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Mitofilin基因敲除小鼠模型的制備方法及用途的制作方法

文檔序號:350343閱讀:529來源:國知局
專利名稱:Mitofilin基因敲除小鼠模型的制備方法及用途的制作方法
技術領域
本發(fā)明涉及Mitofilin基因敲除小鼠模型的制備方法及用途,具體地,本發(fā)明提供了一種Mitofilin雜合子小鼠的制備方法以及Mitofilin作為潛在的心臟保護因子在制備藥物中的用途。
背景技術
1.線粒體損傷與心肌細胞凋亡細胞凋亡又稱程序性細胞死亡,是細胞在自身基因調(diào)控下進行的一種主動死亡, 具有獨特的形態(tài)結構和生物化學特征,主要表現(xiàn)為細胞核染色質(zhì)固縮,凋亡小體出現(xiàn),梯形脫氧核糖核酸(DNA)電泳圖譜形成。研究證實,心肌細胞凋亡與原發(fā)性高血壓、心肌缺血再灌注損傷、血管成形術后再狹窄、心律失常、心肌病和心肌炎、心力衰竭、動脈粥樣硬化、 動脈瘤等多種心血管疾病有關。線粒體是細胞內(nèi)一種重要的細胞器,它具有復雜的亞微結構和功能轉換系統(tǒng),通過氧化磷酸化為細胞生命活動提供能量。生物體內(nèi)90%以上的ATP是由線粒體產(chǎn)生,因此線粒體被稱為細胞器的“動力工廠”。線粒體被兩層膜包繞,外膜通透性較高;內(nèi)膜有更嚴格的選擇性,它對離子、小分子物質(zhì)的通透性,在線粒體的結構與功能的維持中非常重要,它有利于維持內(nèi)膜兩側的電勢差,并在一定條件下形成跨膜質(zhì)子梯度,后者是氧化磷酸化的必要中間過程。線粒體占心肌細胞體積的45%,許多研究發(fā)現(xiàn),當心肌細胞發(fā)生凋亡時,出現(xiàn)線粒體結構與功能的改變。如Siarow等在動物試驗中發(fā)現(xiàn),心肌細胞凋亡主要發(fā)生在梗死心肌周圍,而離梗死心肌越近,線粒體損傷程度越重、數(shù)量越多。過氧化氫(H2O2)能夠誘導心肌細胞凋亡,Chen等在觀察H2A對培養(yǎng)心肌細胞凋亡的研究中發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)的心肌細胞中加入H2O2后,首先出現(xiàn)線粒體呼吸功能減弱,繼而出現(xiàn)一系列細胞凋亡的特征DN的降解,寡聚DNA梯形圖譜的形成。Cook等對其機制進行了研究,發(fā)現(xiàn)加入H2O2后15 30min內(nèi),細胞色素C即從線粒體釋放于胞漿中,15 30min后線粒體跨膜電位降低,這個過程約持續(xù) lh,此后線粒體跨膜電位發(fā)生不可逆性喪失,繼而出現(xiàn)心肌細胞凋亡與壞死。這均顯示,線粒體在心肌細胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。Okamura等對線粒體與心肌細胞凋亡及心肌壞死關系方面進行了研究。他結扎大鼠的前降支30min后再灌注模型,然后分成三組,分別加入YVAD (Caspase 1抑制劑)、 DEVD (Caspase 3抑制劑)及對照組,研究發(fā)現(xiàn),YVAD及DEVD均顯著減少心肌細胞凋亡,然而三組壞死心肌面積無差別。進一步研究顯示,Caspase抑制劑、線粒體保護劑、自由基清除劑及一些藥物均可減少心肌細胞凋亡,然而它們在縮小心肌壞死面積方面存有較大差異。 ^oita等認為,心肌細胞缺血時,一些促凋亡及促壞死信號均作用于線粒體這一共同通路而發(fā)揮作用。作用于線粒體后途徑,僅能抑制心肌細胞凋亡,不能抑制心肌細胞壞死途徑。這些研究表明,只有作用于線粒體前及線粒體水平的措施才能有效抑制心肌細胞凋亡,縮小壞死心肌面積。明確這一機制對指導臨床用藥也有重要意義,如血管緊張素轉換酶抑制劑(ACE I)能有效減少心肌梗死后壞死心肌面積,改善心衰癥狀。現(xiàn)在的研究表明, ACE I類藥物能夠促使心肌細胞線粒體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)數(shù)量增多、功能改善,細胞凋亡減少,說明ACE I類藥物可能通過線粒體水平而發(fā)揮抑制心肌細胞凋亡及壞死等積極作用。總之,線粒體在心肌細胞凋亡中起中心作用,決定心肌細胞走向凋亡還是壞死。線粒體在凋亡凋節(jié)中也十分重要,絕大多數(shù)蛋白質(zhì)通過線粒體起到調(diào)節(jié)作用。明確線粒體在細胞凋亡中起關鍵作用,對于我們進一步探討心臟疾病的發(fā)生及防治均有重要意義。2線粒體內(nèi)膜蛋白一 Mitofilin1994年,Icho T等從人心肌組織中得到一高表達蛋白,經(jīng)序列分析,他們預測在其 N端有一 GIPase功能域,這也揭示該蛋白可能是一動力蛋白。由于其在心肌里含量非常豐富,Icho T 稱之為人心肌蛋白(Human Heart Mucle Protein, HMP)。1996 年,Odgren PR 利用免疫雜交和cDNA文庫的篩選,得到HMP蛋白,但他們通過免疫電鏡發(fā)現(xiàn),該蛋白定位于線粒體內(nèi)膜,于是又重新命名為Mitofilin。2005年,John等人用RNA干擾的方法降低 Mitofilin表達,發(fā)現(xiàn)細胞增殖減慢并且凋亡增加。通過對細胞線粒體超微結構的檢測,發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)線粒體嵴結構異常,呈現(xiàn)同心圓結構,不能形成正常的管狀或片層嵴,同時伴隨著線粒體功能異常,包括ROS生成增加以及Δ Ψπι升高,認為Mitofilin是控制線粒體嵴結構蛋白。此外,該研究還利用Mitofilin-GFP融合蛋白將Mitofilin準確定位,確認其在線粒體內(nèi)膜上,并預測其前78個氨基酸是一個膜錨定結構域。Mitofilin在人類染色體上定位于2號染色體,由15個外顯子組成,其轉錄本大小為2. 91Λ,編碼的蛋白大小為88kD,各組織內(nèi)普遍都有表達。在需能高富含線粒體的組織,如心臟、腦、腎、肝臟、骨骼肌中表達尤為豐富。經(jīng)序列分析,Mitofilin在真核生物中高度保守,其N端的78個氨基酸殘基為膜錨定區(qū)域,在接近C-端的區(qū)域,Mitofilin有一 Coil-Coil結構域,但并未有明顯的功能域。在體內(nèi),Mitofilin的Coil-Coil結構域可能促使其形成一個約1200kD的復合物。2007年,Xie等通過免疫純化的方法,分析得到Mitofilin與SAM50、metaxinsl/2 和DnaJCll等6個線粒體蛋白可能存在相互作用。其中SAM50是線粒體上具有識別線粒體蛋白定位信號,并形成孔道,轉運線粒體蛋白入線粒體的蛋白,其余5個蛋白的功能還尚未明確。2008年,Lai等發(fā)現(xiàn)在大鼠腦創(chuàng)傷組織中,PARP活性升高,并會將一些線粒體蛋白快速多腺苷化,而Mitofilin就是其中之一,研究者推測這種修飾可能和線粒體功能異常相關。但這些研究對Mitofilin的功能并未有明確闡述??偟膩碚f,Mitofilin的確切功能還不甚明了,對其的研究尚處于初步階段。有必要通過建立完善的動物和細胞模型對其功能進行系統(tǒng)的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種Mitofilin基因敲除非人哺乳動物。本發(fā)明的另一個目的是提供Mitof i 1 in在制備用于心臟保護的藥物中的新用途在一個方面,本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生Mitofilin基因敲除非人哺乳動物的方法, 包括以下步驟a)復蘇并培養(yǎng)誘捕缺失Mitofilin基因的胚胎干細胞,胰酶消化成單個細胞后顯微注射到代孕動物的囊胚中。b)將步驟a)得到的囊胚移到代孕動物的子宮角,娩出小動物后,得到整合 Mitofilin突變細胞的嵌合體動物。c)整合到生殖系的動物與野生型動物交配后,得到的動物通過使用PCR和 Southern Blot篩選得到Mitofilin雜合子個體。Mitofilin雜合子間交配得到純合子個體。在另一個方面,本發(fā)明提供了一種Mitofilin基因敲除非人哺乳動物。優(yōu)選地,本發(fā)明所述的非人哺乳動物是小鼠。本發(fā)明人通過實驗證明,Mitofilin敲除小鼠純合子死于胚胎期7. 5-9. 5天。在一個特別的方面,本發(fā)明提供了 Mitofilin敲除雜合子小鼠。在另一個方面,本發(fā)明提供了 Mitofilin在制備用于心臟保護藥物中的用途。在一個具體實施方式
中,本發(fā)明提供了 Mitofilin在制備用于心臟保護藥物中的用途,其特征在于,用于制備維持線粒體氧化磷酸化復合物活性的藥物。在另一個具體實施方式
中,本發(fā)明提供了 Mitofilin在制備用于心臟保護藥物中的用途,其特征在于,用于制備維持線粒體ATP合成水平的藥物。在另外一個具體實施方式
中,本發(fā)明提供了 Mitofilin在制備用于心臟保護藥物中的用途,其特征在于,用于制備維持體內(nèi)ROS水平的藥物。在一個具體實施方式
中,本發(fā)明提供了 Mitofilin在制備用于心臟保護藥物中的用途,其特征在于,用于制備維持心肌線粒體結構的藥物。據(jù)此,本發(fā)明提供了一種Mitofilin基因敲除非人哺乳動物及其產(chǎn)生方法。并且, 由此本發(fā)明人揭示了 Mitofilin作為潛在的心臟保護因子在制備用于心臟保護藥物中的新用途。


圖l.Mitofilin雜合子小鼠的基因型分析。A.誘捕載體插入后的Immt基因座;B. Southern blot檢測Mitofilin雜合子小鼠;C. Western blot檢測心臟中的Mitofilin的表達水平。圖2. Mitofilin純合子胚胎的基因型及形態(tài)學觀察。A.打靶后Immt基因融合片段及野生型Immt基因的轉錄本;B. 7. 5天到9. 5天胚胎的形態(tài)學觀察;C. PCR對野生型、Mitofilin雜合子和Mitofilin純合子胚胎的檢測;D.野生型、Mitofilin雜合子和Mitofilin純合子胚胎中的immt基因和Lac Z基因的RT-PCR結果。 圖3.9. 5天胚胎的TUNEL染色結果。圖4.電鏡觀察野生型、Mitofilin雜合子和Mitofilin純合子胚胎的線粒體超微結構的觀察。圖5.組織化學酶學對Mitofilin純合子胚胎復合物II和復合物IV的檢測。圖6.組織化學酶學對Mitofilin雜合子小鼠心臟復合物I、復合物II和復合物 IV的檢測。圖7.線粒體氧化磷酸化復合物活性的體外檢測。圖8.實時定量PCR檢測mtDNA編碼的復合物。
A.復合物I亞基的表達水平的檢測;B.復合物III和復合物IV亞基表達水平的檢測。圖9. Mitofilin雜合子小鼠心臟的ATP水平的檢測。*p < 0. 05n = 10圖10. DHE染色對野生型和Mitofilin雜合子小鼠心臟組織ROS水平的檢測。圖11.野生型和Mitofilin雜合子小鼠心肌的病理檢測。A.野生型和Mitofilin雜合子小鼠的心肌的形態(tài)觀測;B. HE染色對野生型和 Mitofilin雜合子小鼠的心肌組織的檢測;C. Masson染色對野生型和Mitofilin雜合子小鼠的心肌組織的檢測。圖12. 16周的野生型和Mitofilin雜合子的心臟固定切片后電鏡觀察。
具體實施例方式實施例1. Miotifilin敲除鼠的建立本發(fā)明將Mitofilin突變的ES細胞系(英國Sanger研究所贈送)通過囊胚注射的方法注入到C57BL/6J小鼠囊胚中,移植胚胎到假孕鼠子宮,得到了 Mitofilin突變細胞整合到生殖系的嵌合體小鼠。該嵌合體與野生型小鼠交配后得到Mitofilin雜合子小鼠。 具體操作步驟如下a)分離培養(yǎng)小鼠的胚胎成纖維細胞,經(jīng)絲裂霉素C處理后用于培養(yǎng)ES細胞的滋養(yǎng)層;b)復蘇ES細胞于鋪有滋養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)皿培養(yǎng)后,注入到代孕小鼠的囊胚中;c)將注射過的囊胚置于加了 Brinster’ s BM0C-3培養(yǎng)液滴里培養(yǎng),做好標記,以備移植;d)將步驟(c)的囊胚移到假孕的代孕動物體內(nèi),得到整合Mitofilin突變細胞的嵌合體小鼠。整合到生殖系的小鼠與野生型小鼠交配后,得到的小鼠通過使用PCR和 Southern Blot篩選得到Mitofilin雜合子小鼠。實施例2. Mitofilin敲除小鼠純合子死于胚胎期7. 5-9. 5天本發(fā)明選用了 C57BL/6/12901a雜合背景和12901a背景的小鼠作為實驗用小鼠。 這兩種背景的Mitofilin雜合子小鼠均可正常出生,且符合孟德爾規(guī)律。Mitofilin雜合子小鼠和野生型小鼠相比,無明顯差異。Western Blot檢測Mitofilin雜合子小鼠的 Mitofilin的表達水平較野生型低,這和單倍體效率不足相符。我們對Mitofilin雜合子小鼠間交配產(chǎn)生的后代進行PCR、Souther Blot和flfestern Blot等方法進行檢測(圖2)。 在兩種背景的小鼠中,均沒有發(fā)現(xiàn)有存活的Mitofilin純合子小鼠出生。接著我們對其后代進行統(tǒng)計,野生型和雜合子所占的比例分別是1/3和2/3(表1)。這符合純合子胚胎致死后的孟德爾規(guī)律。表1.統(tǒng)計學分析Mitofilin雜合子小鼠間交配的后代
時期-I-+/-+/+合計新生N/A234112346E12.5N/A231033E10.5N/A432063
為了確定Mitofilin純合子小鼠胚胎死亡的確切時間,我們分離了 6. 5-12. 5天的胚胎。結合RT-PCR和PCR等基因型檢測手段,以及通過胚胎形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn),12. 5天的胚胎中沒有Mitofilin純合子胚胎的存在(表1);在7. 5和9. 5天的胚胎中,Mitofilin純合子純合子發(fā)育遲緩,個體比野生型和雜合子小鼠小。且隨著天數(shù)的增加個體差異更加明顯。我們對9. 5天的胚胎切片后進行TUNEL實驗,發(fā)現(xiàn)Mitofilin純合子胚胎胚體細胞大量死亡。9. 5天后,Mitofilin純合子胚胎死亡并逐漸被母體子宮吸收,具體結果如圖2和圖3所示。TUNEL的具體操作步驟如下1.石蠟切片脫蠟、補水固定后,蛋白酶K消化,每張切片上滴加IOOul蛋白酶K溶液(20ug/ul),室溫消化10分鐘。2. PBS清洗5分鐘,4%多聚甲醛再固定5分鐘,而后用PBS室溫清洗5分鐘。3.擦凈載玻片上多余的水分,在切片處滴加反應平衡液(Promega試劑盒提供)平衡后按配好的反應體系避光37°C濕盒內(nèi)反應1小時。4.反應結束后,用2X SSC溶液終止反應,用Hoechst染色5分鐘后封片。4°C避光保存以待觀察。5.熒光顯微鏡下以488nm的藍色激光激發(fā),可見FITC標記的細胞核為凋亡細胞的細胞核,而紫外光激光看到的則是Hoechst染色的細胞核。實施例3. Mitofilin純合子胚胎線粒體超微結構發(fā)生改變?nèi)?. 5天的Mitofilin雜合子小鼠交配的后代胚胎進行切片,通過透射電鏡觀察它們的線粒體超微結構。具體步驟如下1.取Mitofilinv-小鼠交配后的8. 5天胚胎,迅速放到預冷的2. 5%的新鮮配制的戊二醛溶液中(0. IM PBS pH 7. 4),在4°C條件下固定2小時后,磷酸緩沖液清洗3遍。2.用的鋨酸固定液固定1 2小時后,將樣品進行脫水、置換和浸透處理,然后將其包埋。3.將包埋板放入溫箱,于37°C、45°C、60°C分別放置M小時。4.修塊將包埋塊夾在特制的夾持器上,放在解剖顯微鏡下,用鋒利的刀片先削去表面的包埋劑,露出組織,然后在組織的四周以和水平面成45度的角度削去包埋劑,修成錐體形。5.將包好的組織塊制成500 μ m的半薄切片,甲苯胺蘭染色,光學顯微鏡下定位。 在超薄切片機上,將定位好的組織塊,制成60-70nm的超薄切片。粘在300目的銅網(wǎng)上。6.電子染色用鑷子夾住載網(wǎng)的邊緣,把貼有切片的一面朝下放到醋酸雙氧鈾-枸緣酸鉛染色液,使載網(wǎng)浮在液滴上,蓋上培養(yǎng)皿,染色10 20分鐘。7.透射電鏡觀察、拍片、記錄JEOL TEM-1010電子顯微鏡觀察,做好觀察記錄,選好范圍拍片,準確記錄底片號碼及相應內(nèi)容。電鏡結果表明(圖4)野生型和Mitofilin雜合子胚胎的線粒體大小均勻、結構正常、內(nèi)外膜正常分布以及內(nèi)膜內(nèi)陷形成的特化結構嵴有規(guī)則的排布。而Mitofilin純合子胚胎線粒體大小不一,雖然有外膜存在,但內(nèi)膜和嵴的排布紊亂;部分線粒體膨大,內(nèi)膜和嵴結構消失,電子密度降低。實施例4. Mitofilin純合子胚胎氧化磷酸化呼吸鏈功能失常Mitofilin純合子胚胎的線粒體結構明顯改變,尤其是內(nèi)膜和嵴的形態(tài)明顯異常;由于負責氧化磷酸化的復合物附著于內(nèi)膜上,內(nèi)膜結構的改變可能會引發(fā)氧化磷酸化復合物的功能的改變。因此,我們?nèi)?. 5天的胚胎進行冰凍切片后,進行組織酶學染色來鑒定復合物酶的活性。以四唑氮藍(NBT)和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)作為酶的底物。通過NBT和DAB 在組織上反應后顏色的深淺反映復合物的酶活性。經(jīng)鑒定,我們發(fā)現(xiàn)線粒體復合物IV細胞色素氧化酶(COX)的活性明顯下降,而復合物II琥珀酸脫氫酶(SDH)活性沒有明顯改變,復合物I NADH氧化脫氫酶有一定程度的下降。這是由于該酶在胞漿中也存在,不能真實反映線粒體內(nèi)的NADH氧化脫氫酶活性。具體結果如圖5所示。實施例5. Mitofilin雜合子小鼠氧化磷酸化復合物活性較野生型降低Mitofilin雜合子小鼠可正常出生,跟野生型相比無明顯差異。我們經(jīng)過行為學、 體重及飲食等多方面對新生的Mitofilin雜合子小鼠進行鑒定,沒有發(fā)現(xiàn)Mitofilin雜合子小鼠存在明顯的功能異常(結果未出示)。但Mitofilin雜合子小鼠存在單倍體效率不足,該蛋白在組織中的表達水平較野生型低(圖1C)。由于Mitofilin的表達降低,線粒體的基本功能可能在Mitofilin雜合子小鼠中會有一定的改變。因此,我們對6-8周的 Mitofilin雜合子小鼠的線粒體的氧化磷酸化水平進行了測定。取Mitofilin雜合子小鼠的心臟進行冰凍切片并進行酶組織染色,結果表明Mitofilin雜合子小鼠的線粒體復合物 IV的活性與野生型小鼠相比明顯降低,而復合物II的活性沒有變化(圖6);接著我們提取了小鼠肝臟組織的線粒體,進行體外酶學實驗,結果顯示復合物IV的活性明顯下降,而復合物II的活性沒有改變,這與組織酶學的結果一致。此外,在體外酶學實驗中,我們發(fā)現(xiàn)復合物I和復合物I/III的活性也有一定的下降(圖7)。在線粒體復合物中,復合物I、III和IV都有必需亞基由線粒體DNA編碼并翻譯。 而復合物II的亞基則全部由核基因組DNA編碼。為此,我們推測Mitofilin的缺失可能影響了線粒體DNA(mtDNA)的拷貝數(shù)或轉錄,而使mtDNA編碼的復合物亞基的表達水平降低, 進而影響了復合物的正常組裝,最終使得氧化磷酸化水平降低甚至缺失。為此,提取了 Mitofilin雜合子小鼠心臟和肝臟組織的RNA,反轉錄后進行Real time PCR0具體步驟如下分離Mitofilin雜合子小鼠的心臟,加入Iml Trizal后勻漿破碎組織后,加入氯仿。劇烈搖動后12000轉離心15分鐘。將分層后的水相吸入一新的離心管中,加入等體積的異丙醇沉淀RNA,12000轉10分鐘。棄上清,加入75%乙醇,7500轉離心,棄上清后晾干沉淀。加入適當?shù)乃芙夂螅瑴y定RNA的濃度,通過逆轉錄酶進行逆轉錄反應。以逆轉錄反應后的產(chǎn)物為模板,選用線粒體復合物亞基的特異引物進行PCR反應。結果發(fā)現(xiàn)復合物I、IV的亞基表達降低,說明Mitofilin的缺失確實導致了 mtDNA 的表達降低;而復合物III的亞基cyto b的表達基本沒有變化(肝臟結果未出示),這可能是由于線粒體啟動子近端效應所致。線粒體DNA的近端效應表現(xiàn)為在線粒體DNA的轉錄過程中,距其越近的轉錄本,表達隨著啟動子活性的改變而明顯改變;距啟動子越遠,改變越小。因此,Mitofilin雜合子小鼠中距啟動子較近的復合物I和復合物IV的亞基所受到的影響較大,降低明顯;而Cyto b是其重鏈轉錄本上的最后一個編碼基因,受啟動子活性的影響最小,幾乎沒有改變。結果如圖8所示。實施例6. Mitofilin雜合子小鼠ATP供給較野生型減少線粒體最重要的功能就是產(chǎn)能以供給機體需求,故ATP的水平是線粒體功能的基本衡量標準。ATP生成的水平和細胞代謝狀態(tài)直接相關,線粒體功能失?;蜓趸姿峄钚越档投伎墒笰TP合成減少。在Mitofilin雜合子小鼠的線粒體中,氧化磷酸化復合物活性與野生型相比有一定降低,因此我們通過高壓液相(HPLC)法對Mitofilin雜合子小鼠ATP 的合成效率進行測定。結果(圖9)顯示,Mitofilin雜合子小鼠的心臟和腦組織的ATP供給較野生型減少。實施例7. Mitofilin雜合子小鼠體內(nèi)ROS水平增加Mitofilin雜合子小鼠的線粒體氧化磷酸化水平較野生型降低,而在氧化磷酸化過程中,ROS是其副產(chǎn)物。一般情況下,當氧化磷酸化出現(xiàn)異常時,ROS在體內(nèi)的平衡狀態(tài)破壞,使其在體內(nèi)積累。為了驗證這一點,我們通過ROS原始物02_ ·的特異性探針DHE標記, 以檢測Mitofilin雜合子小鼠小鼠體內(nèi)的ROS水平。具體步驟如下斷頸處死小鼠并分離其心臟組織進行冰凍切片。用ROS特異性探針DHE溶液覆蓋心臟切片,室溫孵育10分鐘。用PBS清洗3遍后于熒光顯微鏡下觀察。結果(圖10)顯示,Mitofilin雜合子小鼠的心臟的ROS水平較野生型升高。實施例8. Mitofilin雜合子小鼠的心臟呈現(xiàn)病理性變化ROS在細胞中的異常累積以及線粒體氧化磷酸化功能的降低會導致細胞產(chǎn)生病理性變化而導致細胞死亡。鑒于此,我們對16周的野生型和Mitofilin雜合子小鼠的心臟進行檢測。我們對它們的心臟進行形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn),雜合子心臟較野生型的體積明顯增加,對這些心臟固定并石蠟切片后HE和Masson染色,具體步驟如下1.組織經(jīng)固定、脫水、浸蠟和包埋后切片。
2.然后再經(jīng)脫蠟和補水后蘇木素溶液或馬蘇染液染色約5 15min。
3.自來水洗去多余染料。
4.加入稀釋的鹽酸酒精溶液中分色,邊分色邊鏡檢,至核呈紅紫色,細胞質(zhì)無色。
5.分色后用自來水堿化返蘭。
6.再經(jīng)伊紅染液染色,以95%酒精對伊紅分色,至胞漿,結締組織等呈桃紅色。
7.染色后的切片,浸入從70 %到100 %遞升的乙醇溶液脫水。
8.浸入二甲苯透明劑,二次(各數(shù)分鐘),取出切片滴中性樹膠后加蓋玻片封固。
結果發(fā)現(xiàn)Mitofilin雜合子心臟的心肌排列松散,并有很多細胞壞死,而野生型
的心臟心肌細胞排列緊密有序,并呈現(xiàn)正常的生理狀態(tài)。實施例9. Mitofilin雜合子小鼠心肌的線粒體超微結構異常改變接著我們對16周的野生型和Mitofilin雜合子的心臟固定切片后電鏡觀察。電鏡結果表明(圖12)野生型的心肌線粒體大小均勻、結構正常、內(nèi)外膜正常分布以及內(nèi)膜內(nèi)陷形成的特化結構嵴有規(guī)則的排布。而Mitofilin雜合子小鼠的心肌體大小不一,雖然有外膜存在,但內(nèi)膜和嵴的排布紊亂;部分線粒體膨大,內(nèi)膜和嵴結構消失,電子密度降低。
權利要求
1.一種產(chǎn)生Mitofilin基因敲除非人哺乳動物的方法,包括以下步驟a)復蘇并培養(yǎng)誘捕缺失Mitofilin基因的胚胎干細胞,胰酶消化成單個細胞后顯微注射到代孕動物的囊胚中;b)將步驟a)得到的囊胚移到代孕動物的子宮角,娩出小動物后,得到整合Mitofilin 突變細胞的嵌合體動物;c)整合到生殖系的動物與野生型動物交配后,得到的動物通過使用PCR和Southern Blot篩選得到Mitofilin雜合子個體;Mitofilin雜合子間交配得到純合子個體。
2.根據(jù)權利要求1所述的產(chǎn)生Mitofilin基因敲除非人哺乳動物的方法,其中所述的非人哺乳動物是小鼠。
3.根據(jù)權利要求2所述的產(chǎn)生Mitofilin基因敲除非人哺乳動物的方法,其中所述的小鼠為Mitofilin雜合子小鼠。
4.Mitofi 1 in在制備用于心臟保護藥物中的用途。
5.根據(jù)權利要求4所述的Mitofilin在制備用于心臟保護藥物中的用途,其特征在于, 用于制備維持線粒體氧化磷酸化復合物活性的藥物。
6.根據(jù)權利要求4所述的Mitofilin在制備用于心臟保護藥物中的用途,其特征在于, 用于制備維持線粒體ATP合成水平的藥物。
7.根據(jù)權利要求4所述的Mitofilin在制備用于心臟保護藥物中的用途,其特征在于, 用于制備維持體內(nèi)ROS水平的藥物。
8.根據(jù)權利要求4所述的Mitofilin在制備用于心臟保護藥物中的用途,其特征在于, 用于制備維持心肌線粒體結構的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及Mitofilin基因敲除小鼠模型的制備方法及用途,具體地,本發(fā)明提供了一種Mitofilin雜合子小鼠的制備方法以及Mitofilin作為潛在的心臟保護因子在制備藥物中的用途。
文檔編號A01K67/027GK102199572SQ20101013297
公開日2011年9月28日 申請日期2010年3月24日 優(yōu)先權日2010年3月24日
發(fā)明者劉德培, 孫立紅, 張媛, 楊瑞鋒, 梁植權, 陳厚早, 韋玉生 申請人:中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所
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