專利名稱：一種美國白蠟組織培養(yǎng)快速繁殖增殖培養(yǎng)基及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及林木組織培養(yǎng)，具體地說是一種美國白蠟組織培養(yǎng)快速繁殖增殖培養(yǎng)基及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
美國白蠟(Fraxinus americana)又名白涔，木犀科落葉喬木，原產(chǎn)北美。美國白蠟?zāi)秃?、耐寒、耐澇、耐鹽堿，是沿海濕地造林的優(yōu)良樹種。它生長快，綠化效果好，生態(tài)效益高，且材質(zhì)優(yōu)良，質(zhì)地堅硬，紋理通直，結(jié)構(gòu)細(xì)勻，耐腐力強(qiáng)，富有彈性和光澤，易加工，素有 “水曲柳”之美稱(文獻(xiàn)1.董必慧，蘇國興.美國白蠟樹的生物學(xué)特性及經(jīng)濟(jì)用途。江蘇林業(yè)科技，2003，30，(1) :32-34)。白蠟長期以來以種子繁殖為主，由于其幼齡期長，且具明顯的結(jié)實(shí)間隔期，嚴(yán)重影響種子的生產(chǎn)與繁殖。因此，無性繁殖和生物技術(shù)在白蠟上的應(yīng)用有很大潛力。同時，對那些經(jīng)選擇、品種改良和遺傳操作的個體，進(jìn)行無性繁殖可加速白蠟的良種繁育進(jìn)程(文獻(xiàn)2.孔冬梅，譚燕雙，沈海龍.白蠟樹屬植物的組織培養(yǎng)和植株再生.植物生理學(xué)通訊，2003，39 (6) :677-680)。不同樹種、不同外植體培養(yǎng)所要求的基本培養(yǎng)基均有差異，適宜的培養(yǎng)基，能有效的提高增殖系數(shù)(文獻(xiàn)3.張彥妮.復(fù)葉槭組織培養(yǎng)再生體系建立及其遺傳轉(zhuǎn)化初步研究.中國博士學(xué)位論文，2005,05:1-99)。在培養(yǎng)基的各種成分之中，植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對于組織培養(yǎng)中的器官形成，起著重要而明顯的調(diào)節(jié)作用(文獻(xiàn)4.王慧梅.喜樹組織培養(yǎng)與遺傳轉(zhuǎn)化的研究.中國博士學(xué)位論文，2004,06:1-91)。大葉白蠟小苗在MS+6-BA 0.2+KT 0. 8+IBA 0. 2培養(yǎng)基上增殖率為2. 5 (文獻(xiàn)6.洪源范，沈雨佳，洪青，李順鵬。大葉白蠟的離體培養(yǎng)與快速繁殖.植物生理學(xué)通訊，2006，42 (6) 1139)； 絨毛白蠟以莖段為外植體，在MS+BA4. 0 6. 0mg/L+NAA2. Omg/L培養(yǎng)基上，平均增殖系數(shù)為3.59(文獻(xiàn)6.王磊，李淑娟，徐云剛。詹亞光絨毛白蠟成熟胚和莖段培養(yǎng)繁殖體系的建立.林業(yè)科技，2008，33 (3) 1-3) 0而利用本發(fā)明的培養(yǎng)基，美國白蠟擴(kuò)繁增殖系數(shù)達(dá)到了 6-7。因此，研究美國白蠟組培快繁增殖培養(yǎng)基，為今后美國白蠟的工廠化生產(chǎn)提供了可行方案，對這一樹種的開發(fā)和推廣具有重大的意義。組織培養(yǎng)是用植物的一部分組織或器官在無菌的人工培養(yǎng)基上進(jìn)行離體培養(yǎng)，以獲得完整植株的無性繁殖方法。由于培養(yǎng)物是脫離植物母體在試管中培養(yǎng)的，所以也稱離體培養(yǎng)。植物組織培養(yǎng)是20世紀(jì)之初以植物生理學(xué)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的一門新興技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)已在科研和生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用。該技術(shù)具有加速育種，縮短繁殖過程，改良品質(zhì)，節(jié)省空間，減少勞動，周年實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)，不受自然條件限制等特點(diǎn)，且組培苗的體積小，便于攜帶和資源交流。目前，離體快繁和工廠化是在林業(yè)中應(yīng)用最為廣泛、發(fā)展最為成熟的現(xiàn)代生物技術(shù)，在提高林木產(chǎn)量和質(zhì)量方面產(chǎn)生了重要的作用，帶來了巨大經(jīng)濟(jì)效益、社會效益和生態(tài)效益。培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要組成部分，是組培苗生長發(fā)育的依托。因植物生長發(fā)育所需的養(yǎng)分不同，所以不同品種的植物需要不同種類的培養(yǎng)基，只有選擇出最適宜的培養(yǎng)基，才能最大程度的獲得再生植株，有效的提高增殖系數(shù)。
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植物生長調(diào)節(jié)劑是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì)，雖然量極少，但在植物組織培養(yǎng)中起著十分重要和明顯的調(diào)控作用。常用于組織培養(yǎng)的植物生長調(diào)節(jié)劑有兩大類即細(xì)胞分裂素類和生長素類。細(xì)胞分裂素類的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的分裂和擴(kuò)大，使莖增粗，誘導(dǎo)芽的分化；生長素類主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的伸長生長，促進(jìn)生根。在植物組織培養(yǎng)中，常用的植物細(xì)胞分裂素有調(diào)吡脲(CPPU)、6_芐氨基嘌呤(6-BA)、激動素(KT)和玉米素(ZT)，常用的植物生長素有萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)和2，4_ 二氯苯氧乙酸Q，4_D)。不同種類的植物生長調(diào)節(jié)劑作用機(jī)理不同，植物細(xì)胞分裂素的分裂能力、植物生長素促進(jìn)細(xì)胞伸長的能力有強(qiáng)弱，為了獲得較高的增殖系數(shù)，需要篩選適宜種類和濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑。碳源是植物組織培養(yǎng)不可缺少的物質(zhì)，它不僅能夠給外植體提供能量，而且也能維持一定的滲透壓，糖類的濃度大小不僅影響增殖速率，而且還影響增殖芽的質(zhì)量。常用的碳源有果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、山梨醇等，其中蔗糖最常用，蔗糖能支持絕大多數(shù)植物離體培養(yǎng)物的旺盛生長，一直被作為植物組織培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)碳源而廣泛應(yīng)用。近來，許多研究表明蔗糖并不一定是最佳碳源，不同植物對不同糖類的反應(yīng)不完全相同，有必要探索替代碳源，以提高增殖效率和節(jié)約生產(chǎn)成本。調(diào)吡脲(CPPU)白色晶體，難溶于水，溶于乙醇、甲醇、丙酮等有機(jī)溶液，常溫下貯存穩(wěn)定，低毒。調(diào)吡脲是一種具有細(xì)胞分裂素活性的苯脲類植物生長調(diào)節(jié)劑，其生物活性卻較6-芐氨基嘌呤(6-BA)高10 100倍，能加速細(xì)胞有絲分裂、促進(jìn)植物生長，廣泛用于農(nóng)、 林業(yè)。萘乙酸(NAA)又稱a_萘乙酸，純品為白色無味晶體，易溶于丙酮、乙醚、苯、乙醇和氯仿等有機(jī)溶劑，低毒，配制時可先用少量酒精溶解，再加水稀釋。萘乙酸是廣譜型植物生長調(diào)節(jié)劑，能促進(jìn)細(xì)胞伸長，促進(jìn)植物生根。吲哚丁酸(IBA)又名3-吲哚丁酸，純品為白色至淡黃色結(jié)晶固體。主要用途促進(jìn)植物主根生長，提高發(fā)芽率，成活率。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有白蠟屬樹組織培養(yǎng)增殖速率低，增殖轉(zhuǎn)接周期長，瓊脂、蔗糖消耗量大，培養(yǎng)基成本高，不利于大規(guī)模工廠化生產(chǎn)的需要，本發(fā)明的目的是提供一種適宜美國白蠟成熟種胚誘導(dǎo)無菌苗莖段組織培養(yǎng)快速增殖培養(yǎng)基及其應(yīng)用，使白蠟屬樹組織培養(yǎng)增殖速率快，增殖轉(zhuǎn)接周期縮短，瓊脂消耗量小，培養(yǎng)基成本降低，以利于大規(guī)模工廠化生產(chǎn)的需要。以美國白蠟成熟種胚誘導(dǎo)的無菌苗單芽莖段為材料，接種于增殖培養(yǎng)基中。美國白蠟組織培養(yǎng)快速增殖培養(yǎng)基組成為其是以MS或WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，于基本培養(yǎng)基中添加生長催進(jìn)物，于基本培養(yǎng)基中添加各物至終濃度為調(diào)吡脲0. 05 0. 5mg · L—1、萘乙酸或吲哚丁酸0. 1 0. 5mg · Γ1、白沙糖20 40g · Γ1，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基ρΗ值至5. 8 5. 9。所述增殖培養(yǎng)基是以MS或WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基調(diào)配的處于固態(tài)和液態(tài)之間的一種二相固化培養(yǎng)基，即于基本培養(yǎng)基中還添加有終濃度為3. 0 4. Og · Γ1瓊脂粉。所述的調(diào)吡脲濃度為0. 1 0. 3mg · 所述的萘乙酸或吲哚丁酸濃度為0. 1 0. 3mg · ΙΛ所述的白沙糖濃度為25 35g · L—1。
其中MS培養(yǎng)基添加調(diào)吡脲0. 15mg · L—1、萘乙酸或吲哚丁酸0. 2mg · L—1和白沙糖 30g · L-1效果最佳。所述增殖培養(yǎng)基可用作為美國白蠟種胚誘導(dǎo)無菌苗莖段快速增殖的增殖培養(yǎng)基。美國白蠟組織培養(yǎng)快速繁殖過程為以美國白蠟成熟飽滿種子為外植體，剝除種殼，清水沖洗2 池后，依次在超凈工作臺(即無菌工作臺)上用體積濃度68-72%酒精浸潤30-50s，無菌水沖洗2 3次，質(zhì)量濃度0. 09 0. 11%升汞(HgCl2)消毒6 lOmin，無菌水沖洗3 4次，切取種胚，接種于MS或WPM培養(yǎng)基中，當(dāng)苗高3 4cm高時，切取無菌苗單芽莖段，接種于權(quán)利要求1所述的增殖培養(yǎng)基中。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、節(jié)約生產(chǎn)成本。二相固化培養(yǎng)基所用的瓊脂量約是固體培養(yǎng)基的一半，白沙糖價格是國產(chǎn)蔗糖的16%左右。瓊脂和蔗糖約占培養(yǎng)基成本的95%，因此，利用發(fā)明的二相固化培養(yǎng)基進(jìn)行美國白蠟組織培養(yǎng)快速繁殖可大大節(jié)約培養(yǎng)基生產(chǎn)成本。2、增殖系數(shù)高。以往白蠟屬樹組織培養(yǎng)增殖系數(shù)在3左右，利用發(fā)明的培養(yǎng)基增殖系數(shù)在6 7，增殖速率提高了 2倍。3、轉(zhuǎn)接周期短。二相固化培養(yǎng)基與培養(yǎng)物接觸更為緊密，有利于培養(yǎng)苗營養(yǎng)的吸收，且能夠有效的支撐住培養(yǎng)物，固體培養(yǎng)基增殖美國白蠟最佳周期在5 6周，利用發(fā)明的二相固化培養(yǎng)基增殖美國白蠟最佳周期為4周左右，轉(zhuǎn)接周期比固體培養(yǎng)減少25%以上，因此，增殖速度快。4、增殖后的芽體粗壯，增殖出的苗生長旺盛，4周后的平均芽長可達(dá)2. 1cm，莖葉生長整齊健壯。
具體實(shí)施例方式以美國白蠟成熟種胚為外植體，比較不同種類培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑，及植物調(diào)節(jié)劑濃度和白沙糖濃度對美國白蠟種胚誘導(dǎo)無菌苗單芽莖段增殖的影響，篩選出最佳的增殖培養(yǎng)基配方。MS培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)配方 WPM培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)配方
權(quán)利要求
1.一種美國白蠟組織培養(yǎng)快速繁殖增殖培養(yǎng)基，其特征在于其是以MS或WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，于基本培養(yǎng)基中添加生長催進(jìn)物，于基本培養(yǎng)基中添加各物至終濃度為調(diào)吡脲0. 05 0. 5mg化入萘乙酸或吲哚丁酸0. 1 0. 5mg .L-1、 白沙糖20 40g · L—1，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值至5. 8 5. 9。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增殖培養(yǎng)基，其特征在于所述增殖培養(yǎng)基是以MS或WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基調(diào)配的處于固態(tài)和液態(tài)之間的一種二相固化培養(yǎng)基，即于基本培養(yǎng)基中還添加有終濃度為3. 0 4. Og · Γ1瓊脂粉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增殖培養(yǎng)基，其特征在于所述的調(diào)吡脲濃度為0.1 0. 3mg · 所述的萘乙酸或吲哚丁酸濃度為0. 1 0. 3mg · L-1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增殖培養(yǎng)基，其特征在于所述的調(diào)吡脲濃度為0. 15mg · 所述的萘乙酸或吲哚丁酸濃度為0. 2mg · Γ1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增殖培養(yǎng)基，其特征在于所述的白沙糖濃度為30g · L—1。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的增殖培養(yǎng)基，其特征在于其中MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
7.—種權(quán)利要求1所述增殖培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特征在于所述增殖培養(yǎng)基可用作為美國白蠟種胚誘導(dǎo)無菌苗莖段快速增殖的增殖培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的增殖培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特征在于美國白蠟組織培養(yǎng)快速繁殖過程為以美國白蠟成熟飽滿種子為外植體，剝除種殼，清水沖洗2 池后，依次在超凈工作臺上用體積濃度68-72%酒精浸潤30 50s，無菌水沖洗2 3次，質(zhì)量濃度0. 09 0. 11%升汞(HgCl2)消毒6 lOmin，無菌水沖洗3 4次， 切取種胚，接種于MS或WPM培養(yǎng)基中，當(dāng)苗高3 4cm時，切取無菌苗單芽莖段，接種于權(quán)利要求1所述的增殖培養(yǎng)基中。
全文摘要
本發(fā)明涉及林木組織培養(yǎng)，具體地說是一種美國白蠟組織培養(yǎng)快速繁殖增殖培養(yǎng)基及其應(yīng)用，其是以MS或WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，于基本培養(yǎng)基中添加生長催進(jìn)物，于基本培養(yǎng)基中添加各物至終濃度為調(diào)吡脲(CPPU)0.05～0.5mg·L-1、萘乙酸(NAA)或吲哚丁酸(IBA)0.1～0.5mg·L-1、20～40g·L-1白沙糖，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值至5.8～5.9。本發(fā)明二相固化MS或WPM培養(yǎng)基添加植物生長調(diào)節(jié)劑調(diào)吡脲和萘乙酸或吲哚丁酸對美國白蠟種胚誘導(dǎo)無菌苗莖段增殖效果顯著。本發(fā)明提供了這種培養(yǎng)基在美國白蠟組織培養(yǎng)快速繁殖中的應(yīng)用，為今后美國白蠟的工廠化生產(chǎn)提供了可行方案。
文檔編號A01H4/00GK102197785SQ20101013128
公開日2011年9月28日 申請日期2010年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月24日
發(fā)明者葉景豐, 潘文利, 范俊崗, 陳罡, 韓友志, 顧宇書, 馬冬菁, 高軍, 魏忠平 申請人:遼寧省林業(yè)科學(xué)研究院