專利名稱：猴頭菇的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食用菌的培養(yǎng)方法，具體涉及猴頭菇的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)方法，還涉 及發(fā)酵培養(yǎng)用的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
猴頭菌(Hericium erinaceus)，因子實(shí)體形狀酷似小猴子的頭而得名。又稱猴頭 菇、猴頭蘑、猥菌、對(duì)口蘑、喝巴拉(藏名)、山伏菌(日本)和熊頭苗(歐洲)。(呂作舟， 食用菌栽培學(xué)，高等教育出版社，2006年，P262)。猴頭菌是一種兼有食用和藥用價(jià)值的名 貴食用菌，猴頭菇多糖能明顯抑制胃、食管、肝、皮膚癌的生長(zhǎng)，(Mizimo，Τ. International Journal of Medicinal Mushrooms 1，1999. pl05_119.)它的主要活性成分有三種: β -D-葡聚糖，具有抗腫瘤功效；麥角固醇，是維生素D的前體物質(zhì)；Cyathane衍生物，是一 種神經(jīng)生長(zhǎng)刺激因子。(Smith 等.cancer research UK. 2002. p41_42)。猴頭菌的生產(chǎn)途徑主要有三種一、人工栽培，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單易行，成本低。其缺點(diǎn) 是栽培周期長(zhǎng)，整個(gè)生產(chǎn)周期約3個(gè)月。(張金霞，食用菌安全優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)技術(shù)，中國農(nóng)業(yè)出 版社，2004，P191-201) ；二、固體發(fā)酵，用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)猴頭菌菌絲體，以獲得次生代謝產(chǎn) 物。菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基約需30天，繼續(xù)培養(yǎng)10天左右，pH降至4左右開啟棉塞，挖出菌質(zhì)， 曬干供提取用。它的優(yōu)點(diǎn)①培養(yǎng)基簡(jiǎn)單且來源廣泛，價(jià)格便宜；②發(fā)酵過程一般不需要嚴(yán) 格的無菌操作；③培養(yǎng)過程供氧和溫度可以采用直接空氣強(qiáng)制通風(fēng)來控制；④發(fā)酵殘?jiān)?處理簡(jiǎn)單，可直接作為飼料或肥料。但其缺點(diǎn)明顯①培養(yǎng)基水分活度低，培養(yǎng)基不均勻且 不易攪拌，菌體的生長(zhǎng)、對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌都不均勻，使得發(fā)酵參數(shù)的檢 測(cè)和控制困難，也使得連續(xù)操作和自動(dòng)化很困難；②微生物呼吸和代謝所產(chǎn)生熱量的溫度 控制非常困難，因?yàn)楣腆w培養(yǎng)基的熱傳導(dǎo)性差；③由于對(duì)影響固態(tài)的因素了解不夠，培養(yǎng)方 法大多基于經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)和操作的經(jīng)驗(yàn)，與液體深層發(fā)酵相比，勞動(dòng)強(qiáng)度大，占地面積大，易污 染雜菌。三、液體深層發(fā)酵，最早報(bào)道于20世紀(jì)80年代末，研究?jī)?nèi)容包括營養(yǎng)需要、環(huán)境因 子、發(fā)酵工藝等，以獲得最佳操作條件在較短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)大量的菌絲體與代謝產(chǎn)物。優(yōu)點(diǎn) ①可以進(jìn)行工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)，通過控制最佳條件來培養(yǎng)菌絲體，生產(chǎn)工藝規(guī)范；②培養(yǎng)原料 來源廣泛，價(jià)格便宜；③通過控制發(fā)酵罐的通氣攪拌系統(tǒng)、溫度調(diào)節(jié)系統(tǒng)、PH值調(diào)節(jié)系統(tǒng)和 培養(yǎng)基補(bǔ)給系統(tǒng)等裝置，培養(yǎng)條件最佳，發(fā)酵周期短，生產(chǎn)效率高。(楊海龍等。藥用真菌深 層發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)，化學(xué)工業(yè)出版社，2009年，pl4-17，p212)，但是目前的液體深層發(fā)酵方法 (李宇偉等。猴頭菌液體培養(yǎng)產(chǎn)多糖條件優(yōu)化的研究，食用菌，2008 (3)，pl5-16)菌絲體生 物量在6g/L左右，產(chǎn)量較低，因此亟須篩選新的猴頭菌菌株以及菌絲體產(chǎn)量高的發(fā)酵培養(yǎng) 方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于解決猴頭菇生產(chǎn)方法中存在的菌絲體生物產(chǎn)量低的問題，提供一 種猴頭菇的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)方法。
本發(fā)明第二目的是提供一種猴頭菇液體深層發(fā)酵用的液體種子培養(yǎng)基。本發(fā)明第三目的是提供一種猴頭菇液體深層發(fā)酵用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明第四目的是提供一個(gè)猴頭菇菌株。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為猴頭菇的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括如下步驟(1)菌種活化按照3 5%的重量比將猴頭菇菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，在22 26°C下培養(yǎng)12 16d，得活化的猴頭菇菌種；所述的斜面培養(yǎng)基的組成成份及其含量為馬 鈴薯(取汁)180 220g/L,葡萄糖18 22g/L，瓊脂15 20g/L,其余為水；(2) 一級(jí)菌種培養(yǎng)接取活化的猴頭菇菌種，搗碎，按照3 6g/L的比例將活化的 猴頭菇菌種接種于液體種子培養(yǎng)基中，在22 26°C、轉(zhuǎn)速為120 ISOrpm條件下培養(yǎng)4 7d，得一級(jí)菌種；所述的液體種子培養(yǎng)基的組成成份及其重量比為葡萄糖1 3%、玉米 淀粉0. 01 0. 1%、麥麩0. 1 0. 5%、蛋白胨0. 1 0. 3%、酵母粉0. 2 0. 4%、KH2PO4
0.05 0. 2%,MgSO4 · 7H20 0. 01 0. 1 %、VB1 為 8 15mg/L，其余為水；(3) 二級(jí)菌種培養(yǎng)按照8 15%的體積比將步驟(2)所得一級(jí)菌種接種于液體 發(fā)酵培養(yǎng)基中，在24 28°C、壓力為0. 05MPa、通風(fēng)量為每分鐘罐容積的50 100%條件下 培養(yǎng)3 6d，得二級(jí)菌種；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成份及其含量為葡萄糖20 30g/ L,玉米淀粉0. 05 0. 2g/L，酵母粉2 4g/L，蛋白胨2 4g/L，麥麩0. 5 1. 5g/L，KH2PO4
1.Og/L，MgSO4 0. 5g/L，其余為水；(4)發(fā)酵罐放大培養(yǎng)按照8 15%的體積比將二級(jí)菌種接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基 中，在24 28°C、壓力為0. 05MPa、通風(fēng)量為每分鐘罐容積的50 100%條件下培養(yǎng)6 10d，得猴頭菇菌絲體；所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成份及其含量同步驟(3)。上述發(fā)酵培養(yǎng)方法中所述的猴頭菇菌種可以是通常生產(chǎn)上所用的猴頭菇 (Hericium erinaceus)菌種、或者所采集的里予生猴頭 (Hericium erinaceus)菌禾中。上述發(fā)酵培養(yǎng)方法中所述的猴頭菇菌種是指猴頭菌(Hericium erinaceus)中農(nóng) 猴頭1，已于2009年12月23日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保 藏編號(hào)為CGMCC 3536。上述發(fā)酵培養(yǎng)方法步驟(1)中所得的猴頭菇菌種的大小為3-5X3_5mm。上述發(fā)酵培養(yǎng)方法步驟(2)中所述的液體種子培養(yǎng)基的裝液量為罐容積的40%。上述發(fā)酵培養(yǎng)方法步驟(3)或(4)中所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的罐裝液量為罐容積 的60 80%。所述的液體種子培養(yǎng)基的制備方法，包括按照上述重量比將為葡萄糖、玉米淀粉、 麥麩、蛋白棟、酵母粉、KH2PO4, MgSO4 · 7H20和VB1加入水中，攪拌均勻，然后用水定容，再在 121°C，滅菌30min即可。所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法，包括按照上述重量比將葡萄糖、玉米淀粉、酵 母粉、蛋白棟、麥麩、KH2PO4和MgSO4 · 7H20加入水中，攪拌均勻，然后用水定容，在121°C，滅 菌30min即可。本發(fā)明所得的猴頭菇菌絲體可用于生產(chǎn)保健食品、食品添加劑、飲料等。本發(fā)明中所述的猴頭菌、猴頭菇、猴頭蘑、猥菌、對(duì)口蘑、喝巴拉(藏名)、山伏菌 (日本)和熊頭苗(歐洲)等名稱都是指猴頭菌(Hericium erinaceus)。
本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)(1)、本發(fā)明方法猴頭菌菌絲體生物產(chǎn)量高，可達(dá)12g/L，是 目前工廠發(fā)酵生產(chǎn)水平的2倍以上。(2)本發(fā)明猴頭菌菌株中農(nóng)猴頭1生長(zhǎng)速度快，可達(dá) 5. 8mm/d ； (3)本發(fā)明提供的種子和發(fā)酵培養(yǎng)基效果好，可使猴頭菇菌絲體產(chǎn)量高。


圖18個(gè)猴頭菇菌株菌絲體生物量、胞外多糖的利率、胞內(nèi)多糖含量對(duì)比柱形圖。圖2中農(nóng)猴頭1的rDNA_IGS2區(qū)域PCR擴(kuò)增片段電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1猴頭菌菌株中農(nóng)猴頭1的篩選以32個(gè)猴頭菌株(3個(gè)來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所；4個(gè)來 自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所；其它引自上海農(nóng)科院食用菌所、福建三明真菌研究所、 吉林省、江蘇省等地(具體地點(diǎn)不可知)，所述的32個(gè)猴頭菌株均為野生種)為材料，在 Difco PDA 培養(yǎng)基(一種標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，德國生產(chǎn))上25士0.1°C培養(yǎng)7天，測(cè)量菌落直徑， 菌絲生長(zhǎng)速度=菌落直徑/7d，結(jié)果(見表1)顯示由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃 研究所采自東北長(zhǎng)白山的第18號(hào)菌株生長(zhǎng)速度最快，說明它的活力比較強(qiáng)。將18號(hào)菌株 與其它7個(gè)菌株進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)，測(cè)定它們的菌絲體生物量、胞外多糖的利率、胞內(nèi)多糖 的含量等，結(jié)果(見圖1)這三項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)最優(yōu)的是第18號(hào)菌株，將18號(hào)菌株定名為 中農(nóng)猴頭1。表1猴頭菌32個(gè)菌株的菌絲生長(zhǎng)速度
權(quán)利要求
猴頭菇的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括如下步驟(1)按照3～5％的重量比將猴頭菇菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，在22～26℃下培養(yǎng)12～16d，得活化的猴頭菇菌種；所述的斜面培養(yǎng)基的組成成份及其含量為馬鈴薯180～220g的汁液/L，葡萄糖18～22g/L，瓊脂15～20g/L，其余為水；(2)接取活化的猴頭菇菌種，搗碎，按照3～6g/L的比例將活化的猴頭菇菌種接種于液體種子培養(yǎng)基中，在22～26℃、轉(zhuǎn)速為120～180rpm條件下培養(yǎng)4～7d，得一級(jí)菌種；所述的種子培養(yǎng)基的組成成份及其重量百分比為葡萄糖1～3％、玉米淀粉0.01～0.1％、麥麩0.1～0.5％、蛋白胨0.1～0.3％、酵母粉0.2～0.4％、KH2PO4 0.05～0.2％、MgSO4·7H2O 0.01～0.1％、VB1為8～15mg/L，其余為水；(3)按照8～15％的體積比將步驟(2)所得的一級(jí)菌種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在24～28℃、壓力為0.05MPa、通風(fēng)量為每分鐘罐容積的50～100％條件下培養(yǎng)3～6d，得二級(jí)菌種；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成份及其含量為葡萄糖20～30g/L，玉米淀粉0.05～0.2g/L，酵母粉2～4g/L，蛋白胨2～4g/L，麥麩0.5～1.5g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO40.5g/L，其余為水；(4)按照8～15％的體積比將二級(jí)菌種接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在24～28℃、壓力為0.05MPa、通風(fēng)量為每分鐘罐容積的50～100％條件下培養(yǎng)6～10d，可得猴頭菇菌絲體。
2.按照權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于其步驟(1)中所述的猴頭菇菌種 的大小為3-5X3-5mm。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于其步驟(2)中所述的液體種 子培養(yǎng)基裝液量為罐容積的40%。
4.按照權(quán)利要求3所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于其步驟(3)或(4)中所述的液體 發(fā)酵培養(yǎng)基的罐裝液量為罐容積的60 80%。
5.一種猴頭菇(Hericium erinaceus)菌株中農(nóng)猴頭1，已于2009年12月23日在中 國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC 3536。
6.一種猴頭菇的液體種子培養(yǎng)基，其特征在于其組成成份及其重量比為葡萄糖1 3%、玉米淀粉0. 01 0. 1%、麥麩0. 1 0. 5%、蛋白胨0. 1 0. 3%、酵母粉0. 2 0. 4%, KH2PO4 0. 05 0. 2%,MgSO4 · 7H20 0. 01 0. 1 %、VB1 為 8 15mg/L，其余為水。
7.一種猴頭菇的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于其組成成份及其含量為葡萄糖20 30g/L，玉米淀粉0. 05 0. 2g/L，酵母粉2 4g/L，蛋白胨2 4g/L，麥麩0. 5 1. 5g/L， KH2PO4L Og/L, MgSO4O. 5g/L，其余為水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種猴頭菇的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)方法，屬于食用菌的培養(yǎng)方法領(lǐng)域。本發(fā)明培養(yǎng)方法是將猴頭菇菌種在斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，然后在液體種子培養(yǎng)基上進(jìn)行一級(jí)菌種培養(yǎng)，再在液體發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行二級(jí)菌種培養(yǎng)，最后在液體發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，可得猴頭菇菌絲體。本發(fā)明還公開了一個(gè)猴頭菌菌種中農(nóng)猴頭1，以及用于猴頭菇培養(yǎng)的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明培養(yǎng)方法所得的猴頭菌菌絲體生物產(chǎn)量高，可達(dá)12g/L，是目前工廠發(fā)酵生產(chǎn)水平的2倍以上；其次本發(fā)明猴頭菌菌株中農(nóng)猴頭1生長(zhǎng)速度快，可達(dá)5.8mm/d；此外，本發(fā)明的液體種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)效果好，使猴頭菇菌絲體生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高。
文檔編號(hào)C05G1/00GK101971762SQ20101010962
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月9日
發(fā)明者張金霞, 陳強(qiáng), 高巍, 黃晨陽 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所