專(zhuān)利名稱(chēng)：一種滇紫草植株再生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過(guò)愈傷組織再生滇紫草植株的方法。
背景技術(shù)：
滇紫草(Onosma paniculatum Bur. et Fr.)主產(chǎn)云南，是云南省本地常用中草藥， 屬紫草科(Boraginaceae)植物，其根藥用。主要有效成分為紫草素及其衍生物，這些成分 不但具有抗菌、抗炎、抗癌等多種藥理作用，還作為天然色素廣泛用于醫(yī)藥、化妝品和印染 工業(yè)。目前，滇紫草的野生資源破壞嚴(yán)重，市場(chǎng)上供需矛盾凸顯。雖然利用植物細(xì)胞大規(guī) 模培養(yǎng)技術(shù)在反應(yīng)器中直接培養(yǎng)細(xì)胞獲得藥用次生代謝產(chǎn)物是生產(chǎn)植物藥的新技術(shù)和新 方法，但細(xì)胞培養(yǎng)成本和技術(shù)含量都較高，難以大范圍推廣應(yīng)用。相比較而言，通過(guò)愈傷組 織再生滇紫草人工種苗，進(jìn)而采用傳統(tǒng)藥材種植方式解決藥材短缺問(wèn)題是直接而實(shí)際的手 段。這種通過(guò)愈傷組織獲得種苗的方法不受季節(jié)和生境的限制，可人為控制，具有自然有性 繁殖不可比擬的優(yōu)勢(shì)?？偟膩?lái)說(shuō)，獲得一種高頻、快速、穩(wěn)定的植株再生體系是保證高生產(chǎn) 效率，低生產(chǎn)成本的必要手段。紫草科植物的人工種植已有成功的范例，如在東北地區(qū)大規(guī)模種植的紫草屬植物 硬紫草(Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc.)，但種植所用種苗并非通過(guò)生物技 術(shù)方法獲得，而是直接播撒種子獲得幼苗。目前尚未見(jiàn)到通過(guò)無(wú)性繁殖進(jìn)行滇紫草植株再 生的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種通過(guò)愈傷組織進(jìn)行滇紫草植株再生的方法。該方法的操作步驟如下1)滇紫草胚性愈傷組織的誘導(dǎo)取滇紫草莖尖嫩葉，用蒸餾水把葉表面漂洗干 凈，然后置于75%乙醇溶液中浸泡20s，迅速去除乙醇溶液，用滅菌蒸餾水漂洗葉片2次，隨 后轉(zhuǎn)移到2%的次氯酸鈉溶液中浸泡2min，取出葉片，用滅菌蒸餾水漂洗3次。把經(jīng)過(guò)消毒 的葉片放到已滅菌的培養(yǎng)皿中，用刀片切割成大小約0. 5cm2的小塊，并移至愈傷組織誘導(dǎo) 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。誘導(dǎo)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+NAA 0. 1-0. 3mg/L+2, 4-D 0. 8-1. 5mg/L,固體瓊脂培養(yǎng)，pH值5. 6，溫度25°C，避光培養(yǎng)；2)胚性愈傷組織的繼代步驟1)中誘導(dǎo)出的愈傷組織為胚性愈傷組織，該愈傷組 織需要繼代2次以后才用于器官分化獲得植株。繼代培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基 +KT L0mg/L+2，4-D 0. 2mg/L，固體瓊脂培養(yǎng)，pH值5. 6，溫度25°C，避光培養(yǎng)。3)胚性愈傷組織叢生芽的分化從繼代培養(yǎng)基中取出胚性愈傷組織接種到分化 培養(yǎng)基中，既可分化出叢生芽。叢生芽分化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為無(wú)蔗糖MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基 +KTl. 0-2. Omg/L+蔗糖30_50g/L，固體瓊脂培養(yǎng)，pH值5. 6，溫度25°C，避光培養(yǎng)。4)叢生芽的扶壯和根的誘導(dǎo)發(fā)生待步驟3)中的叢生芽長(zhǎng)至Icm左右，將其從基部切下，進(jìn)行叢生芽的扶壯培養(yǎng)。叢生芽扶壯培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為無(wú)蔗糖MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+KT 2. 0mg/L+蔗糖30g/L,固體瓊脂培養(yǎng)，pH值5. 6，溫度25°C，光照培養(yǎng)，光強(qiáng)5000Lux ；
5)經(jīng)過(guò)扶壯的叢生芽長(zhǎng)至4cm左右的無(wú)根苗時(shí)，將苗移至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生 根，生根培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為無(wú)蔗糖MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+IBA 1. 0-2. 0mg/L+蔗糖10_20g/L， 固體瓊脂培養(yǎng)，pH值5. 6，溫度25°C，光照培養(yǎng)，光強(qiáng)5000LUX ； 6)煉苗和移栽待步驟4)中的幼苗長(zhǎng)出4條以上的根，且長(zhǎng)度超過(guò)1. 5cm,即可進(jìn) 行煉苗，煉苗過(guò)程將組培瓶移至溫室，瓶蓋揭開(kāi)2-3天，然后將幼苗從瓶中取出，用自來(lái)水 將粘附于根上的瓊脂清洗干凈(切勿弄斷幼根)，移至以蛭石和珍珠巖混合物為基質(zhì)的培 養(yǎng)穴中煉苗10天左右，移栽過(guò)程經(jīng)過(guò)煉苗的幼苗長(zhǎng)出兩片新葉后可移至自然土壤環(huán)境中 進(jìn)行生長(zhǎng)，整個(gè)植株再生過(guò)程結(jié)束。本發(fā)明能夠獲得高繁殖系數(shù)的胚性愈傷組織，獲得的滇紫草再生植株成活率高， 生長(zhǎng)狀態(tài)良好，可應(yīng)用到大規(guī)模培育滇紫草人工植株的實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1 1)取滇紫草莖尖嫩葉，用蒸餾水把葉表面漂洗干凈，然后置于75%乙醇溶液中浸 泡20s，迅速去除乙醇溶液，用滅菌蒸餾水漂洗葉片2次，隨后轉(zhuǎn)移到2%的次氯酸鈉溶液中 浸泡2min，取出葉片，用滅菌蒸餾水漂洗3次。把經(jīng)過(guò)消毒的葉片放到已滅菌的培養(yǎng)皿中， 用刀片切割成大小約0. 5cm2的小塊，并移至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。誘導(dǎo)培 養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+NAA0. 3mg/L+2，4-D 0. 8mg/L,固體瓊脂培養(yǎng)，pH值5. 6， 溫度25°C，避光培養(yǎng)30天后獲得胚性愈傷組織。2)誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織繼代2次以后用于器官分化獲得植株。繼代培養(yǎng)基和 培養(yǎng)條件為:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+KT 1. Omg/L+2，4-D 0. 2mg/L,固體瓊脂培養(yǎng)，pH值5. 6，溫度 25 °C，避光培養(yǎng)。3)從繼代培養(yǎng)基中取出20塊綠豆大小的胚性愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基中。培 養(yǎng)兩周后，分化出大量叢生芽。叢生芽分化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為無(wú)蔗糖MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基 +KT1. 0mg/L+蔗糖30g/L，固體瓊脂培養(yǎng)，pH值5. 6，溫度25°C，避光培養(yǎng)。4)叢生芽長(zhǎng)至1cm左右，將其從基部切下，進(jìn)行叢生芽的扶壯培養(yǎng)。叢生芽扶壯培 養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為無(wú)蔗糖MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+KT 2. 0mg/L+蔗糖30g/L，固體瓊脂培養(yǎng)，pH值 5. 6，溫度25°C，光照培養(yǎng)，光強(qiáng)5000LUX。5)經(jīng)過(guò)扶壯的叢生芽長(zhǎng)至4cm左右的無(wú)根苗時(shí)，將苗移至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生 根。生根培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為無(wú)蔗糖MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+IBA 1. 0mg/L+蔗糖10g/L，固體瓊 脂培養(yǎng)，pH值5. 6，溫度25°C，光照培養(yǎng)，光強(qiáng)5000LUX。6)幼苗長(zhǎng)出4條以上的根，且長(zhǎng)度超過(guò)1. 5cm,即可進(jìn)行煉苗。首先將組培瓶移 至溫室，瓶蓋揭開(kāi)2-3天，然后將幼苗從瓶中取出，用自來(lái)水將粘附于根上的瓊脂清洗干凈 (切勿弄斷幼根)，移至以蛭石和珍珠巖混合物為基質(zhì)的培養(yǎng)穴中煉苗10天左右，經(jīng)過(guò)煉苗 的幼苗長(zhǎng)出兩片新葉后可移至自然土壤環(huán)境中進(jìn)行生長(zhǎng)，整個(gè)植株再生過(guò)程結(jié)束，一個(gè)月 后統(tǒng)計(jì)再生苗成活率。植株再生效率步驟3)中20塊胚性愈傷組織共產(chǎn)生叢生芽71個(gè)，其中62個(gè)經(jīng)過(guò)扶壯和生根處理成為植株，最后移栽成活55棵滇紫草再生苗。實(shí)施例2 1)取滇紫草莖尖嫩葉，用蒸餾水把葉表面漂洗干凈，然后置于75%乙醇溶液中浸 泡20s，迅速去除乙醇溶液，用滅菌蒸餾水漂洗葉片2次，隨后轉(zhuǎn)移到2%的次氯酸鈉溶液中 浸泡2min，取出葉片，用滅菌蒸餾水漂洗3次。把經(jīng)過(guò)消毒的葉片放到已滅菌的培養(yǎng)皿中， 用刀片切割成大小約0. 5cm2的小塊，并移至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。誘導(dǎo) 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+NAA 0. lmg/L+2，4-D 1. 5mg/L，固體瓊脂培養(yǎng)，pH值 5. 6，溫度25°C，避光培養(yǎng)30天后獲得胚性愈傷組織。2)誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織繼代2次以后用于器官分化獲得植株。繼代培養(yǎng)基和 培養(yǎng)條件為=MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+KT 1. Omg/L+2，4-D 0. 2mg/L,固體瓊脂培養(yǎng)，pH值5. 6，溫度 25 °C，避光培養(yǎng)。
3)從繼代培養(yǎng)基中取出20塊綠豆大小的胚性愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基中。培 養(yǎng)兩周后，分化出大量叢生芽。叢生芽分化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為無(wú)蔗糖MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基 +KT2. Omg/L+蔗糖50g/L，固體瓊脂培養(yǎng)，pH值5. 6，溫度25°C，避光培養(yǎng)。4)叢生芽長(zhǎng)至Icm左右，將其從基部切下，進(jìn)行叢生芽的扶壯培養(yǎng)。叢生芽扶壯培 養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為無(wú)蔗糖MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+KT 2. Omg/L+蔗糖30g/L，固體瓊脂培養(yǎng)，pH值 5. 6，溫度25°C，光照培養(yǎng)，光強(qiáng)5000LUX。5)經(jīng)過(guò)扶壯的叢生芽長(zhǎng)至4cm左右的無(wú)根苗時(shí)，將苗移至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生 根。生根培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為無(wú)蔗糖MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+IBA 2.0!^/1+蔗糖2(^/1，固體瓊 脂培養(yǎng)，pH值5. 6，溫度25°C，光照培養(yǎng)，光強(qiáng)5000LUX。6)幼苗長(zhǎng)出4條以上的根，且長(zhǎng)度超過(guò)1. 5cm,即可進(jìn)行煉苗。首先將組培瓶移 至溫室，瓶蓋揭開(kāi)2-3天，然后將幼苗從瓶中取出，用自來(lái)水將粘附于根上的瓊脂清洗干凈 (切勿弄斷幼根)，移至以蛭石和珍珠巖混合物為基質(zhì)的培養(yǎng)穴中煉苗10天左右。經(jīng)過(guò)煉 苗的幼苗長(zhǎng)出兩片新葉后可移至自然土壤環(huán)境中進(jìn)行生長(zhǎng)，整個(gè)植株再生過(guò)程結(jié)束，一個(gè) 月后統(tǒng)計(jì)再生苗成活率。植株再生效率步驟3)中20塊胚性愈傷組織共產(chǎn)生叢生芽107個(gè)，其中95個(gè)經(jīng) 過(guò)扶壯和生根處理成為植株，最后移栽成活83棵滇紫草再生苗。實(shí)施例3 1)取滇紫草莖尖嫩葉，用蒸餾水把葉表面漂洗干凈，然后置于75%乙醇溶液中浸 泡20s，迅速去除乙醇溶液，用滅菌蒸餾水漂洗葉片2次，隨后轉(zhuǎn)移到2%的次氯酸鈉溶液中 浸泡2min，取出葉片，用滅菌蒸餾水漂洗3次。把經(jīng)過(guò)消毒的葉片放到已滅菌的培養(yǎng)皿中， 用刀片切割成大小約0. 5cm2的小塊，并移至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。誘導(dǎo) 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+NAA 0. 2mg/L+2,4-D 0. 8mg/L，固體瓊脂培養(yǎng)，pH值 5. 6，溫度25°C，避光培養(yǎng)30天后獲得胚性愈傷組織。2)誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織繼代2次以后用于器官分化獲得植株。繼代培養(yǎng)基和 培養(yǎng)條件為=MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+KT 1. Omg/L+2,4-D 0. 2mg/L,固體瓊脂培養(yǎng)，pH值5. 6，溫度 25 °C，避光培養(yǎng)。3)從繼代培養(yǎng)基中取出20塊綠豆大小的胚性愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基中。培 養(yǎng)兩周后，分化出大量叢生芽。叢生芽分化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為無(wú)蔗糖MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+KT1. 5mg/L+蔗糖40g/L，固體瓊脂培養(yǎng)，pH值5. 6，溫度25°C，避光培養(yǎng)。4)叢生芽長(zhǎng)至1cm左右，將其從基部切下，進(jìn)行叢生芽的扶壯培養(yǎng)。叢生芽扶壯培 養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為無(wú)蔗糖MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+KT 2. 0mg/L+蔗糖50g/L，固體瓊脂培養(yǎng)，pH值 5. 6，溫度25°C，光照培養(yǎng)，光強(qiáng)5000LUX。5)經(jīng)過(guò)扶壯的叢生芽長(zhǎng)至4cm左右的無(wú)根苗時(shí)，將苗移至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生 根。生根培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為無(wú)蔗糖MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+IBA 1. 5mg/L+蔗糖15g/L，固體瓊 脂培養(yǎng)，pH值5. 6，溫度25°C，光照培養(yǎng)，光強(qiáng)5000LUX。
6)幼苗長(zhǎng)出4條以上的根，且長(zhǎng)度超過(guò)1. 5cm,即可進(jìn)行煉苗。首先將組培瓶移 至溫室，瓶蓋揭開(kāi)2-3天，然后將幼苗從瓶中取出，用自來(lái)水將粘附于根上的瓊脂清洗干凈 (切勿弄斷幼根)，移至以蛭石和珍珠巖混合物為基質(zhì)的培養(yǎng)穴中煉苗10天左右。經(jīng)過(guò)煉 苗的幼苗長(zhǎng)出兩片新葉后可移至自然土壤環(huán)境中進(jìn)行生長(zhǎng)，整個(gè)植株再生過(guò)程結(jié)束，一個(gè) 月后統(tǒng)計(jì)再生苗成活率。植株再生效率步驟3)中20塊胚性愈傷組織共產(chǎn)生叢生芽101個(gè)，其中90個(gè)經(jīng) 過(guò)扶壯和生根處理成為植株，最后移栽成活82棵滇紫草再生苗。
權(quán)利要求
一種通過(guò)愈傷組織再生滇紫草植株的方法，其特征在于該方法的操作步驟包括1)滇紫草胚性愈傷組織的誘導(dǎo)把經(jīng)過(guò)消毒的滇紫草葉片移至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+NAA 0.1-0.3mg/L+2，4-D 0.8-1.5mg/L，固體瓊脂培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25℃，避光培養(yǎng)；2)胚性愈傷組織的繼代步驟1)中誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織，進(jìn)行繼代2次，繼代培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+KT 1.0mg/L+2，4-D 0.2mg/L，固體瓊脂培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25℃，避光培養(yǎng)；3)胚性愈傷組織叢生芽的分化從繼代培養(yǎng)基中取出胚性愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基中，既可分化出叢生芽，叢生芽分化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為無(wú)蔗糖MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+KT1.0-2.0mg/L+蔗糖30-50g/L，固體瓊脂培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25℃，避光培養(yǎng)；4)叢生芽的扶壯和根的誘導(dǎo)發(fā)生待步驟3)中的叢生芽長(zhǎng)至1cm左右，將其從基部切下，進(jìn)行叢生芽的扶壯培養(yǎng)，叢生芽扶壯培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為無(wú)蔗糖MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+KT 2.0mg/L+蔗糖30g/L，固體瓊脂培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25℃，光照培養(yǎng)，光強(qiáng)5000Lux；5)經(jīng)過(guò)扶壯的叢生芽長(zhǎng)至4cm左右的無(wú)根苗時(shí)，將苗移至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，生根培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為無(wú)蔗糖MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+IBA 1.0-2.0mg/L+蔗糖10-20g/L，固體瓊脂培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25℃，光照培養(yǎng)，光強(qiáng)5000Lux；6)煉苗和移栽待步驟4)中的幼苗長(zhǎng)出4條以上的根，且長(zhǎng)度超過(guò)1.5cm，可進(jìn)行煉苗，移至以蛭石和珍珠巖混合物為基質(zhì)的培養(yǎng)穴中煉苗10天，待幼苗長(zhǎng)出兩片新葉后可進(jìn)行移栽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過(guò)愈傷組織再生滇紫草植株的方法。其操作步驟主要包括1)滇紫草胚性愈傷組織的誘導(dǎo)；2)胚性愈傷組織的繼代培養(yǎng)；3)胚性愈傷組織叢生芽的分化；4)叢生芽的扶壯和根的誘導(dǎo)；5)煉苗和移栽。本發(fā)明能夠獲得高繁殖系數(shù)的胚性愈傷組織，獲得的滇紫草再生植株成活率高，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，可應(yīng)用到大規(guī)模培育滇紫草人工植株的實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101828524SQ20101012666
公開(kāi)日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月18日
發(fā)明者劉迪秋, 葛鋒, 陳朝銀, 黃文虎 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)