專利名稱：一種韌皮部特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基因啟動(dòng)子的組織特異性表達(dá)，尤 其涉及一種韌皮部特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
維管束是植物有關(guān)運(yùn)輸水份和內(nèi)部物質(zhì)以及細(xì)胞增殖的重要場(chǎng)所，韌皮部和木質(zhì) 部是維管束的組成部分。韌皮部(phloem)是植物體內(nèi)重要的具輸導(dǎo)功能的一種復(fù)合組織，它不僅僅涉及 運(yùn)輸養(yǎng)料(有機(jī)氮、無(wú)機(jī)鹽、碳水化合物等)，還包括種類繁多的mRNA、蛋白質(zhì)和其它大分 子、信號(hào)分子等在植物體內(nèi)的遠(yuǎn)距離運(yùn)輸，因而韌皮部的功能涉及到養(yǎng)料分配、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、 系統(tǒng)防御等等。關(guān)于韌皮部特異啟動(dòng)子的克隆研究已有報(bào)道，主要是來(lái)自維管束植物、植物病毒 和植物病原菌等。如擬南芥蔗糖_H+AtSUC2基因?qū)Ｒ辉诠夂铣扇~片韌皮部的伴胞中表達(dá) (Stadler&Sauer，BotActa，109 :299-306，1996 ;Stadler et al. , Plant J，41:319-33， 2005)。AtSUC2啟動(dòng)子和GFP融合研究表明在伴胞中產(chǎn)生的GFP蛋白可以通過(guò)胞間連絲進(jìn) 入相鄰的篩管分子并在韌皮部?jī)?nèi)遷移(Imlau et al. ,PlantCell, 11 :309_322，1999)。南瓜 韌皮部特異啟動(dòng)子dENP驅(qū)動(dòng)的外源基因在馬鈴薯的韌皮部特異而高效表達(dá)(Tian et al., Journal of AgriculaualBiotechnology,4(4) :555 558,2006)。蚜蟲(chóng)等刺吸式昆蟲(chóng)以取食植物韌皮部汁液為生，不少病毒亦通過(guò)韌皮部進(jìn)行感 染，對(duì)農(nóng)作物造成了巨大的損害。目前，利用基因工程技術(shù)把一些外源基因如抗蟲(chóng)基因?qū)?到植物中已獲得了很大的成功，然而，目前在轉(zhuǎn)基因植物中驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子主要還是組成型表達(dá)的啟 動(dòng)子，如CaMV35S，Ubiquitin等。這些啟動(dòng)子使得外源基因在植物體各個(gè)部位平均表達(dá)，不 能專一地在某些昆蟲(chóng)或病原菌等侵害的組織器官表達(dá)。而在非侵害部位表達(dá)對(duì)植物本身是 一種額外負(fù)擔(dān)和能源及養(yǎng)分的浪費(fèi)。GLPs是一類與小麥萌發(fā)素(Germin)結(jié)構(gòu)類似、位于胞外基質(zhì)的可溶性糖蛋白，屬 于cupins (小桶)蛋白家族，它們幾乎存在于所有的被子植物(包括禾本科植物)、裸子植 物和苔蘚中。通過(guò)分析GLPs家族成員之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系，可以把GLPs分為5個(gè)主要的 亞家族。GLPs的功能主要?dú)w納為以下三點(diǎn)酶(0X0、S0D、ADPPaSe)，結(jié)構(gòu)蛋白和受體。GLPs 在植物不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段如花期誘導(dǎo)、胚胎發(fā)生、次生木質(zhì)部的形成過(guò)程中都會(huì)表達(dá)并 表現(xiàn)出重要的生物學(xué)功能，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)，隨著對(duì)GLPs研究的不斷 深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到它不僅調(diào)節(jié)了植物特定的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，同時(shí)也參與植物對(duì)生物及 非生物脅迫的抗性反應(yīng)，具有十分重要的生物學(xué)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可使得外源基因在韌皮組織中特異、高效表達(dá)的韌皮部特異性啟動(dòng)子。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供含有上述韌皮部特異性啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供由上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌制備而得的重 組微生物。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述韌皮部特異性啟動(dòng)子在植物生長(zhǎng)或植物抗病 育種中的應(yīng)用。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下方案予以實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明人首次分離克隆得到一種類萌發(fā)素基因啟動(dòng)子，將該啟動(dòng)子克隆到雙元載 體中并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，接著由農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株的Ttl 和T1代進(jìn)行組織化學(xué)染色以及石蠟切片分析，結(jié)果表明本發(fā)明的類萌發(fā)素基因啟動(dòng)子能夠 驅(qū)使GUS報(bào)告基因在韌皮部專一性表達(dá)，由此說(shuō)明本發(fā)明得到一種韌皮部特異性啟動(dòng)子， 其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，并命名為AtGLP15。將本發(fā)明的韌皮部特異性啟動(dòng)子與外源目的基因連接后，插入雙元載體中構(gòu)建重 組表達(dá)載體，將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入植物或者植物細(xì)胞中，則可實(shí)現(xiàn)外源目的基因在韌 皮部的特異性表達(dá)。上述雙元載體可以為任意一種本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的植物雙元載體，如ρΒΙΙΟΙ， pBI121 等。上述外源目的基因可以來(lái)自同源植物，外源植物、真菌、藻類、細(xì)菌、病毒或動(dòng)物基 因，也可以是人工設(shè)計(jì)、合成的DNA序列。這些序列可以是一段編碼有功能的蛋白質(zhì)或其一 部分的正義序列或一段反義序列。上述將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞，所用的轉(zhuǎn)化方法可以為任何一種適合 于植物或植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法，如使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染法，電擊法，基因槍轟擊法，花粉管 導(dǎo)入法，細(xì)胞和原生質(zhì)體顯微注射法等。被轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在適合的條件下就可再生成完整 的轉(zhuǎn)基因植株。上述欲轉(zhuǎn)化的植物可以是完整的植物、植物器官(例如葉、花瓣、莖、根或種子) 或植物組織(例如表皮、韌皮部、薄壁組織或木質(zhì)部)，所述欲轉(zhuǎn)化的植物或者植物細(xì)胞，其 RNA聚合酶要能與本發(fā)明的韌皮部特異性啟動(dòng)子序列相結(jié)合。本發(fā)明的韌皮部特異性啟動(dòng)子的核苷酸序列的全部或者部分片段，與外源目的基 因編碼區(qū)的核苷酸序列相融合產(chǎn)生雜合基因構(gòu)建體，所述雜合基因構(gòu)建體的制備，可采用 本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常用方法，如可將韌皮部特異性啟動(dòng)子的序列連接在目的基因編 碼區(qū)的核苷酸序列的5’端或“上游區(qū)”。本發(fā)明所述的“目的基因編碼區(qū)的核苷酸序列”是指任何能在mRNA水平表達(dá)的核 苷酸序列。所表達(dá)的mRNA可以被翻譯成蛋白或不被翻譯成蛋白。本發(fā)明的韌皮部特異性啟動(dòng) 子，其核苷酸序列與現(xiàn)有的植物啟動(dòng)子(如PIN2啟動(dòng) 子或者dENP啟動(dòng)子等)都不具有同源性，而且本發(fā)明的韌皮部特異性啟動(dòng)子不是組成型表 達(dá)的啟動(dòng)子，而是在植物的韌皮部專一性表達(dá)。因此，利用本發(fā)明的韌皮部特異性啟動(dòng)子可 以使得有助于植物發(fā)育生長(zhǎng)的基因，或者抗蟲(chóng)、抗病基因在韌皮組織中特異、高效表達(dá)，能 夠更有效、更經(jīng)濟(jì)的發(fā)揮目的基因的作用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
1.維管束是植物有關(guān)運(yùn)輸水份和內(nèi)部物質(zhì)以及細(xì)胞增殖的重要場(chǎng)所，同時(shí)也是導(dǎo) 致植物全株感染的遷移位置，本發(fā)明提供的韌皮部特異性啟動(dòng)子，可將參與運(yùn)輸水份或內(nèi) 部物質(zhì)或細(xì)胞增殖的基因?qū)胫参?，并在維管束中特異性表達(dá)，從而使得植物調(diào)節(jié)水份或 內(nèi)部物質(zhì)的運(yùn)輸或細(xì)胞增殖；
2.維管束是感染茄科植物的枯萎病真菌增殖和轉(zhuǎn)移的位置，當(dāng)植物病毒感染植物 時(shí)，植物病毒遷移長(zhǎng)距離，從一片葉子移至其上面的葉子，因此，維管束也是導(dǎo)致植物全株 感染的遷移位置。本發(fā)明提供的韌皮部特異性啟動(dòng)子將參與真菌或植物病毒增殖或遷移的 基因?qū)胫参?，并在維管束中特異性表達(dá)，使得植物得到保護(hù)植物而免于真菌或植物病毒 的感染；3.本發(fā)明的韌皮部特異性基因，能夠使得外源目的基因在韌皮部專一性的表達(dá)， 從而針對(duì)性的防治從韌皮部入侵的害蟲(chóng)和病原微生物的危害，降低對(duì)害蟲(chóng)及病原微生物的 選擇壓以及由此可能對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的副作用，減輕由于表達(dá)抗蟲(chóng)、抗病基因而給轉(zhuǎn)基因植物 帶來(lái)的代謝負(fù)擔(dān)等方面產(chǎn)生積極作用。另外，在雙價(jià)或多價(jià)抗蟲(chóng)、抗病基因工程中使用與組 成型啟動(dòng)子不同的韌皮部組織特異性啟動(dòng)子可以避免啟動(dòng)子之間同源序列的相互作用而 導(dǎo)致基因沉默。


圖1為韌皮部特異性啟動(dòng)子的PCR電泳結(jié)果圖；圖2為韌皮部特異性啟動(dòng)子融合⑶S基因載體ρΒΙΙΟΙ的構(gòu)建流程圖；圖3為韌皮部特異性啟動(dòng)子的酶切鑒定圖；圖4為AtGLP15基因啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的組織化學(xué)定位圖；圖5為AtGLP15基因啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的石蠟切片圖；圖6為韌皮部特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的組織化學(xué)定位 和石蠟切片圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地描述，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任 何限定。實(shí)施例1韌皮部特異性啟動(dòng)子的獲得1.擬南芥的培養(yǎng)擬南芥種子放在1. 5ml離心管中，先用75%酒精消毒1 2min，再用的次氯 酸鈉消毒3 5min，無(wú)菌水沖洗5次后，用槍頭點(diǎn)播在滅菌的MS固體培養(yǎng)基(1. 5%蔗糖， 0.8%瓊脂，pH 5.8)上，避光，4°C春化2d后，，轉(zhuǎn)到光照培養(yǎng)間，溫度22°C/18°C (日/夜)， 16h/8h光周期，白熾燈光照培養(yǎng)。2.采用本領(lǐng)域常規(guī)的Trizol法提取擬南芥RNA。3. RT-PCR 檢測(cè)3. 1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(cDNA合成)用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考相關(guān)試劑盒說(shuō)明即可。
3· 2目的基因的RT-PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行AtGLP15啟動(dòng)子的擴(kuò)增，引物序列如下P1，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示；P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。PCR 反應(yīng)體系ddH20 15. 4 μ LUOXTaq Buffer 2 μ LUOmM dNTPmix 0· 5 μ L、 Pl(10ymol/L) 0. 4 μ L、P2 (10 μ mol/L) 0. 4 μ L、DNA 模板 1 μ L 禾口 Taq 酶(5U/μ L) 0· 3μ L。PCR 反應(yīng)程序94°C變性 2min，然后按 94°C 30s、55°C 30s、72°C 30s 進(jìn)行 30 個(gè)循 環(huán)，最后在72°C下延伸lOmin。4. PCR擴(kuò)增結(jié)果PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為760bp左右的目的條帶。將電泳中的目的片段經(jīng)過(guò)一系列本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作，如切膠回收、T載體 連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞和陽(yáng)性克隆篩選等，將最終的陽(yáng)性克隆送交測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，本實(shí)施例得到一條長(zhǎng)約762bp的序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，并命名為AtGLP15。將該序列與已發(fā)現(xiàn)的韌皮部特異性表達(dá)啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列為首次 報(bào)道。實(shí)施例2植物韌皮部特異性啟動(dòng)子(AtGLP15)雙元表達(dá)載體的構(gòu)建將實(shí)施例1制備所得韌皮部特異性啟動(dòng)子與植物表達(dá)載體PBIlOl連接，得到重組 表達(dá)載體PBAG ；用pBAG轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli DH5 α，篩選出陽(yáng)性克隆，用陽(yáng)性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化農(nóng)桿菌A. tumefaciensEHA105,從而制備得到所需植物韌皮部特異性啟動(dòng)子雙元表達(dá)載 體(命名為pBAG)，具體構(gòu)建流程圖如圖2所示。將重組表達(dá)載體pBAG提取質(zhì)粒后，用SalI和SmaI進(jìn)行雙酶切檢測(cè)，電泳結(jié)果如 圖3所示圖1中泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1、2均為雙元表達(dá)載體pBAG酶切后的產(chǎn)物。上述植物表達(dá)載體PBI101、大腸桿菌E. coli DH5 α和農(nóng)桿菌A. tumefaciens EHA105均為本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的實(shí)驗(yàn)材料，上述操作中的載體連接、大腸桿菌細(xì)胞的轉(zhuǎn) 化以及農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化均為本領(lǐng)域的常規(guī)操作。實(shí)施例3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化首先，將野生型擬南芥播種于直徑IOcm的花盆中，主莖高約3cm時(shí)去除其頂生花 序，注意避免傷害腋生花序，待腋生花序長(zhǎng)出，其下部的花開(kāi)始授粉時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化前，將 已授粉的花及果莢 去掉。然后，挑取實(shí)施例2中制備得到的雙元表達(dá)載體(陽(yáng)性單菌落) 接種于5ml含有抗生素Kan和Rif的LB液體培養(yǎng)基中，28°C搖菌過(guò)夜。將培養(yǎng)得到的菌液 倒入500ml含同樣抗生素LB液體培養(yǎng)基中，28°C搖菌過(guò)夜。將菌液倒入6個(gè)50ml離心管 中，4000g離心2min，收集菌體。用5%蔗糖轉(zhuǎn)化液懸浮菌體，然后浸泡轉(zhuǎn)化野生型擬南芥， 每組植物浸泡1. 5min。用塑料膜覆蓋轉(zhuǎn)化后的植物Id以保持濕潤(rùn)。轉(zhuǎn)化后的植株繼續(xù)在 培養(yǎng)室中生長(zhǎng)，待成熟后收集種子。將收集的種子鋪在含有50 μ g/L kan的MS平板篩選轉(zhuǎn) 基因植株。2.擬南芥的組織化學(xué)染色分析
取不同時(shí)期的擬南芥植株或組織置于⑶S染液W.2mol/LNa3P04緩沖液(內(nèi) 含 62mL 0. 2mol/L Na2HPO4 禾口 38mL 0. 2mol/LNaH2PO4, pH 7· 0)、0· lmol/L Κ3 [Fe (CN) 6], 0. lmol/L Κ4 [Fe (CN) 6] 3Η20、1. Omol/L Na2EPTA 禾口 0. 1 % (ff/V) 5-溴-4 氯-3-吲哚葡萄糖 苷(X-Gluc)]中，于37°C保溫過(guò)夜后用體積濃度分別為70%和95%的乙醇梯度脫色，直到 除去葉綠素。脫色后的樣品在光學(xué)顯微鏡下拍照保存。染色結(jié)果如圖4所示，圖中，A為Id大的幼苗，B為3d大的幼苗，C為花藥，D為花， E為3d的主根根尖，F(xiàn)為果莢。通過(guò)對(duì)擬南芥轉(zhuǎn)基因植株T1代與T2代不同發(fā)育階段的不同 部位進(jìn)行染色分析，表明AtGLP15基因在種皮、花藥、花萼和萼片中沒(méi)有表達(dá)，僅在主根、子 葉、真葉、莖和花的維管組織中表達(dá)。3.擬南芥的石蠟制片 為了更進(jìn)一步確認(rèn)AtGLP15基因的表達(dá)特異性，將生長(zhǎng)了 10天的植株進(jìn)行石蠟切 片，對(duì)AtGLP15基因的表達(dá)進(jìn)行更加準(zhǔn)確的定位。本實(shí)施例的石蠟制片制備，參考本領(lǐng)域的常規(guī)操作即可，具體石蠟制片步驟如下 所示(1)取材選取平板中生長(zhǎng)7 10天的擬南芥的根、莖、葉，將材料剪成合適大小；(2)染色將材料置于上述GUS染液染色過(guò)夜，不同材料，染色時(shí)間各有差異(如 葉的染色時(shí)間要16小時(shí)以上，根8小時(shí)即可)；(3)脫水將材料依次浸泡于30%乙醇1.5 2小時(shí)、50%乙醇1.5 2小時(shí)、70% 乙醇1. 5 2小時(shí)、85%乙醇1. 5 2小時(shí)、95%乙醇1. 5 2小時(shí)、100%乙醇I 1. 5 2 小時(shí)和100%乙醇II 1. 5 2小時(shí)，逐級(jí)脫水，所述乙醇的百分比均為體積百分比濃度；(4)透明將材料浸泡于乙醇和TO型生物透明劑的混合液中1小時(shí)(所述混合液 是將體積百分比為100%的乙醇與TO型生物透明劑等體積比混合)，換純TO浸泡兩次，每 次30min，使乙醇完全脫除；(5)浸蠟將材料放入TO型生物透明劑和熔蠟的混合液(所述混合液是將TO型 生物透明劑和熔蠟等體積比混合)中，于60°C溫箱中浸泡過(guò)夜，第二天再換純石蠟4次，每 次浸泡4h，直至TO完全揮發(fā)；(6)包埋在預(yù)制的小盒中倒入熔蠟，用預(yù)熱好的鑷子將材料放入溶蠟中，調(diào)整好 材料的位置，置4°C讓石蠟冷凝。把包埋好的蠟塊用刀片修切成小長(zhǎng)方體；(7)切片用切片機(jī)將蠟塊切成8 μ m厚的連續(xù)蠟帶，用毛筆輕托蠟帶放于紙上，用 刀片將蠟帶切成略短于蓋玻片的蠟段；(8)粘片將上述切片的蠟段展開(kāi)后拖到載玻片上，置于40°C展片臺(tái)上約lh，在 40°C烘箱中干燥12h以上；(9)脫蠟將附有材料的玻片用TO脫蠟；(10)封片取出載玻片，趁TO還沒(méi)有揮發(fā)完，迅速滴加2 3滴中性樹(shù)膠，將鑷子 夾起蓋玻片一端，傾斜地蓋在載玻片上，在40°C烘箱中干燥24h以上。封片后即制成永久性 玻片標(biāo)本，顯微鏡下拍照觀察。石蠟切片的結(jié)果如圖5所示，圖中A為根橫切面，B為莖橫切面，C為F圖中方框 所示葉脈縱切面部位的放大圖，D為葉脈橫切面，E為D圖中方框所示葉脈橫切面部位的放 大圖，F(xiàn)為葉脈縱切面。從圖5中可以看出，AtGLP15基因在維管束的韌皮部中特異性表達(dá)。
實(shí)施例4葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草1.煙草的組培與繼代培養(yǎng)
煙草種子經(jīng)無(wú)菌水沖洗干凈后，75%乙醇(體積百分比濃度)表面消毒lmin，用 0.5% 2%的次氯酸鈉(質(zhì)量百分比濃度)消毒15min，無(wú)菌水洗凈，無(wú)菌濾紙吸干，接種 于1/2MS培養(yǎng)基上，1 2個(gè)月取其無(wú)菌細(xì)嫩葉片，剪去邊緣及主脈，再剪成小塊作為轉(zhuǎn)化的 起始外植體材料。2.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草從-80°C低溫冰箱取出保存的含有目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌A. tumefaciens EHA105，在 冰上溶化。在含100 μ g/mL Rif和100 μ g/mLKm的LB平板上劃線，置28 °C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)2 天，長(zhǎng)出菌落后挑取單菌落，接種于含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液中，于28°C恒溫?fù)u床(210r/ min)振蕩培養(yǎng)約24h，至0D600 = 0.6左右收集菌體，用激活液(l/^MS+lOO μ M乙酰丁香 酮+蔗糖30g/L，pH 5.2)洗滌菌體并重懸，稀釋10倍。將切成2mmX 2mm大小的煙草葉片 浸入農(nóng)桿菌菌液中，IOmin后將外植體取出，放在滅菌濾紙上，吸去多余的菌液，待風(fēng)干后， 轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基上(l/2MS+2mg/L 6-BA+O. lmg/L ΝΑΑ+100 μ M 乙酰丁香酮+30g/L 蔗糖，pH 5.5)。黑暗，25°C下，共培養(yǎng)3天。3.抗化芽的篩選與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后的葉片經(jīng)無(wú)菌水(加吐溫20至0. 體積百分比濃度)洗滌 4次，然后用含有250mg/L頭孢霉素的無(wú)菌水洗一次，在無(wú)菌紙上吸干后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中 (l/2MS+2mg/L 6-BA+O. lmg/LNAA+50mg/L 潮霉素+500mg/L 頭孢霉素+30g/L 蔗糖 pH 5.8)， 光照，25°C下培養(yǎng)6周。4.抗性植株再生在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)約6周后，切下長(zhǎng)約Icm的芽轉(zhuǎn)接到抗性芽生根培養(yǎng)基 (1/2MS+0. 2mg/L NAA+300mg/L 頭孢霉素+50mg/L Kan+15g/L 蔗糖，pH 5. 8)，照光 25°C下培 養(yǎng)，3周后可觀察到生根，得到抗性植株。5.抗性植株的移栽將生根的抗性植株從瓶子中取出，洗去根部的培養(yǎng)基，用紙巾包裹，置清水中培養(yǎng) 3天，將小苗移到裝有蛭石的盆中，覆蓋保鮮膜，置培養(yǎng)室中保濕10天后，揭去保鮮膜，將分 盆移至溫室，4周后，可將苗移至溫室土壤中栽培。6.煙草的組織化學(xué)染色分析取不同時(shí)期的煙草葉片和莖置于適量的GUS染液(其配方與實(shí)施例3的GUS染液 相同)中，于37°C保溫30h后用體積百分比濃度分別為70%和95%的乙醇梯度脫色(脫色 時(shí)間相對(duì)擬南芥要延長(zhǎng))，直到除去葉綠素。脫色后的樣品在光學(xué)顯微鏡下拍照保存。通過(guò)對(duì)煙草轉(zhuǎn)基因植株Ttl代不同發(fā)育階段的葉片進(jìn)行染色分析，表明擬南芥 AtGLP15基因僅在煙草的維管組織表達(dá)。7.擬南芥的石蠟制片為了更進(jìn)一步確認(rèn)AtGLP15基因的表達(dá)特異性，將在生根培養(yǎng)基上生長(zhǎng)到適當(dāng)大 小的煙草葉片進(jìn)行石蠟切片，對(duì)AtGLP15基因的在制成永久性玻片標(biāo)本后，顯微鏡下拍照觀察，結(jié)果如圖6所示圖中，A為葉片， B為莖，C為葉脈橫切圖，D為C圖中方框所示葉脈橫切面部位的放大圖。從圖中可以看出，AtGLP15基因僅在煙草維管組織的韌皮部表達(dá) 。
權(quán)利要求
1.一種韌皮部特異性啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.一種重組表達(dá)載體，其特征在于該表達(dá)載體中包含權(quán)利要求1所述韌皮部特異性啟 動(dòng)子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組表達(dá)載體，其特征在于該載體是包含有權(quán)利要求1所述韌 皮部特異性啟動(dòng)子的植物雙元表達(dá)載體。
4.一種重組微生物，其特征在于該重組微生物是將權(quán)利要求2所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化 大腸桿菌細(xì)胞制備而得。
5.權(quán)利要求1所述韌皮部特異性啟動(dòng)子在植物生長(zhǎng)或植物抗病育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種韌皮部特異性啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQ IDNO1所示，該韌皮部特異性基因，能夠使得外源目的基因在韌皮部專一性的表達(dá)，從而針對(duì)性的防治從韌皮部入侵的害蟲(chóng)和病原微生物的危害，降低對(duì)害蟲(chóng)及病原微生物的選擇壓以及由此可能對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的副作用，減輕由于表達(dá)抗蟲(chóng)、抗病基因而給轉(zhuǎn)基因植物帶來(lái)的代謝負(fù)擔(dān)等方面產(chǎn)生積極作用。另外，在雙價(jià)或多價(jià)抗蟲(chóng)、抗病基因工程中使用與組成型啟動(dòng)子不同的韌皮部組織特異性啟動(dòng)子可以避免啟動(dòng)子之間同源序列的相互作用而導(dǎo)致基因沉默。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102002498SQ20101012591
公開(kāi)日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2010年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月12日
發(fā)明者楊浪, 陽(yáng)成偉 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)