專利名稱：抗腫瘤重組質粒、基因疫苗及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物與現(xiàn)代農業(yè)技術領域，涉及一種抗腫瘤基因疫苗，更具體地說，本發(fā)明涉及一種含有大鼠細胞色素P450家族26超家族A多肽l(Cyp26al)的抗腫瘤基因疫苗及其應用。
背景技術：
我國現(xiàn)有癌癥病人300多萬人，每年死于惡性腫瘤的患者約為130萬人。每年有 160萬到200萬新發(fā)的惡性腫瘤病例，每年死于癌癥的患者約為130萬，并以3%的速度遞增，給我國人民的生活和健康造成巨大威脅，給社會和家庭帶來巨大的壓力，一定程度上制約了我國經濟的可持續(xù)發(fā)展。乳腺癌是一種嚴重危害人類，尤其是女性健康的惡性腫瘤。乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤，位列十大高發(fā)性腫瘤，大約每100名婦女中就有一人患乳腺癌。雖然男性患乳腺癌的幾率比女性少100倍，但是由于檢查的忽視，男性乳腺癌患者的致死率較高。在美國，2003年有212，600名婦女經檢查患乳腺癌，40，200名婦女死于該疾病。更讓人關注和擔心的是，到確診之時，已經有40%的患者發(fā)生了轉移。乳腺癌有幾種不同的組織學類型，其中絕大多數(shù)(90%左右)起源于乳腺導管，最常見的乳腺癌是浸潤性導管癌；大約5%的乳腺癌發(fā)生在乳腺小葉，稱為乳腺小葉癌。此外，乳腺癌患者復發(fā)的幾率也高于一般人群。乳腺癌的治療包括手術治療、放射治療、化學治療、生物治療等，盡管科研工作者對攻克乳腺癌的研究投放了大量的精力，但是一旦發(fā)生轉移和侵潤，乳腺癌的治療仍然顯得非常的棘手。上世紀九十年代初，一系列關于注射外源基因在體內誘導免疫應答的報道揭開了 DNA疫苗研究的序幕，從此基因免疫的新技術引起世界各國的高度重視。由于基因免疫可誘導機體產生全面的免疫應答，同時又具有安全、可靠、生產方便等優(yōu)點，故1994年世界衛(wèi)生組織(WHO)撥款把DNA疫苗納入WHO全球免疫研制開發(fā)計劃之中。1994年美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)以國家生物戰(zhàn)略發(fā)展計劃的專項經費資助開展DNA疫苗治療HIV的研究工作，1995年報導了世界第一例DNA疫苗治療艾滋病的臨床試驗，1998-2007年相繼報導了 DNA疫苗治療艾滋病的二期臨床試驗及臨床應用報道。實驗證明，DNA疫苗由于其編碼的抗原可以通過外源和內源兩種途徑被抗原提呈細胞提呈，所以能激起全面的免疫反應。DNA疫苗技術的核心就是把外源基因組裝到含有必要表達調控元件的真核質粒表達載體上，然后將重組的質粒導入動物體內，使外源基因在體內表達，從而激活機體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫反應。與傳統(tǒng)的疫苗相比，DNA疫苗有很多優(yōu)勢，如疫苗相對穩(wěn)定，方便生產、運輸和保存且便宜；可設計性強；檢測、檢驗方便。實驗證明，DNA疫苗由于其編碼的抗原可以通過外源和內源兩種途徑被抗原提呈細胞提呈，所以能激起全面的免疫反應。因此，DNA疫苗技術很快被運用在肝炎、愛滋病、結核病等感染性疾病的防治研究上。近幾年DNA疫苗被運用在腫瘤的防治研究上，取得了較大的進展，部分腫瘤DNA疫苗已經進入臨床試驗階段。根據(jù)腫瘤相關抗原(Tumor Associated Antigens :TAAs)研制的全長基因疫苗可以打破機體免疫耐受， 通過MHC-I和MHC-II型抗原提呈途徑，引起B(yǎng)細胞反應和⑶4+、⑶8+T細胞反應。從而有效的保護機體免受腫瘤的侵襲。有研究者通過構建不同種生物間同源DNA疫苗的方法，為腫瘤基因疫苗的研制開辟了一條新的思路。TAAs全長DNA疫苗一個潛在的不利因素就是TAAs 體內表達產生的生物學作用。如一些TAAs本身就是癌基因產物，它們在癌變過程中可能起到信號分子的作用(Fong et al.，2001 ；Pupa et al.，2005)。Zhu 等(Zhu et al.，2001) 用破傷風毒素無毒性的C片段(Frc)作為佐劑，融合SvFv，構建Id DNA疫苗，結果發(fā)現(xiàn)該疫苗不僅對該Id陽性腫瘤有作用，對陰性腫瘤一樣有效。上皮癌相關的抗原MUC 1是一種高度糖基化的黏液素，不少分泌腺來源的上皮細胞癌化與細胞過量分泌MUCl相關。免疫實驗表明MUCl基因疫苗對于前列腺和乳腺癌的患者有一定的治療效果，進一步的二期臨床正在評價中(Stevenson et al.，2004)。20%到30%的乳腺癌和卵巢癌病人的癌細胞中過量表達生長素受體的賴氨酸激酶HER2 (neu, c-erbB-Ι)，小鼠腫瘤模型實驗證明MMTV-HER2基因疫苗可以在體激發(fā)CTL反應和抗體，進一步的免疫細胞缺失實驗表明僅僅是疫苗誘導的抗體反應本身就能夠有效的治療腫瘤(Renard et al.，2003)。Cyp26al(retinoic acid hydroxylase)又稱 P450RA1，是細胞色素 P450 (Cyp)家族成員，盡管CYP26與細胞色素P450家族的成員具有相似的結構，但它與細胞色素P450家族的任何成員都不具有同源性，因此被認為細胞色素P450的基因家族的一個新成員。研究發(fā)現(xiàn)Cyp26能將視黃酸(RA)選擇性的轉化為RA的極性代謝物(4-0H-，18-0H-, 4-oxo-RA)。 Cyp26al通過調節(jié)RA水平進而控制類維生素A信號。給動物喂飼缺乏維生素A的飼料，胚胎發(fā)育出現(xiàn)異常，胚胎接受過多的類維生素A信號亦會破壞胚胎的正常發(fā)育。給予RA能減少雌激素誘導的大鼠子宮基質和肌細胞的增生。由此可推測，內源性的類維生素A可能防止生殖道腫瘤的發(fā)生。Piamsomboon等人報道類維生素A臨床對生殖系統(tǒng)癌癥的治療和化學預防有一定效果，在性激素的作用下RA產物的組織特異性分布和它們的調節(jié)將有助于制定癌癥的治療策略。Warrell等人也發(fā)現(xiàn)RA對一些癌癥的預防和治療有效。最近有實驗證明RA調節(jié)的靶基因的表達與類維生素A的抗癌信號有關。Edwin等人于1999年發(fā)現(xiàn) Cyp26al是胚胎癌細胞分化的一個關鍵分子。

發(fā)明內容
本發(fā)明人采用抑制消減雜交技術(SSH)，篩選大鼠植入前后子宮差異表達基因，通過RT-PCR和Northern blotting實驗證實Cyp26al基因胚胎植入前后為差異表達基因。 用RACE方法首次克隆了 SD大鼠子宮Cyp26al基因的cDNA全長，并登錄GenBank (登錄號 DQ317305)。該基因與真核表達載體構建Cyp26alDNA疫苗，以小鼠4T1乳腺腫瘤為模型，進行多次免疫抗腫瘤實驗，顯示Cyp26alDNA疫苗具有明顯抑制腫瘤生長和遷移的作用。因此，本發(fā)明的目的在于，提供一種用于哺乳動物抗腫瘤基因疫苗的重組質粒及包括該重組質粒的基因疫苗。本發(fā)明的另一個目的在于，提供上述重組質粒及基因疫苗的制備方法和用途。本發(fā)明的目的是采用以下技術方案來實現(xiàn)的。一方面，本發(fā)明提供一種用于哺乳動物抗腫瘤基因疫苗的重組質粒，其由Cyp26al基因的cDNA片段和真核表達載體組成，真核表達載體優(yōu)選為PVAX1。優(yōu)選地，所述Cyp26al基因的cDNA片段源自Spreqne-Dawley大鼠子宮，其堿基序列優(yōu)選如SEQ ID NO. 1所示。
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另一方面，本發(fā)明提供了包含上述的重組質粒的菌株，優(yōu)選地，所述菌株選自大腸桿菌ToplOF，菌株。本發(fā)明還提供了包含上述的重組質粒的細胞，優(yōu)選地，所述細胞選自人宮頸癌 (HeLa)細胞和人絨癌(JEG-3)細胞。又一方面，本發(fā)明提供一種哺乳動物抗腫瘤的基因疫苗，其中包含上述的重組質粒。優(yōu)選地，所述疫苗還包含佐劑；更優(yōu)選地，所述佐劑選自百分比濃度為0.25%的普魯卡因，每次注射佐劑用量與基因疫苗用量的體積質量配比為2(V/μ 1) l(W/yg)，具體優(yōu)選佐劑用量與基因疫苗用量分別為100 μ 1和50 μ g。另外，本發(fā)明還提供一種制備上述重組質粒的方法，該方法采用如SEQ ID NO. 2和 SEQ ID而.3所示的堿基序列作為引物克隆所述07 26&1基因的(^嫩片段；優(yōu)選地，該方法采用溫度降落逆轉錄_聚合酶鏈式擴增方法克隆所述Cyp26al基因的cDNA片段。還一方面，本發(fā)明提供一種制備Cyp26al依賴性乳腺癌動物模型的方法，其是通過使用包含人源Cyp26al基因的cDNA片段的4T1小鼠乳腺癌細胞注射動物乳腺部位制備的；優(yōu)選地，該方法采用如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示的堿基序列作為引物克隆所述人Cyp26al基因的cDNA片段。本發(fā)明還提供上述方法制備的Cyp26al依賴性乳腺癌動物模型，優(yōu)選地，所述動物模型為小鼠模型。再一方面，本發(fā)明提供了上述的重組質粒在制備哺乳動物抗腫瘤基因疫苗中的用途，優(yōu)選地，所述哺乳動物選自人，所述腫瘤選自乳腺癌。本發(fā)明還提供了上述的基因疫苗在制備預防和/或治療哺乳動物乳腺癌的藥物中的用途，優(yōu)選地，所述哺乳動物選自人，所述腫瘤選自乳腺癌。綜上所述，本發(fā)明將DNA 疫苗免疫抗腫瘤技術應用預防和治療乳腺癌，從而提供一種可以明顯預防和/或治療乳腺癌的DNA疫苗，該疫苗由含有編碼細胞色素P450家族26超家族A多肽l_Cyp26al蛋白的基因和真核質粒表達載體PVAXl組成，其中所述編碼細胞色素P450家族26超家族A多肽 1-Cyp26al蛋白的基因為SD大鼠子宮的全長互補脫氧核糖核酸基因，此基因已登入基因文庫(Cyp26al :DQ317305)。。雖然其他真核質粒表達載體，如pCR3. l、pCMV4載體構建的疫苗， 其蛋白表達量高于PVAXl載體構建的疫苗，免疫效果亦優(yōu)于pVAXl載體構建的疫苗，但由于前兩個載體不能用于人類，而PVAXl載體可直接用于人類，是經美國FDA認可的。研究抗腫瘤疫苗最終目的是要為人類抗癌提供新技術，故選取了可直接用于人類的PVAXl載體。本發(fā)明通過RACE方法首次克隆了 SD大鼠子宮全長Cyp26al基因的cDNA，成功構建了 pVAXl-Cyp26alDNA疫苗，其能夠在HeLa細胞中高效表達Cyp26al蛋白。將20 μ g pVAXl-Cyp26al質粒DNA通過普魯卡因鹽酸鹽(bupivacaine-HCI)藥物誘導后肌肉接種小鼠肌肉，小鼠能夠吸收質粒DNA，并表達編碼的Cyp26al蛋白抗原，表達的Cyp26al被小鼠的免疫系統(tǒng)識別，同時激發(fā)Cyp26al抗原特異性的體液免疫和細胞免疫反應，抗體滴度最高可達1 4000以上，并且這兩種類型的免疫應答能夠在體外作用于HeLa細胞和JEG-3細胞，誘導其發(fā)生細胞凋亡，表明PVAX1-Cyp26al DNA疫苗激發(fā)的免疫反應在體外具有抗腫瘤作用。與此同時，以小鼠動物Cyp26al依賴型4T1乳腺腫瘤模型和Cyp26al非依賴型4T1 乳腺腫瘤模型進行實驗，實驗結果顯示與對照組相比，Cyp26alDNA疫苗具有明顯抑制腫瘤生長和遷移的作用。該疫苗的優(yōu)點是劑量小效果明顯、安全、適用于各類人群、可大量生產且便于儲運和方便使用。該DNA疫苗作為治療性疫苗能引起CTL，然而治療腫瘤的效果有時卻不盡如意， 進一步的研究發(fā)現(xiàn)CTL效應一般發(fā)生在腫瘤生長的早期，當腫瘤快速生長時候抗原激發(fā)的 CTL作用增強到極大，在晚期腫瘤中，細胞毒T細胞作用逐漸開始喪失，所以早期腫瘤的疫苗治療通過加強的CTL反應能夠取得較好的療效，但是由于CD8+T細胞功能的減弱以及腫瘤對免疫系統(tǒng)的逃逸，晚期腫瘤的基因疫苗治療效果就大打折扣。由此可見，采用基因疫苗治療腫瘤時，對早期腫瘤的療效要好于對晚期腫瘤的療效。由此可見，本發(fā)明所提供的pVAXl-Cyp26alDNA疫苗的優(yōu)點在于(1)所需的免疫量較小，20 100微克即可；(2) DNA疫苗能同時高效激發(fā)體液免疫和細胞免疫，比其它免疫手段免疫效力更強；(3)具有有效抑制腫瘤生長和遷移的作用；(4)基因免疫安全、長效 (免疫能力有長時間的記憶)、穩(wěn)定、操作便捷，利于產業(yè)化生產。


圖1為本發(fā)明實施例1中妊娠大鼠子宮總RNA電泳圖。圖2為本發(fā)明實施例1中由Cyp26al基因的cDNA片段和真核表達載體pVAXl構建的重組質粒譜圖。圖3為本發(fā)明實施例4中RT-PCR分析CYP26A 1基因的組織表達譜，其中A為子宮，B為卵巢，C為下丘腦，D為垂體，E為心，F(xiàn)為肝，G為脾，H為肺，I為腎，J為胃，K為小腸，L為大腸。
具體實施例方式以下通過具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的范圍。在以下各實施例中，所涉及的提取細胞總RNA、酶切、質粒純化、RT-RCR方法、 ELISA方法、細胞轉染等分子生物學手段和技術的具體操作方法請參見《精編分子生物學實驗指南》F.奧斯伯等著，顏子穎等譯，科學出版社，1998。在以下各實施例中，所使用的實驗動物Spreqne-Dawley大鼠和BaLb/c小鼠均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。實施例1 構建 pVAXl_Cyp26al DNA 疫苗本實施例為本發(fā)明所提供的pVAXl-Cyp26alDNA疫苗的構建，具體步驟如下(1)動物組織取材選用性成熟，體重220_260g的Spreqne-Dawley雌性大鼠， 在動情期與雄性大鼠(1 1)合籠交配，取妊娠D3-D6子宮。(2)妊娠子宮總RNA的提取及純化采用 Promega 公司 RNAgents ⑧總 RNA 提取系統(tǒng)(Total RNA Isolation System kit)提取妊娠子宮總RNA，具體操作如下將收集的子宮組織用TRIzoI —步法提取組織總 RNA, ImlTRIzol與子宮組織約50_100mg)加入滅菌的勻漿管中，勻漿破碎后轉入Eppendoff 管，加入0. 2ml氯仿，搖動15sec，室溫靜置2-3min，12，000rpm離心15min(4°C )，取上清至以新的Eppendoff管，加入0. 5ml異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置IOmin，12，OOOrpm離心 IOmin (40C )，棄上清，加入Iml 75%乙醇清洗沉淀，7，500rpm離心5min (4°C )(此步重復兩次)，真空自然干燥，加入無核酸酶(Nuclease-free)的水500 μ L溶解，-80°C保存。取5 μ L樣品溶液進行1. 5%甲醛變性瓊脂糖凝膠(含0. 2 μ g/mLEB)電泳檢測(Jian-Jim Chang, Jing-Pian Peng*YingYang, Jing-Lingffang, LiXu(2006)Study on the Anti-fertility Effects of the Plasmid DNA Vaccine Expressing Partial brLDH_C4· Reprod. 131 183-192)。凝膠條帶分析結果如圖1所示，顯示所制備的樣品中28S rRNA的量約為18S rRNA的二倍，此結果證明了總RNA的完整性。(3)設計特異性引物根據(jù)人、鼠Cyp26al基因序列始密碼子以及終止密碼子外端的高度保守序列設計擴增全長Cyp26al基因的特異性引物(帶有酶切位點)上游引物(SEQID NO. 3)5' -CGA AGC TT(HindIII)A TGG GGC TCC CGG CGC TGC T—3'；下游引物(SEQID NO. 4)5' -CGCTC GAG(XhoI)TCAGATATCTCCCTGGAAGTGG-3‘。(4)克隆Cyp26al基因采用溫度降落逆轉錄-聚合酶鏈式擴增方法(TDRT-PCR， Touch-down reverse transcription polymerase chain reaction)克隆擴i曾大鼠子 Cyp26al基因的cDNA序列，具體操作如下50 μ L的反應體系由10 μ L的AMV/Tfl 5 X反應緩沖液、2mM的dNTPs混合物、2mM的MgSO4U μ M的上游引物及上游引物、0. IU/ μ L的AMV逆轉錄酶(promega產品，貨號Μ1701，購自北京澤平科技有限責任公司)、0. lU/yL的RNasin 核酸酶抑制劑(購自Sigma公司)、2 μ g的總RNA和無核酸酶的水組成。逆轉錄反應在48°C反應45min，接著在95°C滅活5min，加入0. lU/yL的Tfl DNA聚合酶(promega產品，購自北京益利精細化學品有限公司)，在降落TD-PCR擴增階段，變性溫度為94°C lmin, 退火溫度從開始65°C lmin，以每兩個循環(huán)下降1°C的速度降至55°C lmin，延伸溫度為 680C 1. 5min ；最后在以退火溫度58°C繼續(xù)擴增15個循環(huán)。最后在72°C延伸lOmin。(5)回收純化Cyp26al cDNA 將擴增的Cyp26al基因片段，利用Wizard PCR Preps. DNA樹脂純化體系試劑盒(promega產品，貨號A7170，購自北京益利精細化學品有限公司)回收純化；本發(fā)明首次克隆出大鼠子宮Cyp26al的全長基因，其序列如SEQ IDN0. 2所示，其 GeneBank 登錄號為 DQ317305。(6)構建pVAXl_Cyp26alDNA疫苗將Cyp26al全長氨基酸編碼序列的cDNA片段重組到PVAXl真核表達質粒(Irwitrogen產品，購自北京中原領先科技有限公司)中， 構建成PVAX1-Cyp26al DNA重組質粒，具體的質粒圖譜見圖2，構建成的重組質粒即抗腫瘤的pVAXl-Cyp26al基因疫苗，。上述具體的操作如下用連接反應液轉化感受態(tài)細胞 ToplOF'(購自北京全式金生物技術有限公司)，取80 μ L轉化的菌液涂布LB (含氨芐青霉素)平板，于37°C培養(yǎng)過夜；挑取陽性克隆搖菌過夜，用堿裂法提取質粒DNA，即本實施例的PVAX1-Cyp26al，進行酶切鑒定并對陽性重組質粒進行測序；將有正向插入了 Cyp26al 擴增產物外源DNA片段的重組克隆質粒經純化后，利用克隆質粒測序引物M13反向引物 (reverseprimer)和T7啟動子引物(promoter primer)(購自北京奧科生物技術有限責任公司)對Cyp26al擴增產物雙向測序，其核酸序列如SEQ ID NO. 1所示。經酶切及測序鑒定正確后，按照Qiagen大提質粒試劑盒操作步驟大量提取pVAXl-Cyp26al，利用紫外分光光度計(美國Beckman，型號DU530)定量。實施例2 構建pEGFP-Cyp26al真核表達質粒及Cyp26al依賴性乳腺癌模型
本實施例為pEGFP-Cyp26al真核表達質粒以及Cyp26al依賴性乳腺癌模型的構建，具體步驟如下(1)動物組織取材選取人妊娠2-3個月流產胎盤(取自北醫(yī)三院計劃生育門診)。(2)妊娠子宮總RNA的提取及純化采用Promega公司RNAgents Total RNA Isolation System kit提取妊娠胎盤總RNA，具體操作如下將收集的胎盤組織用TRIzol 一步法提取組織總RNA，Iml TRIzol與胎盤組織約50_100mg)加入滅菌的勻漿管中，勻漿破碎后轉入Eppdoff管，加入0. 2ml氯仿，搖動15sec，室溫靜置2_3min，12，OOOrpm離心15min (4 °C )，取上清至以新的Eppdoff管，加入0. 5ml異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置 lOmin，12，OOOrpm離心IOmin (4°C )，棄上清，加入Iml 75 %乙醇清洗沉淀，7，500rpm離心 5min (4°C ),真空自然干燥，加入Nuclease-free水500 μ L溶解，-80°C保存。取5 μ L樣品溶液進行1. 5%甲醛變性瓊脂糖凝膠(含EBO. 2 μ g/mL)電泳檢測總RNA的完整性。(3)設計特異性引物根據(jù)人Cyp26al基因序列(GeneBank號NP_000774)始密碼子以及終止密碼子外端的高度保守序列設計擴增全長人Cyp26al基因的特異性引物(帶有酶切位點)克隆人胎盤組織Cyp26al基因的特異性引物(帶有酶切位點Kpnl)上游引物(SEQID N0. 5)5' -CGGGGTACC(Kpnl)ATGGGGCTCCCGGCGCT-3 ’ ；下游引物(SEQID N0. 6)5' -TCATCAGGGTACC(Kpnl)CCATGGAAATGG-3’。(4)克隆Cyp26al基因采用TDRT-PCR克隆擴增人胎盤組織Cyp26al基因cDNA 序列，具體操作如下50 μ L的反應體系由10 μ L的AMV/ΤΠ 5Χ反應緩沖液、2mM的dNTPs 混合物、2mM的MgSO4U μ M的上游引物及上游引物，0. IU/μ L的AMV逆轉錄酶、0. IUy L的 RNasin 核糖核酸酶抑制劑(Ribonuclease Inhibitor)、2 μ g的總RNA和無核酸酶的水組成。逆轉錄反應在48°C反應45min，接著在95°C滅活5min，加入0. IU/μ L的Tfl DNA聚合酶，變性溫度為94°C lmin，退火溫度從開始65°C lmin,以每兩個循環(huán)下降1°C的速度降至 550C lmin，延伸溫度為69°C 1. 5min ；最后在以退火溫度58°C min繼續(xù)擴增20個循環(huán)。最后在72°C延伸IOmin0(5)回收純化Cyp26al cDNA 將擴增的Cyp26al基因片段，利用Wizard PCR Preps. DNA樹脂純化體系試劑盒回收純化；(6)構建pEGFP-Cyp26al真核表達質粒將人Cyp26al全長氨基酸編碼序列的 cDNA片段重組到帶有綠色熒光蛋白標記的真核表達載體pEGFP (購自BD Biosciences公司)中，構建成pEGFP-Cyp26al真核表達質粒，具體操作如下用連接反應液轉化感受態(tài)細胞ToplOF’，取80 μ L轉化的菌液涂布LB (含氨芐青霉素)平板，于37°C培養(yǎng)過夜；挑取陽性克隆搖菌過夜，進行酶切鑒定并對陽性重組質粒進行測序；選擇有正向插入外源 DNA片段的重組克隆質粒；測序正確的菌再次搖菌，用Qiagen無內毒素試劑盒提取，得到 pEGFP-Cyp26al 質粒，備用。(7)構建Cyp26al依賴性乳腺癌模型將pEGFP-Cyp26al真核表達質粒經脂質體轉染4T1小鼠乳腺癌細胞(購自美國標準生物品收藏中心ATCC)，具體操作如下在24孔板中長滿小鼠乳腺癌4T1細胞用無血清的DMEM培養(yǎng)液沖洗兩遍，將2 μ g pEGFP-Cyp26al (含人Cyp26al基因)質粒加入到100 μ L無血清的DMEM培養(yǎng)液中輕輕混勻，5 μ L脂質體加入到95 μ L無血清的DMEM培養(yǎng)液中輕輕混勻。放37°C，5% CO2培養(yǎng)12小時后，換加含 10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12小時后將細胞用胰蛋白酶消化到60毫米培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，24小時后，在培養(yǎng)液中加入800yg/mLG418。大約2周后，在培養(yǎng)皿中形成細胞集落；加入ImLO. 25%胰蛋白酶+0. 04% EDTA消化液。待細胞完全消化成單細胞后，終止消化。500g離心細胞5分鐘后，細胞用100/200目細胞篩過濾去成團細胞。過濾后的單細胞用DMEM重懸成單細胞懸液；流式細胞儀分選488nm陽性的細胞。用正常的4T1單細胞作為分選陰性對照；分選出的陽性細胞繼續(xù)培養(yǎng)，反復篩選三次后，細胞用流式細胞儀 (FACS-vantage/Diva，購自美國 BD Biosciences)和熒光顯微鏡(Nikon 80i Microscope System，冷CCDSP0T，日本Nikon)分析純度。熒光顯微鏡和流式分析證明，Cyp26al_EGFP表達細胞純度為97. 8% ；IXlO5含有人Cyp26al基因的4T1細胞皮下注射BALB/C小鼠的乳腺位置，第九天成瘤率100% (N = 20)，建立完成人Cyp26al依賴性乳腺癌模型。實施例3 :pYAXl-Cyp26al DNA疫苗的體外瞬時表達檢測本實施例為對實施例1所構建的pVAXl-Cyp26al DNA疫苗，進行外源Cyp26al基因體外瞬時表達的檢測，分為Cyp26al基因的體外mRNA表達和外源Cyp26al體外蛋白表達兩部分。(1) Cyp26al基因的體外mRNA表達建立HeLa細胞(人宮頸癌細胞)和JEG-3細胞(人絨癌細胞)(購自北京協(xié)和醫(yī)科大學基礎所細胞中心)體外瞬時表達系統(tǒng)，具體操作如下pVAXl-Cyp26al真核表達質粒經脂質體轉染，分別于24小時、48小時、72小時收集培養(yǎng)液，提取收集的轉染HeLa細胞和JEG-3細胞的總RNA，采用RT-PCR方法分析Cyp26al基因的體外表達。RT-PCR方法擴增出Cyp26al cDNA條帶，結果表明PVAXl_Cyp26al真核表達質粒在HeLa細胞和JEG-3細胞體外瞬時表達系統(tǒng)中，在mRNA水平上能高效表達，mRNA水平的表達量比空質粒對照組高出 172%。(2)外源Cyp26al體外蛋白表達采用Western-Blotting的方法檢測轉染HeLa細胞和JEG-3細胞Cyp26al蛋白的表達，具體操作如下取轉染48h后的HeLa細胞和JEG-3細胞在細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板內用 PBS或生理鹽水洗滌細胞2次，加細胞裂解液RIPA buffer (購自北京普利萊基因技術有限責任公司)，搖動冰浴10-15min。用細胞刮刮下細胞，轉入EP管中，以Bio-ford法檢測蛋白質含量。取50 μ g總蛋白加入蛋白上樣buffer，煮沸變性5min，進行SDS-PAGE，濃縮膠溶度為5%，分離膠溶度為12. %，濕法轉到硝酸纖維素膜上，5%牛血清白蛋白封閉1小時， 洗滌膜，加入鼠抗Cyp26al抗體(購自Acris Germany公司)，后進行三次洗滌膜，膜上滴加 HRP標記的抗鼠二抗(Jackson產品，購自北京中杉金橋生物技術有限公司)，ECL顯色，暗室 X光片顯影。X光片用HP掃描儀灰度掃描。結果證實pVAXl-Cyp26al能在Hela細胞JEG-3 細胞體外瞬時表達系統(tǒng)中表達具有生物活性的Cyp26al蛋白，比空質粒對照組高165%。實施例4 :pVAXl-Cyp26al DNA疫苗的體內表達檢測本實施例為對實施例1所構建的pVAXl-Cyp26al DNA基因疫苗，進行外源Cyp26al 基因的體內表達檢測，具體操作如下
將BALB/C小鼠隨機分為3組，每組20只，實驗組為肌肉注射 50 μ gpVAXl-Cyp26alDNA疫苗；對照組1肌肉注射50 μ g ρVAXl空質粒DNA ；對照組2肌肉注射ΙΟΟμ L生理鹽水。第3周后收集pVAXl-Cyp26al免疫BALB/C小鼠的肌肉、肝臟和脾臟組織，提取組織總RNA，RT-PCR檢測外源Cyp26al基因在BALB/C小鼠體內的表達情況。檢測結果表明，pVAXl-Cyp26alDNA疫苗免疫后肌肉、肝臟和脾臟組織細胞中Cyp26al在mRNA 水平上表達，結果如圖2所示。實施例5 :pYAXl-Cyp26al DNA疫苗體液免疫應答檢測本實施例為使用實施例1所構建的pVAXl-Cyp26al DNA疫苗，檢測BALB/C小鼠體液免疫應答，具體操作如下以2 μ g/孔的BALB/C小鼠純化的子宮蛋白作包被抗原(96孔板)，4°C包被過夜， PBST洗板，5min/次，共洗3次，1 % BSA+5 %脫脂奶粉封閉，37°C，2h ；PBST洗板，5min/次，洗 1次，將pVAXl-Cyp26alDNA疫苗免疫BALB/C小鼠三周后的血清按1 100到1 6000的比例稀釋，作為一抗，用1 100倍稀釋的正常血清(未注射任何質粒)和1 100倍稀釋的肌肉注射50 μ g ρVAXl空質粒DNA的血清分別作為對照，37°C，2h ；PBST洗板，5min/次， 共洗5次，加入適當稀釋的二抗(HRP標記抗鼠IgG，購自美國Santa Cruz公司)，37°C，Ih ； PBST 洗板，5min/次，共洗 5 次；加入 TMB 試劑顯色(R&D Systems Inc, USA)；加入 IM H2SO4 終止反應，用讀板器(Bio-Rad)在A450讀取數(shù)值。檢測結果顯示，pVAXl-Cyp26alDNA疫苗免疫后機體能產生高滴度抗體(抗體滴度> 1 5000)。實施例6 :pVAXl-Cyp26al DNA疫苗細胞免疫應答檢測本實施例為使用實施例1所構建的pVAXl-Cyp26al DNA疫苗，檢測BALB/C小鼠細胞免疫應答，包括T淋巴細胞細胞毒性檢測和NK細胞活性檢測兩部分。(I)T淋巴細胞細胞毒性(CTL)檢測將BALB/C小鼠隨機分為3組，每組10只，實驗組為肌肉注射50 μ gpVAXl_Cyp26al DNA疫苗；對照組1為肌肉注射50 μ g pVAXl空質粒DNA ；對照組2為肌肉注射100 μ L生理鹽水。第3周后收集各組小鼠的T淋巴細胞，作為CTL檢測效應細胞(Effector cells) 按大約5 X 106細胞/mL與2 μ g/mL純化的Cyp26al蛋白作為特異性刺激抗原作用，在CTL 培養(yǎng)液(1640-10% FBS)(購自GIBCO公司)中于37°C，5% CO2共培養(yǎng)5d，BSA陰性對照。 Effector Target (Ε Τ)比例從 50 1、25 1 到 12. 5 1，作用 6h 后，每孔加入 20 μ L 的CellTiter 96 Aqueous單溶液細胞增殖檢測試劑(購自promega公司)，37°C，5% CO2 中培養(yǎng)4h，讀取樣品0D490nm吸收值。結果表明，pVAXl_Cyp26al DNA疫苗在BALB/c小鼠體內誘導產生了抗原特異性的細胞免疫應答。(2)自然殺傷(NK)細胞活性檢測實驗組、對照組1及對照組2的未作致敏處理的淋巴細胞單細胞懸液作為NK細胞活性檢測的效應細胞(Effector cells)，用含50 μ M 2-ΜΕ的1640-5% FBS培養(yǎng)液調整濃度至2Χ IO6細胞/mL，JEG-3細胞作為目標細胞(Target cells)。50 μ L的JEG-3細胞與50yL的脾臟淋巴細胞在37°C，5% CO2中作用18h，設50 1、25 1到12. 5 1的 Effector Target (Ε Τ)比例。同樣地，再加入CellTiter 96 Aqueous單溶液細胞增殖檢測試劑培養(yǎng)4h后，讀取樣品0D490nm吸收值。檢測結果表明，pVAXl-Cyp26al DNA疫苗免疫后機體能產生細胞免疫作用，即NK細胞活性具有特異性殺傷活性作用。
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實施例7 :pYAXl-Cyp26al DNA疫苗離體抗腫瘤實驗本實施例為使用實施例1所構建的pVAXl-Cyp26al DNA疫苗，采用TUNEL實驗，進行離體抗腫瘤實驗。在pVAXl-Cyp26alDNA疫苗免疫小鼠后第5周取T淋巴細胞，以及免疫血清進行的體外抗腫瘤實驗，結果發(fā)現(xiàn)pVAXl-Cyp26al DNA疫苗免疫小鼠的T淋巴細胞能夠在體外攻擊人乳腺癌細胞MDA-MB-231、人乳腺癌細胞MCF7細胞(購自北京協(xié)和醫(yī)科大學基礎所細胞中心)發(fā)生細胞凋亡；同時免疫小鼠的血清也能夠作用MDA-MB-231和MCF7，誘導 MDA-MB-231和MCF7細胞發(fā)生細胞凋亡。由此可見，pVAXl-Cyp26al DNA疫苗不僅能夠激發(fā)小鼠產生相應的體液免疫和細胞免疫反應，而且激發(fā)的這兩種類型的免疫應答均能夠作用于人乳腺癌細胞MDA-MB-231 和MCF7，誘導其發(fā)生細胞凋亡，即有殺死腫瘤細胞的作用。實施例8 :pYAXl-Cyp26al DNA疫苗體內抗腫瘤實驗本實施例為使用實施例1所構建的pVAXl-Cyp26al DNA疫苗，對BALB/C小鼠進行體內抗腫瘤實驗。(1)體內抗腫瘤實驗-I購自北京維通利華實驗動物技術有限公司雌性BALB/C小鼠80只，動物飼養(yǎng)于人工控制的條件下，飼養(yǎng)溫度在25°C左右，12h: 12h光照周期，自由采食、飲水。80只隨機分為 4組，每組20只，免疫質粒前24h注射100 μ L免疫佐劑0. 25%普魯卡因，注射前酒精局部消毒，接種部位腿部肌肉三點注射。第1組不接種任何物質，3周后注射表達Cyp26al蛋白的4T1小鼠乳腺癌細胞， 即實施例2所建立的“人Cyp26al依賴性乳腺癌模型”。第2組接種100 μ 1生理鹽水，3周后注射表達Cyp26al蛋白的4T1小鼠乳腺癌細胞。第3組接種100 μ 1 ρVAXl空質粒，3周后注射表達Cyp26al蛋白的4T1小鼠乳腺癌細胞第4組接種ΙΟΟμΙ pVAXl_Cyp26alDNA疫苗，3周后注射表達Cyp26al蛋白的4Τ1 小鼠乳腺癌細胞。10天后檢查小鼠腫瘤生長情況。觀察結果如下第1組、第2組、第3組10天后檢查，60只小鼠均有腫瘤塊，其大小為7-11mm3。20天后檢查，60只小鼠，58只有腫瘤塊，其大小為15_18mm3，其中2只小鼠死亡， 其它鼠毛松疏呈病態(tài)。30天后檢查，58只小鼠，39只有腫瘤塊，其大小17_26mm3，其中19只小鼠死亡，其它鼠毛松疏呈病態(tài)50天后檢查，39只小鼠，2只有腫瘤塊，其大小為25_38mm3，其中37只小鼠全部死亡。上述死亡小鼠肺部均發(fā)現(xiàn)轉移腫瘤塊。第4組
10天后檢查，20只小鼠，5只有腫瘤塊，其大小為3_6mm3。20天后檢查，20只小鼠，8只有腫瘤塊，其大小為4_10mm3，其它12只小鼠均健康。30天后檢查，20只小鼠，9只有腫瘤塊，其大小為ll_24mm3，其中4只小鼠死亡。50天后檢查，16只小鼠，6只有腫瘤塊，其大小為12_28mm3，其它10只小鼠仍健康。上述死亡小鼠肺部均發(fā)現(xiàn)轉移腫瘤塊。與作為對照的第1、2和3組相比較，第4組接種pVAXl-Cyp26al DNA疫苗具有明顯的抗Cyp26al依賴型乳腺癌作用(ρ < 0. 01)，具有臨床應用價值。(2)體內抗腫瘤實驗-II購自北京維通利華實驗動物技術有限公司雌性BALB/C小鼠60只，動物飼養(yǎng)于人工控制的條件下，飼養(yǎng)溫度在25°C左右，12h: 12h光照周期，自由采食、飲水。60只隨機分為 4組，每組15只，免疫質粒前24h注射100 μ L免疫佐劑0. 25%普魯卡因，注射前酒精局部消毒，接種部位腿部肌肉三點注射。第1組不接種任何物質，3周后注射表達Cyp26al蛋白的4T1小鼠乳腺癌細胞。第2組接種100 μ 1生理鹽水，3周后注射表達Cyp26al蛋白的4T1小鼠乳腺癌細胞。第3組接種100 μ 1 ρVAXl空質粒，3周后注射表達Cyp26al蛋白的4T1小鼠乳腺癌細胞第4組接種ΙΟΟμΙ pVAXl_Cyp26alDNA疫苗，3周后注射表達Cyp26al蛋白的4Τ1 小鼠乳腺癌細胞。10天后檢查小鼠腫瘤生長情況。觀察結果如下第1組、第2組、第3組10天后檢查，45只小鼠，均發(fā)現(xiàn)腫瘤塊，其大小為6. 5_13mm3。20天后檢查，45只小鼠，41只有腫瘤塊，其大小為14_18mm3，其中4只小鼠死亡， 其它鼠毛松疏呈病態(tài)。30天后檢查，41只小鼠，24只有腫瘤塊，其大小為19_28mm3，其中17只小鼠死亡， 其它鼠毛松疏呈病態(tài)。50天后檢查，24只小鼠，3只有腫瘤塊，其大小為27-36mm3，其中21只小鼠死亡。上述死亡小鼠肺部均發(fā)現(xiàn)轉移腫瘤塊。第4組10天后檢查，15只小鼠，3只有腫瘤塊，其大小4_7mm3。20天后檢查，15只小鼠，5只有腫瘤塊，其大小為6-14mm3，其它10只小鼠均健康。30天后檢查，15只小鼠，3只有腫瘤塊，其大小為9-26mm3，其中3只小鼠死亡。50天后檢查，12只小鼠，4只有腫瘤塊，其大小為15-33mm3，其中1只小鼠死亡，其它7只小鼠仍健康。上述死亡小鼠肺部均發(fā)現(xiàn)轉移腫瘤塊重復體內抗腫瘤實施例，結果與實施例-I相類似，表明pVAXl-Cyp26al DNA疫苗具抗Cyp26al依賴型乳腺癌作用穩(wěn)定、可靠。實施例10 :pVAXl-Cyp26al DNA疫苗的安全性評估
本實施例評估實施例1所構建的pVAXl-Cyp26al基因疫苗對免疫動物的安全性， 具體操作如下檢測不同劑量(20μ g-300 μ g)pVAXl_Cyp26al DNA 疫苗免疫 45 只 BALB/C 小鼠， 180天后無一只死亡；進行不同劑量pVAXl-Cyp26al DNA疫苗注射動物后的毒理性和常規(guī)生理指標的觀察測定，利用組織化學方法，(具體方法參見《實用免疫細胞化學與核酸分子雜交技術》蔡文琴、王伯沄主編，四川科學技術出版社，1994)確定注射疫苗后動物組織病理變化對腦、心、肝臟、脾臟、肺、腎、子宮和肌肉組織等相應組織器官進行冰凍切片，在顯微鏡(Nikon 80i Microscope System ；冷CCD SPOT，日本Nikon)下觀察，沒有發(fā)現(xiàn)動物組織有病理變化。
序列表
<110>中國科學院動物研究所
<120>抗腫瘤重組質粒、基因疫苗及其制備方法和用途
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<212>DNA
<213>SD 大鼠 Cyp26alcDNA <400>1
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1.一種用于哺乳動物抗腫瘤基因疫苗的重組質粒，其由Cyp26al基因的cDNA片段和真核表達載體組成，真核表達載體優(yōu)選為PVAX1。
2.根據(jù)權利要求1所述的重組質粒，其特征在于，所述Cyp26al基因的cDNA片段源自 Spreqne-Dawley大鼠子宮，其堿基序列優(yōu)選如SEQ IDNO. 1所示。
3.包含權利要求1或2所述重組質粒的菌株；優(yōu)選地，所述菌株選自大腸桿菌ToplOF’ 菌株。
4.包含權利要求1或2所述重組質粒的細胞；優(yōu)選地，所述細胞選自人宮頸癌細胞和人絨癌細胞。
5.一種哺乳動物抗腫瘤基因疫苗，其中包含權利要求1或2所述的重組質粒。
6.根據(jù)權利要求5所述的基因疫苗，其特征在于，所述疫苗還包含佐劑；優(yōu)選地，所述佐劑選自百分比濃度為0. 25%的普魯卡因。
7.一種制備權利要求1或2所述重組質粒的方法，其特征在于，該方法采用如SEQ ID NO. 2和SEQ ID而.3所示的堿基序列作為引物克隆所述07 26&1基因的(^嫩片段；優(yōu)選地，該方法采用溫度降落逆轉錄-聚合酶鏈式擴增方法克隆所述Cyp26al基因的cDNA片段。
8.一種制備Cyp26al依賴性乳腺癌動物模型的方法，其是通過使用包含人源Cyp26al 基因的cDNA片段的4T1小鼠乳腺癌細胞注射動物乳腺部位制備的；優(yōu)選地，該方法采用如 SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示的堿基序列作為引物克隆所述人源Cyp26al基因的cDNA 片段；更優(yōu)選地，所述動物為小鼠。
9.權利要求1或2所述的重組質粒在制備哺乳動物抗腫瘤基因疫苗中的用途；優(yōu)選地，所述哺乳動物選自人，所述腫瘤選自乳腺癌。
10.權利要求5或6所述的基因疫苗在制備預防和/或治療哺乳動物腫瘤的藥物中的用途；優(yōu)選地，所述哺乳動物選自人，所述腫瘤選自乳腺癌。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗腫瘤重組質粒、基因疫苗及其用途。該重組質粒由Cyp26a1基因cDNA片段和真核表達載體pVAX1組成，其堿基序列如SEQ ID NO.1所示其是通過提取并純化大鼠妊娠子宮總RNA，設計特異性引物，采用溫度降落逆轉錄-聚合酶鏈式擴增方法克隆擴增大鼠子宮Cyp26a1基因cDNA片段，并將其重組到真核表達質粒中而構建的。所制備的基因疫苗可用于制備預防和/或治療哺乳動物乳腺癌的藥物，具有安全、長效、穩(wěn)定、操作便捷的優(yōu)點，能同時高效激發(fā)體液免疫和細胞免疫，比其它免疫手段免疫效力更強，所需的免疫量較小，具有有效抑制腫瘤生長和遷移的作用。
文檔編號A01K67/027GK102191271SQ20101012920
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月18日 優(yōu)先權日2010年3月18日
發(fā)明者劉震坤, 夏紅飛, 孫敬, 彭景楩, 楊穎 , 熊高風, 王榮春 申請人:中國科學院動物研究所