專利名稱：大紅菇菌株的篩選及菌種制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬微生物技術領域，具體涉及大紅菇的菌株篩選及菌種制備方法。
背景技術：
大紅菇(Russula alutacea)是世界著名的名貴野生食用菌。大紅菇還不能人工
栽培，市場上的大紅菇均來自野生。近年來野生大紅菇由于過度采集和采集方式不科學以
及無相應的技術措施，造成自然產(chǎn)量大幅下降。研究表明，在產(chǎn)區(qū)自然環(huán)境條件下，采用人
工菌種和配套的技術措施，是解決大紅菇供需矛盾的最經(jīng)濟有效的途徑之一。 在大紅菇保護擴繁技術中，優(yōu)良菌種的獲得是關鍵技術環(huán)節(jié)。大紅菇菌株的獲得
通常是利用子實體或孢子進行分離、純化，直接應用于大紅菇的菌絲體生產(chǎn)。現(xiàn)有技術的不
足在于大紅菇菌種不能用出菇的方法進行菌種鑒定，只能根據(jù)菌絲形態(tài)及分離物來初步確
定是否為大紅菇純培養(yǎng)物；生產(chǎn)的菌種一般用固體菌種。目前在國內(nèi)采用液體菌種進行大
紅菇資源的保護擴繁應用不廣泛。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的就是克服現(xiàn)有技術不足，利用云南原產(chǎn)地大紅菇子實體篩選出 優(yōu)良菌株，采用生物技術進行菌種鑒定，制備大紅菇液體及固體優(yōu)良菌種，為大紅菇野生資 源保護擴繁提供優(yōu)良菌種。 本發(fā)明采用的真菌是大紅菇(Russula alutacea);保藏單位中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京.中關村；保藏日期2009年12月15日； 保藏登記入冊的編號CGMCC NO. 3525。 大紅菇子實體中等大，菌蓋6 16cm，扁半球形，后平展，中部下凹，濕時粘，不久 干燥，深紅色，鮮或暗紫紅色，邊緣平滑或有不明顯條紋。菌肉白色。菌褶等長或幾乎等長， 褶間有橫脈，直生或近延生，初乳白色，后淡赭黃色，褶前緣常常帶紅色。菌柄近圓形，長 3 12cm，粗1 3. 5cm，白色，上部或側面常帶紅色，或全部粉紅色而向下漸淡。孢子印黃 色。 本發(fā)明的技術方案 ①采集野生大紅菇子實體； ②組織分離或孢子分離； ③純化菌株及菌株鑒定； ④生物學特性比較及生產(chǎn)性狀比較； ⑤確定優(yōu)良菌株； ⑥菌種生產(chǎn)及菌種應用； 經(jīng)過篩選，獲得菌絲體產(chǎn)量高、抗污染的大紅菇液體菌種專用菌株菌苑_8。 本發(fā)明真菌(Russula alutacea)培養(yǎng)方法(以下為重量百分比) 菌種分離純化培養(yǎng)基2%大紅菇下腳料、0. 001% V『2X葡萄糖、2X瓊脂；
大紅菇菌株分離及鑒定方法 1、將大紅菇子實體組織塊或孢子液接種到上述試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，于 18-24t:下培養(yǎng)10-15天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選 出無污染、長勢良好的菌株，獲得大紅菇分離試管種。 2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進行菌種純化，2 天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于18-2fC下培養(yǎng)10-15天，獲得大紅菇純化試管 種。 3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴 增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的大紅菇(Russula alutacea) Identities = 499/510(97% )， Gaps = 2/510(0% )，分析確定分離得到的純培 養(yǎng)物為大紅菇菌絲體。 本發(fā)明大紅菇菌種的制備方法分為液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩種。
液體菌種制備方法 液體培養(yǎng)基配方為5_10%麩皮、0. 5-1%麥芽糖、1_2%可溶性淀粉，余下為水，pH 自然。 1、將大紅菇的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基， 于18-24t:下培養(yǎng)10-15天，獲得試管菌種。 2、將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為前 述液體培養(yǎng)基配方，于20-26t:下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120-160r/min，培養(yǎng)時間5_7天。
3、將搖瓶菌種接種到25L自動發(fā)酵生產(chǎn)線的發(fā)酵罐中，通氣量為1 : 0. 8v/ (v min);攪拌轉(zhuǎn)速為120-160r/min ;接種量為5-10% ;罐壓0. 04Mpa ;pH為6. 0 ;溫度為 22-26°C ;通氣培養(yǎng)72-96小時，獲得大紅菇液體菌種。
固體菌種制備方法 固體培養(yǎng)基配方為木屑55-70%、棉籽殼20%、麩皮5-20%、磷肥1%、石膏1%、 大紅菇生長地腐殖土3X，含水量60X、pH自然。 1、將大紅菇的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基， 于18-24t:下培養(yǎng)10-15天，獲得試管菌種。 2、將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為前 述液體培養(yǎng)基配方，于20-26t:下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120-160r/min，培養(yǎng)時間5_7天。
3、采用前述固體培養(yǎng)基配方。將培養(yǎng)料混合后，加水拌均勻后，裝入750ml的大口 瓶中，壓緊封口后在12(TC滅菌60分鐘，接入液體菌種，于22-26 t:培養(yǎng)30-40天，直到菌絲 長滿。
具體實施例方式 實施例一 1、將大紅菇子實體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于22C下培養(yǎng) 15天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好 的菌株，獲得大紅菇分離試管種。 2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于22C下培養(yǎng)15天，獲得大紅菇純化試管種。
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴 增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的大紅菇(Russula alutacea) Identities = 499/510(97% )， Gaps = 2/510(0% )，分析確定分離得到的純培 養(yǎng)物為大紅菇菌絲體。 4、將大紅菇(Russula alutacea)菌苑_8的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面 上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，22t:下培養(yǎng)15天，獲得試管種。 5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為
馬鈴薯20%、葡萄糖2%、蛋白胨0. 2%、磷酸二氫鉀0. 05%、硫酸鎂0. 05%，余下為水，ffl
自然。于2(TC下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120rpm，培養(yǎng)時間7天，獲得一級液體菌種。 將一級液體菌種接種到25L自動發(fā)酵生產(chǎn)線的發(fā)酵罐中，通氣量為1 : 0.8v/
(v 'min);攪拌轉(zhuǎn)速為120r/min ;接種量為5% ;罐壓0. 04Mpa ;pH為6. 0 ;溫度為22°C ;通
氣培養(yǎng)96小時，獲得大紅菇液體菌種。 實施例二 菌種制備的步驟與實施例一相同。 1、將大紅菇子實體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于25t:下培養(yǎng) 10天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好 的菌株，獲得大紅菇分離試管種。 2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進行菌種純化，2 天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于25t:下培養(yǎng)IO天，獲得大紅菇純化試管種。
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴 增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的大紅菇(Russula alutacea) Identities = 499/510(97% )， Gaps = 2/510(0% )，分析確定分離得到的純培 養(yǎng)物為大紅菇菌絲體。 4、將大紅菇菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基， 22t:下培養(yǎng)6天，獲得試管種。 5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為 6%麩皮、0.6%麥芽糖、1.2%可溶性淀粉，余下為水，pH自然。于22t:下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為 140rpm，培養(yǎng)時間7天，獲得一級液體菌種。 將一級液體菌種接種到25L自動發(fā)酵生產(chǎn)線的發(fā)酵罐中，通氣量為1 : 0.8v/ (v 'min);攪拌轉(zhuǎn)速為140r/min ;接種量為8% ;罐壓0. 04Mpa ;pH為6. 0 ;溫度為24°C ;通 氣培養(yǎng)84小時，獲得大紅菇液體菌種。
實施例三 1、將大紅菇子實體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于25t:下培養(yǎng) 6天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的 菌株，獲得大紅菇分離試管種。 2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進行菌種純化，2 天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于25t:下培養(yǎng)6天，獲得大紅菇純化試管種。
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的大紅菇(Russula alutacea) Identities = 499/510(97% )， Gaps = 2/510(0% )，分析確定分離得到的純培 養(yǎng)物為大紅菇菌絲體。 4、將大紅菇菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基， 25t:下培養(yǎng)5天，獲得試管種。 5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為 10%麩皮、0.5%麥芽糖、1%可溶性淀粉，余下為水，pH自然。于26t:下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為 160rpm，培養(yǎng)時間6天，獲得一級液體菌種。 將一級液體菌種接種到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為雜木屑78%、麩皮20%、蔗 糖1%、石膏1%、含水量60%、^1自然。將木屑、麩皮、磷肥、石膏、腐殖土按比例稱量后混 合均勻，加水拌勻后裝入750ml的菌種瓶中，每瓶裝500ml， 12(TC滅菌60分鐘后，接種后置 于26t:培養(yǎng)30天，獲得大紅菇固體菌種。
實施例四 1、將大紅菇子實體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于2fC下培養(yǎng) 5天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的 菌株，獲得大紅菇分離試管種。 2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進行菌種純化，2 天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于2fC下培養(yǎng)5天，獲得大紅菇純化試管種。
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴 增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的大紅菇(Russula alutacea) Identities = 499/510(97% )， Gaps = 2/510(0% )，分析確定分離得到的純培 養(yǎng)物為大紅菇菌絲體。 4、將大紅菇菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基， 24t:下培養(yǎng)5天，獲得試管種。 5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方 為8%麩皮、1%麥芽糖、1%可溶性淀粉，余下為水，pH自然。于26t:下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為 160rpm，培養(yǎng)時間5天，獲得一級液體菌種。 將一級液體菌種接種到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為棉籽殼35%、木屑45%、麩 皮18X、蔗糖1X、石膏1X，含水量60X、PH自然。將木屑、麩皮、磷肥、石膏、腐殖土按比例 稱量后混合均勻，加水拌勻后裝入750ml的菌種瓶中，每瓶裝500ml， 12(TC滅菌60分鐘后， 接種后置于2(TC培養(yǎng)40天，獲得大紅菇固體菌種。
權利要求
一種大紅菇菌株，其特征在于所述菌株為大紅菇(Russula alutacea)菌苑-8該菌株的保藏號為CGMCC NO.3525。
2. 根據(jù)權利要求1所述的大紅菇(Russula alutacea)菌苑_8及制備方法，所述菌株是經(jīng)過固體或液體培養(yǎng)獲得的，其特征在于所述固體培養(yǎng)基配方和液體培養(yǎng)基配方如下(1) 固體培養(yǎng)基配方為①雜木屑78% 、麩皮20% 、蔗糖1 % 、石膏1 % 、含水量60% 、PH自然；@棉籽殼35%、木屑45%、麩皮18%、蔗糖1%、石膏1X，含水量60X、PH自然；(2) 液體培養(yǎng)基配方為馬鈴薯20 % 、葡萄糖2 % 、蛋白胨0. 2 % 、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂O. 05X，余下為水，PH自然。
全文摘要
本發(fā)明涉及大紅菇菌株的篩選及菌種制備方法，屬于微生物技術領域。本發(fā)明采用的真菌是大紅菇(Russula alutacea)；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏日期2009年12月15日；保藏登記入冊的編號CGMCC NO.3525。利用該菌株制備的液體和固體優(yōu)良菌種，應用于大紅菇的促繁有著顯著的社會、經(jīng)濟效益和廣闊的應用前景。
文檔編號C05G3/00GK101790937SQ20101011587
公開日2010年8月4日 申請日期2010年3月2日 優(yōu)先權日2010年3月2日
發(fā)明者劉蓓, 張微思, 羅孝坤, 郭永紅, 郭相 申請人:中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所