快速取出反應(yīng)管并移置冰上12min。6⑤加入8001YEB培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫至37°C，然后將管轉(zhuǎn)移到37。C搖床中，振蕩培養(yǎng)(220rpm)lh。取200ii1已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含Kan(100yg/ml)的YEB瓊脂平板上，37t:培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)1216h。實(shí)施例2:無抗生素標(biāo)記的植物分泌型雙元表達(dá)載體pCAMBIA1390-PM-SEAP-rolB-FGFs的構(gòu)建在Genebank中查到rolB基因cDNA序列，利用在線軟件Primer5.0和DNAStar設(shè)計(jì)引物，在上游引物R1中引入了EcoRI酶切位點(diǎn)，下游引物R2含有FGFs基因5'端的部分堿基；人工合成引物(由北京遠(yuǎn)志生物公司合成)Rl:GAATTCTTGAAGGAAAACTCTCCACCR2:TTCTTGTAGTTAGCCATTTGTAGTCG以發(fā)根農(nóng)桿菌A4中的Ri質(zhì)粒(由中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春左家特產(chǎn)研究所提供)為模板，經(jīng)過PCR反應(yīng)擴(kuò)增出rolB基因的全長(zhǎng)序列，PCR反應(yīng)條件和體系如下(表1、表2):表1表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>以FGFs的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，上游引物Fpl含有rolB基因3'端的部分堿基，下游引物Fp2含有BglII酶切位點(diǎn)，人工合成引物(由北京遠(yuǎn)志生物公司合成)Fpl:CTTGTAGTTAGCCATGTAGTCGCAFp2:GGAAGATCTTTAATCAGAAGAAACTGGCAATGG以質(zhì)粒PUC-FGFs(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存，PUC空載體購(gòu)自寶泰克公司)為模板，建立PCR反應(yīng)體系(表3、表4)，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得FGFs基因；表3PCR反應(yīng)體系50ul為Fpl弓l物~~0.5ulFp2引物0.5"1PUC19-FGFslulPrimestarDNA聚合酶0.5y1dNTP4y12Xbuffer25ulddH2018.5表4PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94°C4min變性94。C30sec退火55°C30sec延伸72°C42sec后延伸72°C5min循環(huán)數(shù)28cycle以rolB基因和FGFs基因?yàn)槟０?，利用Rl和Fp2引物，通過PCR搭橋法，將rolB基因與FGFs基因進(jìn)行融合，獲得rolB-FGFs的融合基因，PCR反應(yīng)條件如表5、表6，將rolB-FGFs融合基因和pCAMBIA1390-PM-SEAP載體(本實(shí)驗(yàn)室保存，由東北師范大學(xué)王興智老師贈(zèng)予)經(jīng)kpnI和BglII雙酶切，將酶切后得到的rolB-FGFs融合基因片段與pCAMBIA1390-PIM-SEAP載體大片段進(jìn)行連接，構(gòu)建重組的無選擇標(biāo)記的植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1390-PM-SEAP-rolB-FGFs，見附圖2。_^__PCR反應(yīng)體系50Ul為ri引物~~nnFp2引物lylrolB0.5P1FGFs0.5u1PrimestarDNA聚合酶0.5y1dNTP4u12Xbuffer25u1ddH2017.5ulPCR反應(yīng)條件預(yù)變性94°C4min變性94°C30sec退火58°C30sec延伸72°Clmin30sec后延伸72°C5min循環(huán)數(shù)28cycle實(shí)施例3:發(fā)根農(nóng)桿菌A4介導(dǎo)人參遺傳轉(zhuǎn)化無抗性標(biāo)記的pCAMBIA1390-PM-SEAP-rolB-FGFs質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌A4:取1iilpCAMBIA1390-PM-SEAP-rolB-FGFs質(zhì)粒DNA加入到100ii1發(fā)根農(nóng)桿菌A4感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴放置5min;置于液氮中冷凍5min;迅速轉(zhuǎn)至37。C水浴鍋中溫育5min;加入lmlYEB培養(yǎng)基中，在28。C搖床上180rpm振蕩培養(yǎng)4h;取適量菌液涂于含有鏈霉素50mg/L和卡那霉素50mg/L的YEB固體培養(yǎng)基中，置于28。C培養(yǎng)24_48h，經(jīng)抗性篩選、PCR檢測(cè)和酶切檢測(cè)獲得帶有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs質(zhì)粒DNA的發(fā)根農(nóng)桿菌A4單菌落；含pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs質(zhì)粒發(fā)根農(nóng)桿菌A4的活化從平板上挑取含pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌A4單菌落，接種到5mlYEB液體培養(yǎng)基中(含卡那霉素50100mg/L，鏈霉素50100mg/L)，振蕩培養(yǎng)過夜，取100ii1菌液接種到50mlYEB液體培養(yǎng)基中(含卡那霉素50100mg/L，鏈霉素50-100mg/L)，28°C，180rpm振蕩培養(yǎng)至0D6。。=1，1200018000rpm離心10min，菌8體用YEB液體培養(yǎng)基重懸，使0D=0.10.6;人參的遺傳轉(zhuǎn)化將取生長(zhǎng)健壯的2年生的人參(PanaxginsengC.A.Mey.)根用肥皂水洗凈，70%酒精及0.1%氯化汞消毒，無菌水沖洗3次，將參根切成23mm的薄片，置于無激素的MS固體培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)12d。然后使用滴加法進(jìn)行侵染，將菌液活化至0D600=0.20.6，再將其稀釋100倍后，用注射器滴加在外植體上58滴，或使用劃刀法，待菌液活化至0D600=0.20.6，再將其稀釋5倍左右，用刀片在人參根片上輕微劃幾刀；置于無激素的MS固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)25d，25t:下暗培養(yǎng)誘導(dǎo)發(fā)根。然后轉(zhuǎn)到含有20g/L濃度的PIM和抑菌抗生素的培養(yǎng)基上進(jìn)行抑菌和篩選培養(yǎng)，待4060d后，長(zhǎng)出發(fā)狀根，將小發(fā)根切下，轉(zhuǎn)入新的液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，含有FGFs的發(fā)根見附圖2。以人參無菌苗的莖葉為外植體，先將其用0.1%的氯化汞進(jìn)行表面消毒，無菌水沖洗3次，每次2min，將葉片上下兩端邊緣切掉，莖段切成1cm左右，置于無激素的MS固體培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)12d。使其在活化好的菌液中浸泡215min，或者將菌液稀釋5倍后，用刀在莖段或葉片上輕微劃幾刀，但不要?jiǎng)澠疲糜跓o激素的MS固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)25d，25t:下暗培養(yǎng)誘導(dǎo)發(fā)根。西洋參的遺傳轉(zhuǎn)化取兩年生新鮮西洋參根，用肥皂水反復(fù)沖洗多次，放入O.1%氯化汞溶液中浸泡510min，無菌水沖洗35次。在超凈工作臺(tái)上，用接種刀將其切成23mm厚的薄片，用鑷子平放入裝有培養(yǎng)基的三角瓶中，每個(gè)三角瓶放置23個(gè)根外植體，放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，25t:預(yù)培養(yǎng)23天。與人參一樣采用滴加法或劃刀法進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化。具體方法同上。丹參的遺傳轉(zhuǎn)化將丹參種子流水沖洗24h后，用0.1%的氯化滎表面消毒5min，經(jīng)滅菌后的蒸餾水漂洗3次，播撒到滅菌后的濕濾紙上發(fā)芽。發(fā)芽后的種子移到無激素的MS固體培養(yǎng)基中，待長(zhǎng)出無菌苗后，用離體葉柄或幼莖都可以直接按上述方法誘導(dǎo)出發(fā)狀根。實(shí)施例4:含F(xiàn)GFs植物發(fā)根的鑒定轉(zhuǎn)基因FGFs發(fā)狀根的PCR鑒定提取轉(zhuǎn)基因的發(fā)狀根基因組DNA，以基因組DNA為模板，分別以FGFs、rolB的上下游引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的PCR反應(yīng)條件和體系(表7、表8)，分別擴(kuò)增出單獨(dú)的目的基因及融合后的目的基因。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>轉(zhuǎn)基因藥用植物發(fā)狀根的Southern-blot鑒定用CTAB法提取PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的發(fā)狀根基因組DNA，選用BglII酶切過夜。將酶切好的基因組樣品用0.8%瓊脂糖凝膠電泳使各片段按照分子大小依次分開，用堿變性方法處理凝膠，利用毛細(xì)轉(zhuǎn)移法將酶切片段由凝膠轉(zhuǎn)移到固相硝酸纖維素膜上。探針標(biāo)記，雜交等按照地高辛標(biāo)記試劑盒操作方法操作。FGFlSouthern-blot結(jié)果見附圖3。實(shí)施例5:轉(zhuǎn)基因發(fā)根中FGFs蛋白的檢測(cè)取lg轉(zhuǎn)基因人參發(fā)狀根，在液氮中研磨；加入蛋白提取緩沖液(PBS)0.5ml，4°C12000rpm離心5min;取上清液備用，上清液為發(fā)狀根中的可溶性總蛋白。將發(fā)狀根中的可溶性總蛋白，經(jīng)肝素親和層析、離子交換，分離純化得到FGFs純品蛋白，CM柱層析將CM、S印harose2F凝膠裝柱(5.OcmX50cm)，用23倍體積的緩沖液A平衡，將人參發(fā)狀根可溶性總蛋白緩慢上柱，流速40ml/min，繼續(xù)用緩沖液A平衡至A280接近0，用緩沖液B進(jìn)行洗脫，收集蛋白峰。將H印arinS印haroseCL-6B凝膠裝柱(5.0cmX50cm)，用23倍體積的緩沖液B平衡，將經(jīng)CM柱層析收取蛋白峰上樣。流速40ml/min，分別用含0.6、1.2、2.Omol/LNaCl的20mmol/LPBpH7.0進(jìn)行分段洗脫，收集aFGF蛋白峰，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜用抗兔的多克隆抗體進(jìn)行Western-blot雜交，表達(dá)產(chǎn)物與預(yù)期結(jié)果相符。FGF1結(jié)果見附圖4。實(shí)施例6:轉(zhuǎn)基因發(fā)根中的FGFs蛋白的活性測(cè)定用MTT法測(cè)定純化后的FGFs蛋白和野生型FGFs對(duì)Balb/c3T3細(xì)胞的促分裂活性。結(jié)果表明，純品蛋白的ED50值與野生型蛋白的ED50值相當(dāng)。實(shí)施例7:轉(zhuǎn)基因人參發(fā)根的開發(fā)應(yīng)用將含有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs質(zhì)粒的人參發(fā)狀根，凍干成粉，保存，用于功能性食品和藥品的開發(fā)與應(yīng)用。10權(quán)利要求一種融合基因片段rolB-FGFs，它是由rolB基因和根據(jù)植物密碼子的偏好性設(shè)計(jì)的FGFs基因組成。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種融合基因片段rolB-FGFs，其特征在于其堿基序列如SEQIDNO.8或9或10所示。3.無抗生素標(biāo)記的植物分泌型雙元表達(dá)載體，包含無抗生素標(biāo)記的PIM基因、分泌型表達(dá)的信號(hào)肽基因SEAP和權(quán)利要求l或2所述的一種融合基因片段rolB-FGFs的pCAMBIA1390，即pCAMBIA1390-PM-SEAP-rolB-FGFs。4.一種發(fā)根農(nóng)桿菌，它轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求3所述的無抗生素標(biāo)記的植物分泌型雙元表達(dá)載體pCAMBIA1390-PM-SEAP-rolB-FGFs。5.含有FGFs植物發(fā)狀根，它是下述方法生產(chǎn)的1)人工設(shè)計(jì)合成下述引物Rl:GAATTCTTGAAGGAAAACTCTCCACCR2:TTCTTGTAGTTAGCCATTTGTAGTCGFpl:CTTGTAGTTAGCCATGTAGTCGCAFp2:GGAAGATCTTTAATCAGAAGAAACTGGCAATGG2)以發(fā)根農(nóng)桿菌A4中的Ri質(zhì)粒為模板，用引物Rl、R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得rolB基因；以質(zhì)粒PUC-FGFs為模板，用引物Fpl、Fp2，經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得FGFs基因；3)以獲得的rolB基因和FGFs基因?yàn)槟０?，利用引物Rl和Fp2，通過PCR搭橋法，將rolB基因與FGFs基因進(jìn)行融合，獲得融合基因rolB-FGFs;4)SEAP信號(hào)肽分泌表達(dá)載體的構(gòu)建，人工合成SEAP信號(hào)肽基因，兩端引入kpnI、NcoI和BstB1、EcoRI酶切位點(diǎn)，與經(jīng)kpnI和EcoRI雙酶切的pCAMBIA1390-PIM載體進(jìn)行連接；5)將融合基因rolB-FGFs和經(jīng)EcoRI和BglII雙酶切，rolB-FGFs融合基因片段與pCAMBIA1390-PIM-SEAP經(jīng)EcoRI和BglII雙酶切后的載體大片段進(jìn)行連接，構(gòu)建重組的無抗生素標(biāo)記的植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs;6)無抗生素標(biāo)記的植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌A4中，活化含有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs質(zhì)粒發(fā)根農(nóng)桿菌A4;7)含有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs質(zhì)粒發(fā)根農(nóng)桿菌感染植物，培養(yǎng)發(fā)狀根；8)獲得的含有FGFs的發(fā)狀根進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的含有FGFs植物發(fā)狀根，其特征在于所述的植物為人參、西洋參或丹參，融合基因rolB-FGFs其堿基序列如SEQIDNO.8或9或10所示。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的含有FGFs植物發(fā)狀根，其特征在于所述的FGFs為FGF1。8.根據(jù)權(quán)利要求5、6或7所述的含有FGFs植物發(fā)狀根及其培養(yǎng)液，經(jīng)分離純化，生產(chǎn)FGFs的應(yīng)用。9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的含有FGFs植物發(fā)狀根，用于制備保健品的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種融合基因片段rolB-FGFs，它是由rolB基因和根據(jù)植物密碼子的偏好性設(shè)計(jì)的FGFs基因組成；引入無抗生素標(biāo)記的PIM基因、人分泌型堿性磷酸酶信號(hào)肽(SEAP)基因，構(gòu)建了無抗生素標(biāo)記的植物分泌型雙元表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至發(fā)根農(nóng)桿菌中，以植物作為宿主，采用發(fā)狀根系統(tǒng)來表達(dá)FGFs，從發(fā)狀根和培養(yǎng)液中分別純化出具有活泩的FGFs，可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)FGFs，提高了發(fā)狀根誘導(dǎo)率、蛋白表達(dá)量、產(chǎn)率和穩(wěn)定性，無抗生素標(biāo)記，保護(hù)了環(huán)境；采用人參作為宿主生產(chǎn)的含F(xiàn)GFs人參發(fā)狀根，具有人參和FGFs雙重的藥理作用，是一種較佳保健品及藥品，用于功能性食品和藥品的開發(fā)與應(yīng)用具有廣闊的前景。文檔編號(hào)A01H5/06GK101768597SQ20101010609公開日2010年7月7日申請(qǐng)日期2010年2月5日優(yōu)先權(quán)日2010年2月5日發(fā)明者劉秀明,李天航,李校堃,李海燕,楊晶,熊麗東,王艷芳申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)